Применение желточных антител птиц в медико-биологических исследованиях

Введение

Птицы (в частности, куры) относятся к яйцекладущим животным. Из их оплодотворенных яиц при температуре 37–38 °С через 21 сут вылупляется цыпленок. Простая процедура изъятия материала для исследований привлекла внимание древних философов-⁠естествоиспытателей. Первый из известных трудов по сравнительной эмбриологии принадлежит греческому мыслителю Аристотелю Стагириту, жившему в IV веке до н. э. В своей книге «Размножение животных» он дал первое описание последовательных этапов развития куриного зародыша. Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию в XX веке такой дисциплины, как «Биология развития», а птицы стали незаменимыми лабораторными животными. В частности, F.M. Burnet в 1941 г. [1] разработал процедуру получения вирусов из куриных эмбрионов, которая стала классикой и до сих пор используется для получения вакцин. Птиц можно рассматривать как перспективную тест-⁠систему для проведения доклинических исследований. Так, например, куры используются для оценки общих токсических свойств лекарственных средств [2] и нейротоксических эффектов [3]. Куринные эмбрионы — незаменимая модель экспериментального изучения физиологии и патологии сердечно-⁠сосудистой системы [4] и механизмов миграции и инвазии клеток меланомы [5]. Также перспективным направлением использования птиц является иммунология, а именно IgY-⁠технологии, которые за последние 10 лет наконец-⁠то нашли понимание и применение фармацевтами, ветеринарами, медиками, промышленниками и учеными в разработке терапевтических специфических антител практически любой направленности.

Иммунология как определенное направление исследований возникла из практической необходимости борьбы с инфекционными заболеваниями, такими как оспа, столбняк, бешенство, дифтерия и многие другие. В 1546 г. выходит книга итальянского врача Джироламо Фракасторо «Зараза» («On Contagion et Contagiosis Morbis»), в которой он развивает теорию приобретенного иммунитета, выдвинутую еще в XI веке Авиценной.

Не останавливаясь на борьбе человечества с оспой и другими «заразами», следует лишь отметить, что выдающийся французский ученый L. Pasteur разработал и впервые применил вакцины против холеры кур, сибирской язвы овец и бешенства. Принципиально другое направление лечения было предложено E. Behring, получившее название «пассивная иммунизация». В 1890 г. он совместно с S. Kitasato показал, что в крови людей, переболевших дифтерией или столбняком, образуются антитоксины, которые обеспечивают иммунитет к этим болезням как самим переболевшим, так и тем, кому такая кровь будет перелита. В том же году на основе этих открытий был разработан метод лечения сывороткой крови (сывороточная терапия). Работы этих ученых положили начало изучению механизмов гуморального иммунитета.

S. Kitasato в 1889 г. изолировал чистую культуру столбнячной палочки (Clostridium tetani), что дало возможность и другим исследователям изучать этот патоген. В 1891 г. он и E. Behring создали противостолбнячную сыворотку. В нескольких лабораториях были повторены эксперименты с использованием столбнячного и дифтерийного токсинов на разных видах животных. Так, L. Vaillard в 1891 г. провел иммунизацию кур столбнячной палочкой и получил активную сыворотку из крови кур. В этом же году P. Ehrlich опубликовал статью о том, что антитела у млекопитающих могут передаваться с материнским молоком и создавать пассивный иммунитет для потомства. F. Klemperer в 1893 г., сопоставив эти два факта (передача антител из молока и наличие антител в сыворотке курицы), провел эксперимент, в котором решил проверить, не передаются ли антитела, наработанные в крови курицы на столбнячную палочку, в яйцо иммунизированных птиц.

F. Klemperer иммунизировал кур столбнячным токсином [6]. Через месяц он проверил содержимое яиц иммунизированных кур на наличие антитоксина. Выяснилось, что только в желтке обнаруживается антитоксин — специфические антитела, которые защитили подопытных мышей, зараженных столбнячной палочкой, от летального исхода. Тем не менее долгое время открытие F. Klemperer оставалось малоизвестным, так как кур не рассматривали в качестве потенциальных доноров из-⁠за небольшого количества сыворотки, которое можно было получить от этих птиц. Однако в последствии оказалось, что из яиц иммунизированных птиц можно выделять большое количество специфических иммуноглобулинов. В 1959 г. W.M.S. Russell и R.L. Burch опубликовали свой труд «Принципы гуманной экспериментальной техники», в котором предлагали пересмотреть отношение к лабораторным животным [7]. Именно поэтому интерес к открытию F. Klemperer стал очень постепенно возрастать. Антитела предлагалось получать из яиц, а не из сыворотки кур. Название «IgY» было предложено в 1969 г. G.A. Leslie и L.W. Clem после того, как они смогли показать различия между иммуноглобулинами, обнаруженными в куриных яйцах и IgG млекопитающих [8].

