Опыт применения хлопковых крыс для моделирования респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и иммунопатологии

Введение

Экспериментальные модели респираторно-синцитиальной вирусной (РСВ) инфекции являются инструментом для понимания патогенеза заболевания и оценки безопасности и эффективности новых средств терапии и профилактики. В конце 1960‑х годов, в эпоху, предшествующую широкому использованию экспериментальных моделей, разработчики формалин-инактивированной вакцины против РСВ-инфекции (ФИ-РСВ) столкнулись с феноменом вакциноассоциированного усиления респираторного заболевания, которое имело трагические последствия для вакцинированных детей младшего возраста при встрече с РСВ-инфекцией [1]. Наблюдаемое явление впоследствии было смоделировано на животных и оказалось напрямую связано с развитием иммунопатологии [2], которая характеризовалась дисбалансом цитокинов и иммунного ответа по Th2/⁠Th17‑типу, формированием ненейтрализующих антител, эозинофилией и нейтрофилией [3]. Особенностью РСВ-инфекции является отсутствие прямой связи между вирусной нагрузкой в респираторном тракте и тяжестью течения заболевания, которая в большей мере зависит от реакции иммунной системы на инфекцию [4], что существенно ограничивает использование тестов in vitro для разработки средств терапии и профилактики РСВ-инфекции. Некоторые исследования in vitro позволяют оценить отдельные компоненты развития иммунопатологической реакции как, например, профиль цитокинов, синтезируемых мононуклеарными клетками периферической крови при РСВ- инфекции в ответ на различные антигены [5]. Также описано исследование in vitro врожденного иммунного ответа на различные вакцины против РСВ с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов человека (moDC) и культуры аллогенных Т-клеток. Результаты исследования [6] в отношении баланса Т-клеточного ответа на вакцины были схожи с данными, полученными на моделях животных. В перечисленных случаях для моделирования использованы клетки взрослых доноров, уже контактировавших с РСВ в течение жизни, в то время как группу риска развития иммунопатологии составляют дети раннего возраста, не контактировавшие с РСВ [7]. Поэтому наиболее надежным способом, позволяющим оценить развитие вакциноассоциированного усиления патологии при РСВ-инфекции, остается использование нативных животных.

Хлопковые крысы, мыши, овцы, сирийские хомяки, шиншиллы, морские свинки, хорьки и нечеловекообразные приматы используются для моделирования РСВ-инфекции [8]. Из всех мелких животных хлопковые крысы (Sigmodon hispidus) наиболее восприимчивы к РСВ-инфекции и превосходят таковую у большинства лабораторных линий мышей, которые демонстрируют значительные вариации восприимчивости к РСВ от штамма к штамму [9]. При иммунизации хлопковых крыс ФИ-РСВ последующая инфекция вызывает у животных признаки иммунопатологии и вакцино-ассоциированного усиления респираторного заболевания, схожие с наблюдаемыми во время испытаний подобной вакцины у детей [10, 11]. Хлопковые крысы несут функциональный набор генов, кодирующих белки Mx1 и Mx2, которые являются важнейшими компонентами врожденной системы противовирусной защиты человека [12, 13], что особенно значимо при испытаниях интраназальной вакцины на основе аттенуированного гриппозного вектора, которая в большой степени направлена на активацию врожденного компонента иммунного ответа [14].

Цель данного исследования — воспроизведение и отработка параметров модели РСВ-инфекции и иммунопатологии на хлопковых крысах для последующего применения в изучении специфической активности векторной вакцины против РСВ.

Материал и методы

Экспериментальные животные

Хлопковые крысы (Sigmodon hispidus) самки, возраст 5–8 нед были получены из питомника Envigo Inc. (США) с соответствующим ветеринарным свидетельством. Животных содержали в условиях вивария в соответствии с ГОСТом 33215–2014 и СП 2.2.1.3218–14; все работы проводили согласно СП 1.3.2322–08 и документов «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Международные рекомендации (биоэтический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Процедуры, проводимые с животными, были одобрены Комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России (протокол № 21 от 29.06.20).

Животных содержали в индивидуальных автоклавируемых поликарбонатных клетках (BENEX а.с., Чешская Республика), тип Т3А, площадь 800 см², в которых, помимо стерилизованного подстила Lignocell Wood Fibers (JRC, Германия), также размещали укрытие (цилиндр из ПВХ-трубы диаметром 11 см, стерилизация автоклавированием) и материал для гнездования (бумажные салфетки), необходимые для снижения уровня стресса у животных [15]. Животные получали без ограничений пищу, состоящую из смеси полноценного лабораторного корма (ООО «Лабораторкорм», Россия) и корма для хомяков (Versele-Laga, Бельгия). Животных обеспечивали чистой питьевой водой, полученной при помощи системы водоподготовки (Millipore RiOs 50, США), которую наливали в стандартные поилки со стальными крышками-носиками, и кормом ad libitum. Контроль параметров окружающей среды осуществляли ежедневно на всем протяжении исследования, включая контроль температуры и влажности. Фотопериод составлял 12 ч — ночь, 12 ч — день при искусственном освещении лампами дневного света. В период карантина (7 дней) и при экспериментальном заражении (7 дней) проводили ежедневный мониторинг массы тела животных.

