Токсикологические исследования. Референтные интервалы массовых коэффициентов внутренних органов на выборке, состоящей из 1000 аутбредных крыс

И.А. Луговик, фармаколог, ORCID 0000-0003-3840-5049;
М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-0003-3176-6386;

АО НПО «Дом Фармации»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245
Е-mail: [email protected]

Резюме

Измерение массы внутренних органов и подсчет их массовых коэффициентов относительно массы тела являются обязательной манипуляцией при исследовании токсических эффектов препаратов в доклинических исследованиях. Однако оценка клинической значимости изменений по массовым коэффициентам органов может быть осложнена при отсутствии корректных референтных внутрилабораторных интервалов, отражающих нормальные значения для популяции животных, используемых в исследовательском центре.

Цель данной работы – обобщение результатов морфометрических показателей органов, полученных в проведенных ранее исследованиях на аутбредных крысах на базе НПО «Дом Фармации» в период с 2018 по 2020 г. для выведения референтных значений показателей массы органов аутбредных крыс. Проведен ретроспективный анализ данных 9 основных органов, используемых для подсчета массовых коэффициентов при токсикологических исследованиях. Проанализирована большая выборка, состоящая из 1000 аутбредных крыс (534 самца и 466 самок), диапазон массы тела самцов 200–400 г, самок – 180–300 г.

Установлены референтные интервалы с учетом рекомендаций Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) для массовых коэффициентов сердца, легких, тимуса, печени, селезенки, почек, надпочечников, головного мозга, семенников и яичников.

Выявлено, что у самцов и самок крыс наиболее часто наблюдаются статистические выбросы среди таких массовых коэффициентов внутренних органов, как селезенка (0,82–8,87%), надпочечники (0–6,45%), легкие (0–5,44%), семенники (0–4,69%) и яичники (0–3,12%), выбросы других показателей отмечались существенно реже. Этот факт необходимо учитывать при оценке клинической значимости изменений данных показателей.

Определять актуальные внутрилабораторные референтные интервалы для массовых коэффициентов органов необходимо для того, чтобы на основании исторических данных лаборатории корректно оценивать влияние препарата, отделив его от действия случайных факторов (т.е. избежать ложноположительных или отрицательных результатов).

Целесообразно иметь референтные интервалы по массовым коэффициентам относительно не только массы тела, но и головного мозга, а также по абсолютным массам органов, так как в токсикологических исследованиях при значительных изменениях массы тела эти показатели могут дать более объективную информацию.

Формирование референтных интервалов по массовым коэффициентам целесообразно проводить для каждого диапазона масс тела животных отдельно, используя не менее 120 особей обоего пола на каждый диапазон. Для соблюдения этих условий предпочтительно использовать непрямой метод получения данных при ретроспективном анализе с целью соблюдения  биоэтических норм.

Введение

Крысы  являются  одним  из  самых  часто  используемых  модельных  организмов  в  биомедицинских исследованиях. 
Так, согласно последнему отчету Европейского союза об использовании животных в научных целях, крысы находились на 2-м месте по общему количеству задействованных животных – 1 146 299 особей за 2017 г. [1]. Небольшая масса белых крыс, относительно простое содержание и успешное разведение их в лабораторных условиях позволяют успешно проводить доклинические исследования [2].

Измерение массы внутренних органов и подсчет их массовых коэффициентов относительно массы тела являются обязательной манипуляцией при исследовании токсических эффектов препаратов в доклинических исследованиях [2]. Массовый коэффициент органов (МКО) – процентное отношение массы органа к массе тела, интегральный показатель, используемый в токсикологии для оценки состояния внутренних органов. Изменения МКО отражают объективное состояние внутренних органов и их поражение ксенобиотиками, а также позволяют обнаружить эндокринно-связанные эффекты [3]. Для изучения воздействия препарата на внутренние органы чаще всего используются сравнение с контрольной группой и обработка этих изменений с помощью статистических методов для определения их значимости. Однако не всякое статистически значимое изменение имеет прогностическое значение и в ряде случаев для оценки клинической значимости отклонений могут потребоваться дополнительные ориентиры. Одним из таких ориентиров могут служить референтные интервалы (РИ).