IgG млекопитающих состоит из четырех полипептидных цепей — двух одинаковых тяжелых цепей и двух легких. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена (VH) и трех константных доменов (CH1, CH2, CH3) с одним углеводным сайтом (обозначен зеленым цветом). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). VL и VH являются связывающим доменом антигена. По сравнению с IgG IgY состоит из четырех константных доменов на тяжелую цепь (CH1-⁠CH4) с двумя углеводными участками. Гибкая шарнирная область, присутствующая в IgG, отсутствует в IgY, что может ограничивать его гибкость по сравнению с IgG. Усеченная молекула IgY (ΔFc) водоплавающих птиц не имеет доменов CH3 или CH4, а две ее С-⁠концевые аминокислоты тяжелой (H) — цепи не кодируются в доменах CH2 или CH3 полноразмерной изоформы [9] (рис. 1).

IgY является основным антителом, обнаруженным как в сыворотке крови, так и в яйцах птиц, рептилий и земноводных [10]. Яичный желток — обильный источник иммуноглобулинов, общее количество которых превышает 100 мг на одно яйцо курицы. Кроме того, выделение IgY из яичного желтка — процедура относительно простая и неинвазивная. По сравнению с кроликом из желтков одной курицы можно получить в 15–17 раз больше антител за тот же период. Это достоинство желточных IgY делает их незаменимыми при пассивной иммунизации человека и животных, что уже применяется в промышленных масштабах. Основной целью пассивного введения специфических антител является экстренное достижение быстрого лечебного эффекта и предупреждение дальнейшего развития болезни. Немедленное введение иммуноглобулина может спасти жизнь больного, представляя собой, таким образом, единственное эффективное средство для этой цели [11–13]. В настоящее время сформировалось понятие «IgY-⁠технологии» — получение и применение IgY-⁠антител в аналитических и терапевтических приложениях [14–21].

Птицы, используемые в медико-⁠биологических экспериментах

Птицы относятся к яйцекладущим животным, но только одомашненные породы, лишенные инстинкта насиживания, способны нести 150 яиц в год и более, что очень ценно в практическом применении трансовариальных антител птиц. Эти породы и кроссы птиц стали широко использоваться в IgY-⁠технологиях при производстве спе­цифических антител, направленных к широкому кругу патогенов вирусной, бактериальной, грибковой природы, а также патогенов простейших, отдельных токсинов и искусственных генно-⁠инженерных конструкций. Осознанная селекция пернатых на выведение пород с высокой яйценоскостью началась примерно с 7000–4000 лет до н.э., одомашниванию были подвержены такие виды птиц, как гуси, куры и утки. Значительно позже, с 900–1900 лет н.э. были одомашнены японские перепела. Хотя разведение страусов началось еще до нашей эры в Древнем Египте, новый всплеск популярности страусоводства пришелся на 1990–1995 гг. из-⁠за ценных свойств их мяса, а также яиц, которые начали использоваться в IgY-⁠технологиях.

Анализ специфичности IgY-⁠антител показал, что при прямом сравнении реакций специфических IgY-⁠антител разных видов птиц наибольшей аффинностью обладают антитела кур > фазана/⁠куропатки > индейки > голубя > перепелки > утки [22]. В этот список не попала такая птица, как страус, так как этот вид привлек внимание японских ученых, изучавших IgY-⁠технологии, в конце ХХ века. Это очень древний вид птиц появился в Африке 23 млн лет назад, а страусиная иммунная система адаптировалась и стала лучшей среди всех животных. Страус может начать вырабатывать антитела в течение 2 недель после контакта с антигеном, а их IgY-⁠антитела менее термочувствительны и более кислотоустойчивы, чем у других птиц [23].

Самки перепелов и практика применения их яиц в иммунологических исследованиях

Перепела (Coturnix coturnix). В естественных природных условиях это перелетная птица. Экстерьером и общим тоном окраски напоминает обыкновенного перепела, но отличается несколько меньшей величиной.

Одомашнивание перепелов произошло в Японии в конце XIX — начале XX веков, по другим сведениям, первыми перепелов одомашнили китайцы в IX веке. В отличие от обыкновенных перепелов они менее драчливы и крикливы, поэтому лучше подходят для содержания в неволе. Существуют как яйценоские, так и мясные (бройлерные) породы перепелов. Японский перепел является модельным животным в экспериментальных и научных исследованиях поведения и развития, в области фармакологии, токсикологии, генетики, а также касающихся роста, питания и физиологии. Эмбрионы перепелов используются для приготовления вакцин против вирусов кори, краснухи и паротита.

Селекционеры вывели много пород перепелов: японские перепела, маньчжурская золотистая, фараон, эстонская и др.

Японский перепел (Japanese quails) — яичная порода. Яйцекладку самки начинают в 35–40-⁠дневном возрасте. Масса яйца 9–11 г, из них 30–32% приходится на желток. Одна самка несет 280–300 яиц в год. Средняя продолжительность жизни перепела составляет около 7–8 лет, это зависит от кросса перепела. Эффективность использования несушек ограничивается 1–2 годами.

Фараон (Pharaoh Quail) — мясная американская порода. Половозрелость самок наступает через 42–49 дней. За год она несет 200–220 яиц массой 12–18 г. Эта порода используется для селекционных работ.

