Калашникова В.А. Вирулентные характеристики Staphylococcus aureus, выделенных при пневмониях у обезьян, живущих в условиях неволи. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-03-04
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является важным оппортунистическим патогеном, одним из возбудителей опасных заболеваний человека и животных. Этот микроорганизм кодирует множество факторов вирулентности, необходимых для развития инфекций и защиты бактерий от иммунитета хозяина. S. aureus может быть основным из возбудителей заболеваний дыхательных путей (пневмоний, бронхопневмоний). В спонтанной патологии обезьян, живущих в условиях неволи, одно из ведущих мест занимает пневмония, которая регистрируется в качестве самостоятельной патологии или же часто развивается как сопутствующее вторичное заболевание. Доминирующее место в этиологической структуре пневмоний у обезьян занимают S. aureus.
Цель работы – выявление распространенности генов вирулентности и их комбинаций у S. aureus, изолированных у низших обезьян при пневмониях. Все изоляты были метициллинчувствительные, mecA-отрицательные. Установлена вариабельность набора молекулярных маркеров вирулентности и их комбинаций. Изученные метициллинчувствительные S. aureus относились к четырем agr-группам, однако преобладала agr IV (56,4%). Исследование не выявило четкой зависимости между видом обезьян и принадлежностью S. aureus к какой-либо группе регуляторного гена. Детекция генов гемолизинов, адгезинов и энтеротоксинов показала, что большинство изолятов содержало ген sec (53,2%), гены sea и seb встречались почти в 2 раза реже (22,4 и 27,7 % соответственно), ген tsst выявлен в 8,5%. С высокой частотой обнаруживался ген pvl (48,9%). Более 70% S. aureus содержали гены фибронектинсвязывающих белков (fnBpA и fnBpB). Адгезины clfA и clfB встречались в 90% изученных культур золотистых стафилококков. Отмечено наличие генов гемолизинов α и β (hla и hlb) в 84,1 и 78,7% соответственно. S. aureus содержали в своем геноме несколько генов-маркеров вирулентности в различных комбинациях. Наиболее распространенным сочетанием было одновременное присутствие генов hla-hlb-clfA/B, обнаруженное в 44,7%. Результаты исследования подтвердили наличие вариабельности в наборе генетических детерминант, характеризующих высокий патогенный потенциал изолятов S. aureus, выделенных из легких обезьян при пневмониях.
Staphylococcus aureus является важным зоонозным патогеном, поражающим людей, домашних и диких животных. Он широко распространен в природе; как комменсал является естественным обитателем кожи человека, слизистой оболочки эпителия и шерсти животных. Тем не менее эти бактерии – условно-патогенные микроорганизмы, способные проникать в кровоток и внутренние ткани, становясь основной причиной различных инфекций как у людей, так и у животных (абсцесс, сепсис, фурункулез, патологическое отделяемое из поверхностных и хирургических ран, некротическая пневмония, инфекции мягких тканей и кожи и др.) [1–5]. S. aureus, инфицируя молочные железы у крупного и мелкого рогатого скота, приводит к маститу [6–8]. Несмотря на то, что S. aureus колонизирует область носоглотки здоровых людей и животных, он может стать основным фактором риска для последующего развития внутрибольничных инфекций, в том числе пневмоний. Стафилококковая пневмония является распространенным заболеванием и приводит к высокой смертности [3].
S. aureus, для того чтобы вызвать инфекцию, располагает широким спектром факторов вирулентности, играющих важную роль для патогенеза заболевания, диагностики возбудителя и являющихся одними из причин сложного лечения стафилококковых инфекций. Диапазон факторов вирулентности у S. aureus обширен и включает более 40 белков, наличие которых может варьировать в зависимости от клинических изолятов [3, 9, 10]. К ним относятся стафилококковые энтеротоксины суперантигены (SEs), вызывающие острые пищевые отравления (энтеротоксины А, В, С); токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1), который ассоциируется с рядом острых или хронических заболеваний человека. Группу молекулярных маркеров, детерминирующих синтез энтеротоксинов (sea, seb, sec) и токсина синдрома токсического шока (tsst), иначе называют «пирогенные токсины суперантигены» (PTAg) [1, 9]. S. aureus также продуцирует различные гемолизины, особенно hla (α-гемолизин), который считается одним из основных факторов патогенности этого микроорганизма и представляет собой порообразующий цитотоксин, необходимый для патогенеза пневмонии [1]. Лейкоцидин Пантон–Валентайна (lukS/F-PVL) вызывает разрушение лейкоцитов, некроз тканей и часто связан с развитием некротизирующей пневмонии [4, 9]. Первоначальное прикрепление S. aureus к эпителиальным клеткам зависит от взаимодействия поверхностных белков бактерий семейства адгезинов, которые называются микробными поверхностными компонентами, распознающими молекулы адгезивного матрикса (MSCRAMM) с белками фибриногена и фибронектина. К ним относятся факторы слипания A и B (ClfA и ClfB) и фибронектинсвязывающие белки A и B (FnBpA и FnBpB). Кроме того, эти белки также участвуют в уклонении от иммунного ответа хозяина, который может быть направлен против S. aureus [1, 6]. Продукция многочисленных факторов вирулентности, а также образование биопленки регулируется сенсорной системой кворума, служащей глобальным регулятором, и называется регулятором вспомогательных генов (agr). Локус agr варьирует между штаммами S. aureus и может быть разделен на четыре группы (agr I, II, III и IV) с различной степенью вирулентности [4, 11, 12].