РИ – статистический показатель, двумя пределами ограничивающий центральный 95% диапазон референтных значений [4]. Этот показатель определяют на выборке условно здоровых людей или животных, для того чтобы установить статистические нормы по какому-либо показателю, который характеризует данную популяцию [5].

Согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), в каждой лаборатории должны создаваться свои РИ [5]. Крысы как биологический вид также не являются однородными, существует более 1 тыс. линий крыс, которые могут значительно отличаться по многим признакам, в том числе морфометрическим [6]. В связи с этим остро встала необходимость составления актуальных РИ для популяции животных, используемых для проведения исследований в НПО «Дом Фармации»

Существует два основных метода для расчета пределов РИ: параметрический и непараметрический.

При использовании непараметрического метода расчета РИ требуется минимум 120 показателей [5], а параметрического – уже ≥200, так как при анализе около 150 значений и ниже параметрический метод нестабилен [7]. Также непараметрический метод не требователен к распределению данных, что делает его предпочтительным при создании РИ биологических показателей, которые зачастую имеют ненормальное распределение [4].

В зависимости от того, как были получены данные для расчета РИ, выделяют прямой и непрямой методы их определения. При прямом методе оценки предполагается целенаправленный набор здоровых субъектов. При непрямом методе используется информация, накопленная в базах данных исследовательского учреждения [5].

Применительно к расчету РИ, используемых в клинической практике, приоритет имеет прямой метод. Однако в случае расчета РИ на биологических моделях по показателям масс внутренних органов, при фиксации которых требуется эвтаназия, гуманное обращение с животными требует непрямого ретроспективного метода.

Цель данной работы – обобщение результатов морфометрических показателей органов, полученных в проведенных ранее доклинических испытаниях на аутбредных крысах на базе НПО «Дом Фармации» в период с 2018 по 2020 г. для выведения референсных значений показателей массы органов аутбредных крыс.

Материал и методы

Поскольку количество животных на каждый диапазон массы тела было <200, предпочли непараметрический метод расчета РИ.

Для формирования РИ использовали данные животных,  находившихся в контрольных группах эксперимента в период с начала  2018  г.  до  середины  2020 г.  (все  проведенные  эксперименты  были  одобрены  биоэтической  комиссией).
В сформированном массиве представлены данные, полученные от 1000 аутбредных крыс (534 самца и 466 самок), масса тела самцов – 200–400 г, самок – 180–300 г. При оценке показателей данные животных были разделены на группы по массе (4 группы – для самцов и 3 группы – для самок) так, чтобы в каждой группе, в которой оценивали МКО, оказались крысы сопоставимого возраста и морфометрических характеристик. Данные, касающиеся самцов, были разделены на 4 группы в массовых диапазонах 200–250, 251–300, 301–350 и 351–400 г; самок – на 3 группы по массам: 180–220, 221–260 и 261–300 г. Были использованы небеременные и нерожавшие самки. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 18–26оС, относительная влажность 46–65%, 12-часовой световой день. Крысы находились в стандартных пластиковых клетках, не более 5 животных в каждой. Площадь пола на одно животное соответствовала регламентирующим стандартам, доступ к воде не ограничивали на протяжении всего срока эксперимента. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Все исследования были выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Всех животных, данные которых были отобраны для исследования, подвергали эвтаназии с применением СО2 с последующим удалением жизненно важных органов (легкие, сердце, головной мозг) или обескровливанием полостей сердца.

Животных лишали корма на ночь перед некропсией, оставляя свободный доступ к воде. Массу тела определяли непосредственно перед некропсией. Рассчитывали процентное отношение массы органа к массе тела, определенной непосредственно перед некропсией, а также к массе мозга.

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica 10.

Результаты и обсуждение

Опираясь на процедуру, описанную в руководстве CLSI, из массива данных были устранены аномальные значения – статистические выбросы. Их определяли отдельно по каждому показателю для каждого пола и группы, согласно диапазону масс по методу Тьюки [5]. Из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5.IQR)–(Q3+1,5.IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал. В этот интервал попадали как «extremes», или «жесткие» выбросы, так и «outliers», или «мягкие» выбросы (табл. 1, 2).