А.А. Ковган и соавт. в 1989 г. [24] провели эксперименты на перепелках для получения поликлональных антител из желтков яиц этих птиц. Самок перепела иммунизировали вирусом гриппа (А/⁠Филиппины 2/⁠82-⁠H3N2) либо вирусом иммунодефицита человека HIV-⁠1 или фрагментами HTV-⁠1 полипептидов области env lor, которые были синтезированы в Е. coli. Для иммунизации использовали четырехкратную внутримышечную инъекцию с недельным интервалом по 4–5 мкг каждого антигена, cуспендированного в фосфатном буфере с концентрацией 1 мг/⁠мл и смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. После окончания иммунизации титры специфических IgY-⁠антител стали быстро нарастать и к 15-⁠му дню приняли максимальное значение: антитела к вирусу гриппа — 1:10 000; антитела к вирусу HIV-⁠1 — 1:12 000; антитела к рекомбинантному антигену белка поверхности вируса HIV-⁠1 — 1:400. Таким образом, специфические IgY-⁠антитела перепелок взаимодействуют с целевыми антигенами вирусов HIV-⁠1 и H3N2.

С.В. Борисенко с соавт. проанализировали возможность использования IgY-⁠антител перепелов в диагностике гепатита В. Поверхностный антиген вируса гепатита В (Hepatitis B surface antigen) HВsAg является основным диагностическим маркером этой инфекции. Авторы разработали тест-⁠систему ИФА на основе желточных антител перепелок породы фараон. Для иммунизации птиц использовали рекомбинантную вакцину фирмы Engerix B™ (Бельгия). Доза иммунизации составила 200 мкг на птицу однократно. В результате были получены трансовариальные антитела к HВsAg с титрами 1:8100, которые были использованы для создания ИФА тест-⁠системы, чувствительность которой составила 91,4%, а специфичность — 87,5%. Различия значений оптической плотности между стандартной диагностической тест-⁠системой производства ЗАО «Вектор-⁠Бест» (Россия) и тест-⁠системой на основе желточных иммуноглобулинов перепелок несущественны (r_s>0,7; p>0,05) [25, 26].

Виды сальмонелл являются основными патогенами, представляющими угрозу в пищевой промышленности. Было показано, что пероральное введение специфических IgY является альтернативным методом лечения и профилактики желудочно-⁠кишечных патогенов, включая Salmonella разных видов. А. Esmailnejad и соавт. [27] изучали возможность использования IgY-⁠антител, извлеченных из желтков яиц перепелок, иммунизированных S. typhimurium и S. enteritidis. Для инактивации живых бактерий была использована термоинактивация при 100 °С или 10% формалин, который показал лучшие результаты. Реакция специфических антител стала заметной с 14-⁠го дня после начала иммунизации и достигала пика на 49-⁠й день после четвертой иммунизации. IgY перепелов против сальмонеллы были высокоспецифичны к соответствующим им иммуногенам. Они также проявляли умеренную перекрестную реактивность к другим членам семейства Enterobacteriaceae. Настоящее исследование продемонстрировало возможность производства специфического IgY против Salmonella typhimurium и Salmonella enteritidis в яичных желтках японских перепелов. Этих птиц можно рассматривать как недорогой источник специфических антител, которые могут найти широкое применение в иммунодиагностике и иммунотерапии.

В группе структурной биотехнологии Центра нейро-⁠ и клеточной биологии Университета Коимбры (Португалия) разработана и представлена новая система содержания перепелов, откладывающих яйца, в соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU об экспериментах на животных и принципами 3Rs. Эта модульная система дает уникальные технические возможности, которые позволяют использовать перепелов-⁠несушек для извлечения IgY-⁠антител из желтков яиц этих птиц. При этом система обеспечивает простоту обращения с птицами, сбора яиц и санитарной обработки помещения, позволяет ускорить изучение специфических антител к различным факторам вирулентности патогенов, тем самым способствуя развитию исследований, диагностики и в конечном счете терапевтических решений для борьбы с инфекциями, опосредованными бактериями, вирусами, грибами или паразитами [28]. O-⁠P. Tiago и соавт. — разработчики этой новой методологии содержания перепелок-⁠несушек — приводят практические примеры иммунизации этих птиц, из которых видно, что титры антител, выделенных из желтков яиц птиц, иммунизированных рекомбинантным белком Yellow fluorescent protein, показали высокие значения в ИФА, составляющие от 1:110 000 до 1:150 000. Этот флуоресцентный белок является полезным инструментом в клеточной и молекулярной биологии и иммунологии, поскольку пики возбуждения и испускания различны, что позволяет изучать несколько процессов/⁠белков в рамках одного эксперимента.

Таким образом, методология получения яиц перепелок, предложенная O-⁠P. Tiago и соавт., заслуживает особого внимания и может быть использована не только в аналитических научных исследованиях, но и в промышленном производстве терапевтической продукции.

Куры и практика применения их яиц в иммунологических исследованиях

Куры (Gallus gallus domesticus). В соответствии с монофилетической точкой зрения, домашние куры произошли от одного вида — диких банкивских кур, обитающих во влажных лесах Юго-⁠Восточной Азии от Индии до Филиппин. На основании исследований митохондриальной ДНК сделано предположение, что предки современных кур были одомашнены около 3500 лет до н.э. в азиатском регионе. Однако исследования палеозоологов последних лет свидетельствуют, что костные останки кур, обнаруженные при раскопках в Северном Китае, соответствуют времени около 6000 лет до н.э.