Респираторно-синцитиальный вирус

В работе использовали респираторно-синцитиальный вирус серотипа А штамм А2 (РСВ A2), полученный из коллекции International Reagent Resource (США). Вирус накапливался в клетках НЕр-2 (ATCC, США). Инфекционную активность вируса определяли по количеству бляшкообразующих единиц (БОЕ) методом титрования в клетках HEp-2 в 24‑луночных культуральных планшетах (Nunc, Дания). Клетки заражали 10‑кратными разведениями вируссодержащего материала, инкубировали 1 ч при 37 °С, после чего вносили полужидкое покрытие, содержащее питательную среду c 0,3% агарозой (NBCo, США). Планшеты инкубировали 4 сут при температуре 37 °С, 5% СО₂, затем клетки фиксировали 80% ацетоном и окрашивали моноклональными антителами 4F2 к белку F РСВ [16]. Подсчет количества бляшек проводили визуально. Титр рассчитывали как произведение усредненного числа бляшек на использованное разведение и выражали в десятичных логарифмах lg БОЕ/⁠мл.

Иммунизация животных прототипом ФИ-РСВ

Для подготовки прототипа ФИ-РСВ вирус РСВ А2 накапливали в культуре клеток НЕр-2, затем инактивировали добавлением 1:4000 формалина (Вектон, Россия) в течение 72 ч при 37 °С. Далее проводили очистку вируса методом ультрацентрифугирования в роторе SW-41 (Beckman, США) в режиме 36 000 rpm (~190 000 g), 4 ч, при 4 °С через подушку из 30% сахарозы (Amresco, США). Концентрацию общего белка в очищенном инактивированном вирусе измеряли с использованием набора реагентов Quant-iT Protein Assay Kit и флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Для иммунизации животных готовили препарат, содержащий в одной дозе 10 мкг очищенного формалининактивированного вируса и 100 мкг адъюванта гидроксида алюминия (Sigma, США), разведенные в среде без сыворотки в общем объеме 100 мкл.

Иммунизацию хлопковых крыс прототипом ФИ-РСВ проводили за 5 нед до заражения, животным внутримышечно вводили 10 мкг очищенного инактивированного РСВ, адсорбированного на 100 мкг гидроксида алюминия в течение 4 ч при 4 °C.

Заражение животных

Экспериментальное заражение хлопковых крыс проводили интраназально двумя способами — без наркоза и под легким изофлурановым наркозом. Для проведения манипуляций животное обездвиживали путем V-образного захвата (рис. 1). В качестве наркоза использовали смесь изофлурана и пропиленгликоля [17]. Для заражения под наркозом переднюю часть головы хлопковой крысы помещали в стеклянный конус, в котором располагали два слоя марли — первый слой, смоченный смесью изофлурана и пропиленгликоля (1:1), и второй сухой слой, как описано в [18]. О действии наркоза судили по расслаблению и опусканию задних конечностей, после чего животное располагали горизонтально и вводили вируссодержащую жидкость в носовые ходы в объеме 100 мкл. При заражении без наркоза обездвиженному и горизонтально расположенному животному вводили интраназально 50 мкл вируссодержащего материала. После заражения ежедневно контролировали массу тела. Плановую эвтаназию животных проводили путем помещения в СО₂‑бокс (VetTech Solutions Auto CO₂ Workstation, США) и последующей цервикальной дислокации. Образцы тканей верхних и нижних дыхательных путей были получены на 4, 5 или 6‑й день после заражения и проанализированы на репродуктивность вируса. Также ткань легких подвергали гистопатологическому анализу.

Гистологическое исследование

Гистологическому анализу были подвергнуты парафиновые срезы легких хлопковых крыс, окрашенные гематоксилином и эозином. Полуколичественный анализ ткани легких был выполнен в двух вариантах со следующей оценкой степени повреждений: 0 — отсутствие; 1 — минимальные повреждения; 2 — незначительные; 3 — умеренные; 4 — выраженные; 5 — тяжелые. При этом визуально оценивали общий процент пораженной ткани легких на срезе, а также выраженность острого воспаления и инфильтрацию лимфоцитов отдельно для функциональных элементов ткани легкого — бронхиол, сосудов, интерстиция и альвеол. Суммарный индекс поражения рассчитывали как максимальный индекс, полученный при анализе различных элементов. Также оценивали наличие и выраженность следующих характерных изменений элементов ткани — гипертрофию и гиперплазию эпителия, атипию плоского эпителия, некроз эпителия (первые четыре признака оценивали отдельно для бронхов и бронхиол), гипертрофию пневмоцитов II типа, гиперемию межальвеолярной перегородки, альвеолярную эмфизему, альвеолярную геморрагию, бронхит, бронхиолит, перибронхит, перибронхиолит, инфильтрацию интерстиция, альвеолит, васкулит, периваскулит.