Таблица 1. Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела, самцы
 <strong>Таблица 1.</strong> Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела, самцы

Таблица 2. Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела, самки
 <strong>Таблица 2.</strong> Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела, самки

Обращает на себя внимание, что наиболее часто у самцов и самок крыс встречаются выбросы по таким показателям, как «легкие», «селезенка», «надпочечники», «семенники» и «яичники», что необходимо учитывать при анализе данных доклинических исследований (см. табл. 1, 2).

После устранения статистических выбросов были получены результаты для составления РИ.

Согласно руководству CLSI для данных по массовым коэффициентам органов, проводился расчет промежутка 2,5–97,5 процентили, диапазон между которыми и служил РИ [4] (табл. 3, 4).

Таблица 3. Референтные интервалы по МКО самцов крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе тела
 <strong>Таблица 3.</strong> Референтные интервалы по МКО самцов крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе тела

 Для самок в свою очередь определяли МКО в диапазонах массы тела – 180–220, 221–260 и 261–300 г.

Таблица 4. Референтные интервалы по МКО самок крыс, рассчитанные как отношение к массе тела
 <strong>Таблица 4.</strong> Референтные интервалы по МКО самок крыс, рассчитанные как отношение к массе тела

 

Полученные данные демонстрируют, что относительно массы тела у самцов и самок наблюдалось постепенное снижение массовых коэффициентов всех исследованных органов. Это было связано с физиологическим приростом массы тела животных за счет мышечной и жировой тканей.

Поскольку в токсикологических исследованиях часто наблюдается изменение нормальной динамики массы тела (например, существенное снижение на фоне действия ксенобиотика), иногда целесообразно оценивать как абсолютную массу органов, так и ее отношение к массе головного мозга – органа, наименее подверженного индуцированным колебаниям массы тела. Исходя из этого, были составлены РИ по МКО относительно головного мозга (табл. 5, 6) и абсолютных значений органов (табл. 7, 8).

Таблица 5. Референтные интервалы по МКО самцов крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга
 <strong>Таблица 5.</strong> Референтные интервалы по МКО самцов крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга

Таблица 6. Референтные интервалы по МКО самок крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга
 <strong>Таблица 6.</strong> Референтные интервалы по МКО самок крыс, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга

Таблица 7. Референтные интервалы по абсолютным массам органов самцов крыс
 <strong>Таблица 7.</strong> Референтные интервалы по абсолютным массам органов самцов крыс

Таблица 8. Референтные интервалы по абсолютным массам органов самок крыс
 <strong>Таблица 8.</strong> Референтные интервалы по абсолютным массам органов самок крыс

С помощью метода Тьюки были устранены статистические выбросы согласно процедуре, описанной выше, и рассчитана их доля (табл. 9–12)

Таблица 9. Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно головного мозга, самцы
 <strong>Таблица 9.</strong> Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно головного мозга, самцы

Таблица 10. Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно головного мозга (самки)
 <strong>Таблица 10.</strong> Доля статистических выбросов при расчете МКО относительно головного мозга (самки)

Таблица 11. Доля статистических выбросов при анализе абсолютных масс органов (самцы)
 <strong>Таблица 11.</strong> Доля статистических выбросов при анализе абсолютных масс органов (самцы)

Таблица 12. Доля статистических выбросов при анализе абсолютных масс органов (самки)
 <strong>Таблица 12.</strong> Доля статистических выбросов при анализе абсолютных масс органов (самки)

Следует отметить, что доля статистических выбросов при расчете МКО относительно массы тела (0–5,11%) была соотносима с данными, полученными при расчете статистических выбросов МКО относительно головного мозга (0–8,87%) и абсолютных масс органов (0–7,03%). Наибольшее количество выбросов наблюдалось по таким показателям, как «селезенка», «легкие», «надпочечники», «семенники» и «яичники».

При исключении выбросов в группе самцов массой 200–250 г количество оставшихся значений для расчета РИ по показателю «селезенка» было меньше 120, и соответственно расчет не в полной мере отвечает рекомендациям CLSI и является ориентировочным.