Срок жизни курицы в домашних условиях доходит до 15–30 лет, но в возрасте 2 лет их содержание становится нерентабельным. За многие столетия селекции были отобраны наиболее удачные породы кур, отвечающие любым требованиям промышленника или исследователя. Птицы бывают яичных, мясных и универсальных пород, а также их яйца могут отличаться по цвету скорлупы. Эмбрионы кур используются для приготовления вакцин против всевозможных патогенов.

Леггорн (White Leghorns) — наиболее распространенная во всех странах мира яичная порода кур. В зависимости от окраски оперения леггорнов подразделяют на 8 разновидностей. Инстинкт насиживания утерян. Леггорн приносят первые кладки в возрасте 4–4,5 мес с момента рождения. К преимуществам разведения кур этой разновидности относятся высокие показатели яйценоскости, а к недостаткам — быстрое истощение организма птиц, которое наступает в возрасте 1,5 лет. Яйценоскость составляет 220–300 яиц в год. Масса яиц годовалых кур 57–60 г, из них желток составляет 29–32%. По яйценоскости и массе яйца местные кроссы могут существенно отличаться от средних параметров.

Хайсекс белая (Hisex White). Неприхотливая птица, идеально пригодная для производства яйца. Яйценоскость в среднем 300 яиц, масса 60–65 г, скорлупа белого или светло-⁠коричневого цвета.

Ломанн-⁠Браун (Lohmann Brown) имеет коричневый окрас. Цыплята достигают половой зрелости в 4,5 мес, когда у них появляется первое яйцо. Яйценоскость доходит до 300–310 яиц на среднюю несушку в год. Куры несут крупное яйцо массой 62–64 г с коричневой окраской скорлупы [29].

Наибольшее количество публикаций о применении IgY-⁠технологий посвящено использованию куриных антител в диагностике, профилактике и терапии инфекционных и неинфекционных заболеваний человека и животных [30, 31]. Из источников литературы [32, 33] известно, что куриные IgY, полученные от интактных животных, вводимые перорально, способствуют усилению мышечной активности спортсменов и снижению болезненности мышц после тренировок. Для подтверждения этого факта В.С. Каплин и соавт. [34] провели испытание этого препарата на мышиной модели. Целью исследования было установить влияние куриных желточных иммуноглобулинов, полученных от неиммунизированных кур-⁠несушек, на выносливость лабораторных животных, выявляемую в тесте вынужденного плавания. Испытанию подвергался лиофильно высушенный препарат IgY с чистотой 96%. Оценку работоспособности мышей проводили на модели принудительного плавания с 5% нагрузкой от массы тела животного. В результате исследования установлено, что при ежедневном пероральном введении препарата в дозе 2 мг на мышь в течение 10 сут удержание на воде у самцов в контрольной группе составило 1,4 мин, в опытной — 3 мин, то есть превышение в 2,1 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что курсовое применение IgY способствует увеличению значений показателей физической работоспособности, что является подтверждением высокой биологической активности и перспективности дальнейшего фармакологического исследования препарата. Предлагаемый препарат может быть перспективным средством для восстановления физических сил спортсменов, ослабленных людей после тяжелой работы, болезни.

В.С. Каплин и соавт. [35] иммунизировали кур штаммом вируса осповакцины (ЛИВП) внутримышечно с полным адъювантом Фрейнда. Бустер вводили через месяц. После 2-⁠й иммунизации титр желточных антител по результатам ИФА достигал более 1:10 000. Титр в реакции вирус-⁠нейтрализации составил 1:25. Из источников литературы [36, 37] известно, что время биологического полураспада молекул IgY в сыворотке кур составляет в среднем около 36 ч, следовательно, титры специфических антител нарастали довольно быстро, и периоды между бустерными инъекциями могут быть существенно сокращены. Далее, изменив протокол иммунизации птиц, авторы получили возможность существенно повысить титры специфических IgY-⁠антител. Измененный вариант иммунизации дал возможность повысить титры IgY-⁠антител до 1:100 000–300 000. Такие антитела могут быть использованы при разработке антидотов против компонентов биологического оружия или в аварийных ситуациях на производстве.

Стоматологический кариес — инфекционное заболевание, вызванное бактериями Streptococcus mutans. Во многих странах (Китай, Корея, Япония) для лечения данного заболевания разработаны препараты (зубные пасты, жидкости и гели), в состав которых входят специфические IgY-⁠антитела к возбудителю. В.С. Каплин и соавт. [38] проверили возможность получения специфических куриных IgY-⁠антител к возбудителю стоматологического кариеса, вызванного Streptococcus mutans. После иммунизации 6 кур инактивированным возбудителем с последующими бустерными инъекциями были собраны иммунные яйца и извлечены IgY-⁠антитела. В результате от 6 кур было собрано 474 яйца, из которых выделено 54,549 г IgY с титрами, определенными в ИФА, от 1:72 900 до 1:656 100, чего хватило бы для производства более 45 000 тюбиков зубной пасты массой 60 г. Авторами продемонстрирована возможность получения промышленных количеств активных IgY-⁠антител к S. mutans, которые могут быть использованы в качестве субстанции при изготовлении зубной пасты, защитного геля, жидкости для полоскания рта, аэрозоля и гигиенических таблеток для рассасывания. Эта лабораторная методика является основой для разработки технического регламента, а после клинических испытаний может быть использована в производстве различных средств защиты при профилактике кариеса.