С 1960-х годов золотистый стафилококк стал приобретать устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда, что становится большой проблемой в лечении заболеваний стафилококковой природы [9]. Резистентность к β-лактамным антибиотикам определяется геном mecA, который кодирует пенициллинсвязывающий белок ПСБ-2а. По утверждению K.-T. Lim и соавт. потенциальным резервуаром для метициллинустойчивых штаммов S. aureus (MRSA) являются метициллинчувствительные штаммы (MSSA) [13].
Большинство исследований, проведенных в разных странах, сосредоточено на изучении генетических характеристик клинических штаммов S. aureus, выделенных от людей при различных заболеваниях, а также при маститах у копытных животных или из пищевых продуктов [1, 2, 5, 8, 11–13]. В то же время в литературе имеется не так много сведений о молекулярных характеристиках S. aureus, обнаруженных у различных видов животных [5, 14, 15]. Так, в исследовании E. Drougka и соавт. [14], установлено, что среди штаммов S. aureus, колонизирующих животных зоопарка, выявлены различные генотипы, но при этом имела место колонизация человеческими штаммами. Аналогичные работы по изучению изолятов S. aureus, выделенных у низших обезьян, единичны [16]. Однако в зарубежной литературе, размещенной в базах данных NCBI PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) и ScienceDirect (https://www.sciencedirect.com), не удалось найти сведений по изучению генов вирулентности S. aureus, изолированных из легких обезьян при пневмониях. Проведение таких исследований очень важно, потому что обезьяны, составляющие наряду с человеком единый эволюционный отряд приматов, широко используются для экспериментального изучения важнейших проблем теоретической и практической медицины, поскольку чувствительны к большинству инфекционных агентов человека, вследствие чего на этих животных воспроизводится в сходной форме большинство инфекционных заболеваний людей. В последние годы в связи с резким сокращением популяций обезьян в местах естественного обитания и запретом отлова основным источником приматов стали питомники обезьян, осуществляющие их разведение. Единственный в России питомник обезьян находится в Сочи (Адлерский питомник в ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии»). В лабораториях института ведутся фундаментальные исследования по различным направлениям медико-биологических дисциплин, проводится постоянный мониторинг здоровья животных (бактериологические исследования клинически здоровых, больных и умерших обезьян). По данным патолого-анатомических исследований одно из ведущих мест в спонтанной патологии обезьян, живущих в условиях неволи, занимает пневмония. Она регистрируется в качестве самостоятельной патологии, а также часто развивается как сопутствующее вторичное заболевание. Исследования, проводимые ранее, позволили охарактеризовать этиологическую структуру бактериальных возбудителей пневмоний у обезьян и установить роль условно-патогенной микрофлоры в развитии инфекционного процесса, при этом ведущую позицию занимают S. aureus [17]. Молекулярно-генетическое исследование S. aureus, изолированных от обезьян в ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии», проводится с 2012 г. [18, 19].
Цель исследования – выявление распространенности генов вирулентности и их комбинаций у S. aureus, изолированных у низших обезьян при пневмониях.
Животные. В Адлерском питомнике на территории ФГБНУ «НИИ медицинской приматологии» содержится более 5000 обезьян различных видов. Животные размещены вольерах, групповых и индивидуальных клетках. При выявлении у обезьян отклонений от клинической нормы животных помещают в изоляторы, где проводится их лечение. В ряде случаев комплекс лечебных мероприятий не приводил к выздоровлению обезьян. В настоящей работе были отобраны изоляты S. aureus, выделенные из легких умерших обезьян 6 видов (табл. 1), причиной смерти которых на основании патоморфологического исследования являлась пневмония.
Забор материала для бактериологического исследования осуществляли во время патолого-анатомического исследования умерших обезьян, в связи с чем заседание биоэтической комиссии не проводилось.
Выделение и идентификация бактериальных изолятов. Для бактериологического исследования использовали фрагменты секционного материала (легкие) размером 2х2 см. Выделение и идентификацию выросших культур проводили общепринятыми лабораторными методами в соответствии с принятой методикой, описанной в предыдущих работах [17]. Изоляты S. aureus были получены в период с 2017 по 2019 г. и хранили при температуре -20°С.