При исключении выбросов в группе самцов массой 351–400 г и самок массой 261–300 г количество оставшихся значений для расчета РИ было меньше 120, и соответственно расчет не в полной мере отвечает рекомендациям CLSI и является ориентировочным.

Заключение

Наличие актуальных внутрилабораторных референтных интервалов необходимо, так как позволяет на основании исторических данных лаборатории корректно оценить влияние препарата, отделив его от случайных факторов (т.е. избежать ложноположительных или отрицательных результатов).

Необходимо отметить, что целесообразно иметь референтные интервалы по массовым коэффициентам органов не только относительно массы тела, но и головного мозга, а также по абсолютным массам органов, так как в токсикологических исследованиях при значительных изменениях массы тела эти показатели могут дать более объективную информацию.

Также важно отметить, что лучше рассматривать референтные интервалы по массовым коэффициентам для каждого массового диапазона (по массе тела) отдельно, используя при составлении не менее 120 животных обоего пола на каждый диапазон. Для соблюдения этих условий предпочтительно использовать непрямой метод получения данных при ретроспективном анализе с целью соблюдения  биоэтических норм.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов 

Луговик И.А. – сбор и анализ данных, сбор данных из литературных источников, написание текста статьи.

Макарова  М.Н. – идея исследования, редактирование текста статьи.

Список литературы

  1. Report from the Commission to the European Parliament and the council 2019 «Report on the statistics on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union in 2015–2017» URL: https://eur-lex.europa.eu/legalcontent/EN/TXT/?qid=1581689520921&uri=CELEX:52020DC0016 (дата обращения: 12.2020).
  2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Миронов А.Н. ‒ М.: Гриф и К, 2012. ‒ 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstvennykh sredstv. Chast' pervaya. / Mironov A.N. ‒ M.: Grif i K, 2012. ‒ 944 p. (In Russ.)].
  3. Макаров В.Г., Макарова М.Н. Абрашова Т.В., Гущин Я.А., Ковалева М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П., Ходько С.В. СПРАВОЧНИК. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПБ.: Изд-во «ЛЕМА», 2013. – 116 с. [Makarov V.G., Makarova M.N. Abrashova T.V., Gushchin Ya.A., Kovaleva M.A., Rybakova A.V., Selezneva A.I., Sokolova A.P., Khod'ko S.V. SPRAVOChNIK. Fiziologicheskie, biokhimicheskie i biometricheskie pokazateli normy eksperimental'nykh zhivotnykh. SPB.: «LEMA», 2013. – 116 p. (In Russ.)].
  4. Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов //Лабораторная служба. – 2019. – Т. 8. – №. 2. – С. 36-44. DOI 10.17116/labs2019802136 [Evgina S.A., Savel'ev L.I. Sovremennye teoriya i praktika referentnykh intervalov // Laboratornaya sluzhba. – 2019. – Vol. 8. – 2. – P. 36-44. (In Russ.)].
  5. CLSI Document C28-A3c. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline – third edition. Wayne, Pa., USA: CLSI; 2010.
  6. Гайдай Е.А., Гайдай Д.С. Генетическое разнообразие экспериментальных мышей и крыс: история возникновения, способы получения и контроля // Лабораторные животные для научных исследований. – 2019. – 4 https://doi.org/10/29926/2618723X-2019-04-09. [Gaidai E.A., Gaidai D.S. Geneticheskoe raznoobrazie eksperimental'nykh myshei i krys: istoriya vozniknoveniya, sposoby polucheniya i kontrolya // Laboratory Animals for Science. (In Russ.)].
  7. Ichihara K., Ozarda Y., Barth J.H., Klee G., Qiu L., Erasmus R., Erasmus R., Borai A., Evgina S., Ashavaid T., Khan D., Schreier L., Rolle R., Shimizu Y., Kimura S., Kawano R., Armbruster D., Mori K., Yadav B.K. A global multicenter study on reference values: 1. Assessment of methods for derivation and comparison of reference intervals // Clinica Chimica Acta. – 2017. – Vol. 467. – P. 70-82. https://doi.org/10.1016/j.cca.2016.09.016.

Вас может заинтересовать