Вирус Эбола (Ebola virusdisease, EVD) принадлежит к семейству Filoviridae и является причиной тяжелой геморрагической лихорадки. Повторяющиеся вспышки с высоким уровнем летальности все еще происходят в Африке. Наиболее эффективной стратегией лечения является, как показали исследования [39], иммунотерапия с использованием моноклональных антител, но из-⁠за низкой термостабильности антител млекопитающих их применение в тропиках остается неоправданным. Поэтому Y. Zhang и соавт. [40] использовали куриные IgY-⁠антитела при пассивной иммунизации мышей, зараженных вирусом Эбола. Куры-⁠несушки были иммунизированы различными вакцинами-⁠кандидатами для получения IgY-⁠антител к EVD. В результате были получены IgY-⁠антитела с высоким титром к вирусу. Терапевтическая эффективность иммунных антител in vivo была проверена на новорожденных мышах Balb/⁠c. Мышей, предварительно инфицированных смертельной дозой псевдовируса, лечили, используя различные дозы IgY-⁠антител к EVD. Животные в группе, получавшей высокую дозу нейтрализующих антител, были полностью защищены и не имели симптомы заболевания, в то время как мыши в группе с низкими дозами антител были защищены лишь частично. Мыши, принимавшие контрольные IgY (неиммунные), погибали в течение 10 сут. Кроме того, авторы показали, что полученные ими анти-⁠EVD-⁠IgY-⁠антитела сохраняют свою нейтрализующую активность при температуре 25 °C в течение одного года, в то время как анти-⁠EVD-⁠овечьи антитела и рекомбинантные mAb KZ52-⁠антитела с той же специфичностью при той же температуре за 2 недели полностью потеряли свою активность. Таким образом, анти-⁠EVD-⁠IgY-⁠антитела демонстрируют большие перспективы в плане внедрения новых схем лечения этого заболевания.

Тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2 (SARS-⁠CoV-⁠2). Вирус впервые был обнаружен в декабре 2019 г. в Китае. Он вызывает опасное инфекционное заболевание COVID-⁠19, которое может протекать как в легкой форме острой респираторной вирусной инфекции, так и тяжелой. Наиболее частым осложнением заболевания является вирусная пневмония, способная приводить к острому респираторному дистресс-⁠синдрому и последующей острой дыхательной недостаточности. В последнее время стали широко использовать куриные желточные антитела для пассивной иммунизации. W. Jingchen и соавт. [41] использовали RBD шиповидного (S) белка (S-⁠RBD) коронавируса SARS-⁠CoV-⁠2 в качестве антигена для иммунизации кур. Извлечение IgY из желтков проводили водным способом с замораживанием. Чистота препарата составила 85%. Результаты этого исследования подтвердили, что эти антитела могут распознавать антиген SARS-⁠CoV-⁠2 S-⁠RBD и специфически связываться с ним, блокируя взаимодействие белка S и ACE2 и предотвращая инфекцию, вызванную этим взаимодействием. S-⁠IgY может не только блокировать попадание SARS-⁠CoV-⁠2 в клетки-⁠мишени, но и эффективно ингибировать репликацию SARS-⁠CoV-⁠2 в клетках, что было подтверждено в экспериментах in vitro на клетках Vero E6.

H. Shen и соавт., а также S. Ge и соавт. [42, 43] описали эксперимент, в котором они выделили IgY против SARS-⁠CoV-⁠2 из желтков яиц кур, иммунизированных инактивированным SARS-⁠CoV-⁠2, и оценили их ингибирующую активность против инфекции SARS-⁠CoV-⁠2 in vitro. Было показано, что анти-⁠SARS-⁠коронавирус-⁠2-⁠IgY-⁠антитела связываются с белком S1 и RBD в зависимости от дозы, в то время как контрольные антитела IgY не могли взаимодействовать с S1 или RBD. Кроме того, H. Shen и соавт. проверили, являются ли анти-⁠SARS-коронавирус-⁠2-IgY-⁠антитела полезными в использовании назального или орального распыления в качестве профилактической меры. Для этого мышам вводили антитела, меченные флуоресцентными молекулами, через назальную капельницу или оральный спрей. Результаты оценивали с помощью системы визуализации IVIS флуоресцентными красителями. Антитела к SARS-⁠CoV-⁠2-⁠IgY сохранялись на обнаруживаемом уровне в носовой и ротовой полостях в течение 2–4 и 12–24 ч после введения соответственно. Эти результаты показывают, что желточные антитела к SARS-⁠CoV-⁠2 могут оставаться в верхних дыхательных путях в течение нескольких часов в зависимости от используемого метода введения. Авторы делают вывод, что культивированный в лабораторных условиях и инактивированный формальдегидом SARS-⁠CoV-⁠2 можно использовать для иммунизации кур для крупномасштабного производства IgY из яичного желтка, обладающий мощной ингибирующей активностью к живой и псевдотипированной инфекции SARS-⁠CoV-⁠2 in vitro. Учитывая, что антитела IgY безопасны для использования у человека и могут производиться в больших масштабах с низкими производственными затратами, эти антитела IgY к SARS-⁠CoV-⁠2 имеют хороший потенциал для дальнейшего развития в качестве иммунопрофилактического средства с помощью назального или перорального спрея для предотвращения пандемии.