Экстракция ДНК. Выделение тотальной ДНК стафилококков осуществляли из бактериальных суспензий, приготовленных из суточных агаровых культур S. aureus и суспендированных в 100 мкл изотонического раствора NaCl с использованием набора реактивов ДНК-сорб-В (ФБУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия) согласно рекомендации производителя.
ПЦР-детекция гена mecA. Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией осуществляли с использованием коммерческой тест-системы АмплиСенс MRSA-скрин-титр-FL (ФБУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия) на флюоресцентном детектирующем термоциклере Rotor-Gene Q (Германия) согласно инструкции производителя.
Детекция генов вирулентности. Для определения наличия генов вирулентности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, описанные в научных публикациях и синтезированные фирмой «Evrogen», Россия (табл. 2). Группы agr-комплекса и pvl-компоненты (lukS/F) анализировали с помощью мультиплексной ПЦР.
Амплификацию геномной ДНК проводили в объеме 25 мкл реакционной смеси, включающей 5 мкл амплификационной смеси ScreenMix («Evrogen», Россия), 5 мкл праймеров, 5 мкл деонизированной воды и 10 мкл ДНК. Реакция амплификации шла в автоматически программируемом термоциклере Терцик («ДНК-технология», Россия) по нескольким программам амплификации ДНК, разработанным с учетом свойств, участвующих в конкретной реакции праймеров (табл. 3).
Гель-электрофорез. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью гель-электрофореза в 1,2% агарозном геле, окрашенном раствором бромистого этидия, в градиенте напряжения 90 В. Размер ампликонов определяли, используя ДНК-руллер размером 100–1200 н. п. (ЗАО «Евроген», Россия).
Анализ результатов бактериологического и микроскопического исследований показал, что все изучаемые изоляты грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, дающие гемолиз на 5% кровяном агаре, способные коагулировать плазму крови кролика. По наличию вышеперечисленных фенотипических признаков вирулентности, а также биологических свойств выделенные изоляты стафилококков отнесены к виду S. aureus. Полученные данные на 100% совпали с результатами ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией, которая подтвердила вид стафилококка и показала отсутствие в геноме изучаемых изолятов гена mecA, т.е. все культуры отнесены к метициллинчувствительным (MSSA).
В результате проведенного agr-типирования 94 изолятов MSSA выявлено, что большинство из них (n=53) принадлежало к agr IV группы (56,4%). Второй по распространенности (n=33) была agr I (35,1%). Частота детекции остальных групп оказалась незначительной – аллели II и III были детектированы у 6 (6,4%) и 2 (2,1%) изолятов S. aureus (табл. 4).
Как видно из табл. 4, agr III группы выявлена только у двух S. aureus, выделенных от макак яванских. Agr II и agr III не определены ни у одного изолята золотистого стафилококка, изолированного от павианов гамадрилов. У S. aureus, выделенных от макак резусов и макак яванских, преобладает IV аллель регуляторного гена.
Проведенное исследование выявило следующий набор генов-маркеров вирулентности изолятов S. aureus (табл. 5).
Среди пирогенных токсинов суперантигенов (PTAg) у S. aureus, изолированных при пневмониях, ген, кодирующий токсин С (sec), выявлен у 53,2% исследованных изолятов. Гены, детерминирующие синтез токсинов A (sea) и B (seb), детектированы более чем у 20% S. aureus (соответственно 22,4 и 27,7%). С наименьшей частотой установлен ген tsst (8,5%). Частота выявления маркеров лейкоцидина Пантон–Валентайна (pvl) составила (48,9%). Гены адгезинов обнаружены в большем количестве: ген fnBpA у 66 (70,2%) изолятов, fnBpB у 73 (77,7%) изолятов. Как видно из табл. 5, выявлена значительная вариабельность в наборе генов, детерминирующих синтез токсинов, гемолизинов и адгезинов у S. aureus разных групп регуляторного гена. Среди исследованных 11 генов вирулентности факторы слипания A и B, гемолизины α и β определяются в значительном объеме. У изолятов, принадлежащих к agr I, чаще найден ген sea. С одинаковой частотой у S. aureus agr I и agr IV групп установлен ген sec.
Изученные изоляты содержали в своем геноме несколько генов-маркеров вирулентности в различных сочетаниях (см. рисунок).