Утки и практика применения их яиц в иммунологических исследованиях

Утки (Anas platyrhynchos). Родоначальником домашних уток Старого Света является кряковая утка. Ее одомашнивание происходило в разных местах и в разное время. Их иммунная система (иммуноглобулины) отличается от таковой у кур. Сывороточный и желточный иммуноглобулины уток представлены двумя изоформами: полной (IgY) изоформой и (IgYΔFc) усеченной, в то время как у кур существует только полная изоформа (см. рис. 1). Обе изоформы иммуноглобулинов уток являются продуктом одного гена. Соотношение IgY и IgY (ΔFc) в сыворотке одной утки не постоянно и составляет 15–25%: 85–75%, что было показано при гипериммунизации бычьим сывороточным альбумином. По данным Чиоу Й-⁠Нэн, в яичном желтке сохраняются те же тенденции, что и в сыворотке. Общее количество желточных иммуноглобулинов, содержащихся в одном утином яйце, оценивается в 15–80 мг IgY и 45–240 мг IgY (ΔFc) [44, 45].

Белая пекинская (Peking Duck), одна из популярных пород уток, используемых в промышленном птицеводстве и в экспериментах. Выведена более 300 лет тому назад в Китае. Яйцекладка у различных кроссов начинается в разные сроки, но в среднем происходит в возрасте 6–7 мес. Яйценоскость уток 100–120 яиц в год, но при правильном выборе кросса и питания может достигать 220 яиц на несушку. Средняя масса яйца 85 г, из них на долю желтка приходится 33–35%. Продолжительность жизни уток составляет около 15 лет, но в промышленных условиях птицу забивают на 1–2-⁠м году жизни. Если утка предназначена для того, чтобы нести яйца, то здоровая особь может быть использована для этих целей примерно до 7-⁠летнего возраста с максимальной производительностью [46].

Агидель (Agidel duck) выведена на территории России (Башкирия) в результате селекции 3 пород — благоварской, супер М и индийских бегунов. Порода универсального направления. Имеет белую окраску пера. Период половой зрелости у уток этой породы наступает уже в 4,6–5,5 мес. Яйценоскость около 230–250 яиц в год, при этом яйца отличаются крупными размерами (88–110 г) [47].

Яйца птиц — источник антител, а укороченная версия IgY, IgY (ΔFc), обнаруженная у водоплавающих, является ценным иммуноглобулином, так как обладает меньшей молекулярной массой, следовательно, иммуногенностью, что важно при внутримышечном введении. V.Y.N. Chiou [48] изучал возможность применения утиных IgY (ΔFc) — антител к яду кобры и крайта. Уток использовали для иммунизации детоксицированными ядами, а из яиц выделяли антитела. Самок мышей использовали в опытах in vivo в тесте нейтрализации. LD₅₀ ядов определяли путем подкожной инъекции различных доз яда мышам. Антитела, выделенные из яичного желтка, показали высокий титр ответа на свой иммуноген (яд кобры или крайта) в ИФА. В целом антитела из утиных яиц эффективно защищали мышей от отравления. IgY (ΔFc) — антитела, полученные из яичного желтка уток, иммунизированных ядом кобры и крайта, нейтрализовали летальные эффекты этих ядов с хорошей эффективностью на мышиной модели. Эти результаты показывают, что антитела, полученные от уток, могут служить новым источником для создания противоядий.

Вирус Анд (ANDV) является преобладающей причиной хантавирусного легочного синдрома (HPS) в Южной Америке и единственным известным хантавирусом, который передается от человека к человеку. Не существует вакцин, профилактических или терапевтических средств для предотвращения или лечения этого высокопатогенного заболевания (летальность 35–40%). Модельными животными для изучения этой патологии являются сирийские хомячки. R. Brocato и соавт. [49] использовали технологию ДНК-⁠вакцин для получения поликлональных иммуноглобулинов утки, укороченных до IgY (ΔFc), что делает их минимально реактогенными для человека. Антитела IgY/⁠IgYΔFc, выделенные из яиц ДНК-⁠вакцинированных уток, эффективно нейтрализовали ANDV in vitro, что было показано в тесте нейтрализации бляшек. Введение 12 000 NAU/⁠кг IgY/⁠IgYΔFc, полученных из утиных яиц, защищало хомяков при введении в течение 8 дней после интраназального заражения и 5 дней после внутримышечного заражения. Подтверждена возможность использования технологии ДНК-⁠вакцинации в сочетании с системой утка—яйцо для производства продукта, который может дополнять или заменять лечение плазмой переболевших HPS. Предлагаемая терапия может масштабироваться по мере необходимости и устраняет зависимость от использования ограниченного количества продуктов крови, полученных от небольшого числа выживших после HPS.

Практика применения яиц гусынь в иммунологических исследованиях

Гуси (Anser anser domesticus или Anser cygnoides domesticus, два отдельных вида гусей) в Европе, Африке и западной Азии и домашние гуси произошли от серого гуся (Anser anser). В Восточной Азии домашние гуси произошли от гуся-⁠лебедя (Anser cygnoides), они широко известны как китайские гуси. Оба вида были широко представлены в обоих районах и могут состоять либо из видов, либо из гибридов между ними [50]. Так же как и у уток, гусиные иммуноглобулины в сыворотке и желтках представлены двумя формами — IgY и IgY (ΔFc). От других видов сельскохозяйственной птицы гуси отличаются относительно более поздней половой зрелостью, которая наступает у них в 8–10 мес и зависит от комплекса внешних условий развития, кормления, температуры атмосферы и породности. Продолжительность жизни гусей составляет от 20 до 32 лет и более, хотя на птицефабриках эти сроки не являются рентабельными [51, 52]. Гусыня в среднем может снести за год 40–60 яиц. При правильном кормлении некоторые породы пернатых выдают до 150 штук яиц в год. Нормальная масса гусиных яиц составляет 196–252 г, на желток приходится 31% от массы яйца.

В настоящее время селекционерами выведено большое количество гибридов китайских и европейских пород гусей, отличающихся высокой яйценоскостью, например, инбредный гибрид немецкой эмбденской, королевской китайской и королевской английской пород, который используется также и в научных исследованиях.

При изучении лихорадки Зика установлено, что сыворотка выздоравливающих в условиях in vivo обладает нейтрализующей активностью из-⁠за наличия большого количества специфических к вирусу антител [53], но из-⁠за антителозависимого усиления инфекции (antibody-⁠dependent enhancement, ADE) антитела не могут выполнять протективную функцию в условиях in vitro. Чтобы противодействовать ADE при инфекции Зика, можно использовать моноклональные антитела с мутацией LALA [замена лейцина (L) на аланин (A) в положениях 234 и 235 в области Fc антитела IgG], поскольку они не могут связываться с Fc-⁠γ-⁠рецептором клеток (FcγR). Следовательно, такие моноклональные антитела могут устранять ADE в условиях in vitro и in vivo [54]. Однако антитела из желтков яиц водоплавающей птицы также не взаимодействуют с FcγR млекопитающих. Поэтому K.L. O’Donnell и соавт. [55] проверяли возможность подавления ADE специфическими антителами, выделенными из гусиных яиц. Авторы показали, что олигоклональные IgY-⁠антитела способны нейтрализовать вирус Зика у мышей. При концентрации специфического IgYΔFc 25 мкг/⁠мл наблюдалась 50% нейтрализация активности антител. Авторы показали, что предлагаемые поликлональные специфические IgYΔFc-⁠гусиные антитела могут обеспечивать эффективную пассивную иммунотерапию инфекции Зика без индукции ADE и без применения процедуры получения моноклональных антител. Таким образом, специфические IgYΔFc-⁠антитела, полученные из яиц самок гусей, не взаимодействуют с Fc-⁠рецепторами млекопитающих и не активируют систему комплемента млекопитающих, поэтому они не запускают ADE и неблагоприятные воспалительные реакции.

Хантавирусный легочный синдром (HPS) вызван андским вирусом в Южной Америке. Исследования в Чили показывают, что пассивный перенос плазмы выздоравливающего человека является многообещающим в качестве возможного лечения HPS. Однако доступность реконвалесцентной плазмы от выживших после этой смертельной болезни очень ограничена. Поэтому N. Haese и соавт. [56] применили пассивную иммунизацию специфическими гусиными IgYΔFc-⁠антителами. Гусынь вакцинировали ДНК-⁠вакциной, кодирующей гликопротеины оболочки вируса. У всех экспериментальных птиц вырабатывались нейтрализующие антитела с высоким титром после 2-⁠й вакцинации 1:100 000 в ИФА, а также вирус-⁠нейтрализации. Эти антитела обладали высокой реактивностью в отношении специфических аминокислотных последовательностей гликопротеинов оболочки хантавируса. Изучение защитной эффективности антител IgYΔFc проводили на модели летального HPS у хомяков. IgYΔFc, очищенные из яиц, пассивно переносили хомякам подкожно, начиная с 5-⁠го дня после внутримышечного заражения вирусом. IgYΔFc-⁠антитела, полученные из иммунных яиц, защищали хомяков от летального исхода. Напротив, у всех хомяков, получавших IgYΔFc от нормальных (интактных) гусынь, развился летальный HPS. Эти результаты демонстрируют, что ДНК-⁠вакцина/⁠гусиная платформа может быть использована для производства противовирусного биологического продукта-⁠кандидата, способного предотвратить смертельную болезнь при постконтактном введении.

Страусы и практика применения их яиц в иммунологических исследованиях

Страусы (Struthino camelus). Африканские страусы как вид (Struthino camelus) были известны в Древнем Египте около 300 лет до н.э. Их разводили как культовую птицу для получения красивых перь­ев, для упряжи в колесницы и для верховой езды.