Как видно на рисунке, наиболее распространенное сочетание гемолизинов, фибронектинсвязывающих белков и факторов слипания – hla-hlb-fnBpA/B-clfA/B обнаружено у 42 (44,7%) изолятов. В единичных случаях в геноме S. aureus отмечены другие комбинации. Только у 2 (2,1%) изолятов не выявлены гены исследуемых токсинов, гемолизинов и адгезинов. У 13 (13,8%) изолятов в геноме отсутствовали PTAg, а у 1 (1,1%) не детектированы гены, кодирующие образование α- и β-гемолизинов, фибронектинсвязывающих белков A и B, факторов слипания A и B. В нашем исследовании отмечались комбинации двух и трех генов, кодирующих энтеротоксины. В большинстве случаев (8,5%) в геноме S. aureus имелось сочетание генов sea-sec (8 изолятов), у 6 (6,4%) штаммов выявлено сочетание seb-sec. Замечено, что ген sea встречался только в комбинации с другими генами энтеротоксинов в отличие от генов seb и sec. Так, у 5,3% (5 изолятов) S. aureus в геноме обнаружен только ген seb и у 10,6% (10 изолятов) – только ген sec при отсутствии других PTAg. Ген лейкоцидина Пантон–Валентайна выявлен в сочетаниях с генами токсинов суперантигенов. В большинстве случаев он присутствует в геноме S. aureus с геном энтеротоксина С (sec-pvl). 10,6% изолятов S. aureus несли ген pvl в отсутствие генов токсинов суперантигенов.
В ходе исследования установлено, что одновременное присутствие двух генов гемолизинов (hla, hlb), обоих генов адгезинов (fnBpA/B и clfA/B) отмечено только у S. aureus, несущих аллель I комплекса agr. В то же время гены токсинов суперантигенов и лейкоцидина Пантон–Валентайна не обнаружены у agr III группы (см. рисунок).
Следовательно, на основании полученных данных установлена вариабельность набора молекулярных маркеров вирулентности у изолятов S. aureus. Как известно, токсигенные штаммы имеют существенное эпидемиологическое значение, так как являются этиологическими факторами пищевых отравлений у человека и приматов, причиной которых являются выделяемые ими энтеротоксины. Детекция генов суперантигенов, кодирующих секрецию энтеротоксинов А, В и токсина синдрома токсического шока, показала сравнительно низкую их частоту распространения, в то время как ген sec присутствует у половины изученных S. aureus. Также в высоком проценте верифицирован ген лейкоцидина Пантон–Валентайна. При этом отмечено сочетание по генам. Наши данные по распространению гена pvl в геноме S. aureus, выделенных из легких при пневмониях у обезьян, совпадают с результатами, представленными H. Momtaz и соавт. [2]. В этом исследовании pvl-позитивными оказались 41,66% штаммов, выделенных при пневмонии и легочных абсцессах у людей. Наиболее распространенное сочетание генов, ответственных за продукцию гемолизинов, фибронектинсвязывающих белков и факторов слипания, – hla-hlb-fnBpA/B-clfA/B. Agr-типирование показало преобладание изолятов S. aureus IV группы, в то время как исследования, проведенные на штаммах S. aureus, выделенных при пневмониях у людей, показали преобладание аллелей I, а agr IV была наименее распространенной группой [23].
Данная работа является первым исследованием по анализу генетических вариаций среди изолятов MSSA, изолированных у обезьян из легких при пневмонии. Важность изучения S. aureus, обнаруженных при пневмониях у обезьян, связана с тем, что данное заболевание занимает второе место в структуре смертности животных в Адлерском питомнике. При этом данный патоген занимает ведущую позицию в этиологической структуре пневмоний. В современной научной литературе отсутствуют данные о маркерах вирулентности S. aureus, выделенных у обезьян при пневмониях, поэтому исследование было сфокусировано на выявлении генов токсинообразования и кодирующих MSCRAMM. Проведенный анализ ДНК MSSA подтверждает наличие существенной вариабельности в наборе генетических детерминант, характеризующих патогенный потенциал изолятов S. aureus, выделенных из легких обезьян при пневмониях.
Возможно, существующие различия в наборе факторов вирулентности у разных изолятов могут обусловливать изменения в патогенезе инфекционного процесса, вызванного S. aureus. Необходимо отметить, что гены адгезинов и гемолизинов обнаружены с высокой частотой, а они, как известно, играют ключевую роль в инфекционном процессе. Также настораживает выявление у изолятов S. aureus генетических детерминант лейкоцидина Пантон–Валентайна, являющегося маркером тяжелого инфекционного процесса и часто встречающегося при тяжелой некротической геморрагической пневмонии. Наше исследование не выявило четкой зависимости между видом обезьян и принадлежностью S. aureus к определенной группе регуляторного гена.
Дальнейший молекулярно-генетический анализ изолятов S. aureus, выделенных при пневмониях у обезьян, будет принципиально важен для оценки эпидемиологической обстановки по данному патогену в стаде обезьян, выявления источников заражения, а также возможного предотвращения распространения стафилококковой инфекции у животных в питомнике.
Работа выполнена без спонсорской поддержки за счет бюджетных средств.