Черный африканский страус (Struthino camelus domesticus) является результатом скрещивания малийского страуса с южно-⁠африканским. Продолжительность жизни этих птиц составляет 60–70 лет. Самка продуктивна в течение 30 лет. На ферме птенцы страуса становятся половозрелыми в возрасте 2 лет, а в дикой природе — 4 лет. Яйценоскость самок страуса в естественной среде составляет 5–18 яиц в год, а одомашненных птиц — 50–110 яиц, но чаще всего это 40–60 яиц. Возраст максимальной яйценоскости колеблется от 7 до 11 лет [57]. Средняя масса одного яйца составляет 1500–1900 г, а отдельные экземпляры доходят до 2200 г. Инкубационный период (42 дня) намного длиннее, чем у других видов птиц. Средняя масса желтка составляет 340 г, или 21% к массе яйца, что значительно ниже, чем у других видов птиц [58].

M. Tsukamoto и соавт. [59] исследовали потенциал использования страусов для крупномасштабного и экономичного производства нейтрализующих IgY-⁠антител к вирусам пандемического свиного гриппа A/⁠H1N1. Самки страусов вырабатывали антитела после иммунизации вирусом свиного гриппа. Из одного желтка было выделено до 4 г IgY, это указывает, что от одной самки страуса за 1 год можно собрать 400 г антител. Поскольку нейраминидаза необходима для связывания вируса с клетками хозяина и проникновения в клетки, антигены нейраминидазы широко используются при вакцинации против гриппа у людей. Авторы утверждают, что ингибирование антигенов нейраминидазы IgY-⁠антителами страуса защищает хозяина от вирусной инфекции. Эксперименты с использованием культуры клеток MDCK подтвердили это предположение. Заражение клеток MDCK вирусом пандемического гриппа было резко подавлено антителами. Следовательно, антитела могут нейтрализовать проникновение вируса пандемического гриппа A/⁠H1N1 в клетки, блокируя активность нейраминидазы, что приводит к избавлению клеток от вирусной инфекции. M. Tsukamoto и соавт. провели дополнительные исследования в области создания воздушных фильтров для обеззараживания лабораторных помещений и индивидуальных защитных масок для персонала. Для этого страусиные IgY-⁠антитела были нанесены в виде глазури на подложки для создания новых фильтров, обеспечивающих защиту от вируса гриппа за счет реакций антиген—антитело. Таким образом, большое количество нейтрализующих антител к вирусам гриппа было произведено экономически эффективным способом, что указывает на потенциальное использование страусиных антител в промышленных целях. Авторы считают, что фильтры, пропитанные страусиными антителами, станут мощным инструментом защиты от вирусов пандемического гриппа в виде промышленных фильтров или индивидуальных масок.

Гормон дигидротестостерон (DHT) и фермент 5α-⁠редуктаза являются ключевыми факторами выпадения волос из-⁠за андрогенной алопеции (AGA). Поэтому у людей с облысением уровень дегидротестостерона (которого особенно много в коже скальпа) выше нормы. Кроме того, к выпадению волос причастны кожные бактерии и их токсины. Y. Tsukamoto и соавт. [60] провели исследование и терапию AGA, в основе которой было лечение волосяных покровов головы добровольцев с использованием IgY-⁠антител страуса, направленных к DHT и 5α-⁠редуктазы, а также патогенным бактериям Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, которые усугубляют течение AGA. Авторы разработали препарат страусиных антител на спиртовой основе, который оказался удобным и простым в использовании. Было высказано предположение, что антитело страуса эффективно связывается с факторами выпадения волос в тканях кожи и нейтрализует их, что приводит к эффективному росту волос. Основываясь на сравнении с результатами, опубликованными в литературе [61], можно сделать вывод, что страусиные антитела значительно более эффективны, чем использование миноксидила и финастерида, традиционно применяемых для лечения AGA. Сравнительное исследование показало, что применение 5% раствора миноксидила приводило к увеличению количества волос примерно на 30% по сравнению с 71% в эксперименте, описанном Y. Tsukamoto и соавт. Страусы как сельскохозяйственные птицы обладают потенциалом не только в плане получения мяса, яиц, кожи и перьев, но и в качестве производителей иммунных яиц, использование которых эффективно при создании терапевтических препаратов в медицине и ветеринарии, вместо IgG лошадей, коров, ослов, баранов, коз и других млекопитающих, часто используемых для пассивной иммунизации, но обладающих рядом недостатков. В таблице 1 приведена обобщенная информация о результатах исследования IgY-⁠антител к различным патогенам, полученным от разных видов птиц.

Заключение

Таким образом, в технологии IgY достигнут значительный прогресс за последние два десятилетия, и ее можно применять в диагностических, профилактических или лечебных целях. Эта технология вызвала большой интерес у исследователей, особенно за последние 10 лет. Кроме того, развитие лабораторных методов и применение других технологий в этой области привело к тому, что технология gY стала более зрелой для промышленного производства специфических антител и коммерциализации. IgY-⁠технологии — относительно новое направление в иммунологии, основанное на технологии пассивной иммунизации E. Behring, но недостаточно оцененная в России. Замена IgG млекопитающих на птичьи трансовариальные IgY позволяет нарабатывать коммерчески значимые количества специфических антител, не вызывающих ADE, расширяет возможности методов пассивной иммунизации для лечения поражений, вызываемых вирусами, бактериями и токсинами.