Морфометрическую оценку количества эозинофилов проводили не менее чем в 10 полях зрения от каждого образца при увеличении в 200 раз. Морфометрическую оценку количества бокаловидных клеток проводили путем подсчета количества клеток в пересчете на 1 мм² эпителия воздухоносных путей. Для морфометрической оценки количества эозинофилов и бокаловидных клеток выбирали поля зрения с наибольшим количеством оцениваемых клеток.

Анализ данных

Статистический анализ первичных данных проводили в программных пакетах Microsoft Office Exсel 2010 (США) и GraphPad Prism v6.01 (США). Для графического представления динамики массы тела хлопковых крыс у каждого животного вычисляли относительное значение массы тела в процентах к массе в 1‑й день, затем вычисляли среднее арифметическое, стандартное отклонение (СО) и строили кривую зависимости группового среднего от дня после начала эксперимента. Для графического представления вирусной нагрузки использовали логарифмированные данные, представленные на точечных диаграммах.

Результаты и обсуждение

Получение и адаптация хлопковых крыс

Наиболее длительным этапом в работе с хлопковыми крысами был период времени, затраченный на переговоры с питомником и подготовку документов для получения животных, который в совокупности занял около 5 мес. По прибытии животных размещали в отдельном помещении вивария в индивидуальных клетках. Такой способ размещения связан с тем, что хлопковые крысы сохраняли поведенческие реакции диких животных, избегали контакта, быстро передвигались, что существенно затрудняло проведение манипуляций. Несмотря на стресс во время транспортировки, хлопковые крысы быстро адаптировались к новым условиям и начали стабильно набирать массу тела с первых суток карантинного периода. В период адаптации никаких отклонений в состоянии и поведении животных отмечено не было. За время 7‑дневного карантина масса тела хлопковых крыс в среднем увеличилась с 41±5 до 49±5 г (рис. 2, область выделена голубым).

Подбор оптимальной инфекционной дозы РСВ при моделировании инфекции у хлопковых крыс

Для моделирования РСВ-инфекции проводили заражение хлопковых крыс двумя инфекционными дозами РСВ — 5 или 6 lg БОЕ/⁠животное. Заражение проводили интраназально (см. рис. 2) без наркоза (по 4 животных на 1 экспериментальную точку) или под изофлурановым наркозом (по 3 животных на 1 точку). В течение 6 дней после заражения животных ежедневно взвешивали, на 4‑й и 6‑й день после заражения часть животных вскрывали, извлекали легкие, носовые ходы и трахею, в которых определяли наличие инфекционного вируса. Из соображений гуманности в высокой дозе под наркозом заражали только 2 животных, которых вскрыли на 5‑й день эксперимента.

По итогам наблюдения у животных, зараженных без наркоза, вне зависимости от инфекционной дозы наблюдали тенденцию к приросту массы тела, который, однако, был более медленным по сравнению с интактными животными. При этом максимальные различия между группами были зафиксированы на 6‑й день инфекции (рис. 3а). Инфекция под наркозом в дозе 5 lg БОЕ не отразилась на значениях массы тела хлопковых крыс (рис. 3б). В группе с высокой заражающей дозой вируса (6 lg БОЕ) наблюдали отрицательную динамику массы тела животных, достигшую 10% от исходного уровня к концу периода наблюдения (см. рис. 3б).

Выделение инфекционного вируса в носовых ходах было зафиксировано у всех животных, получивших РСВ без наркоза, на 4‑й день после заражения вне зависимости от заражающей дозы. Вирусовыделение из верхних дыхательных путей было на уровне 3–4 lg БОЕ/⁠мл суспензии органа (рис. 4а). На 6‑й день после заражения вирус обнаружен в носовых ходах у 2 (из двух) животных, зараженных высокой дозой вируса (6 lg БОЕ/⁠животное), и у 1 (из двух), зараженных низкой дозой (5 lg БОЕ/⁠животное). В легких инфекционный вирус обнаружен только у 2 животных (в разные дни, разные дозы заражения), в трахее — только у 1 животного из группы с низкой заражающей дозой на 6‑й день. Выделение инфекционного вируса в носовых ходах зафиксировано у всех животных, получивших РСВ под наркозом, примерно на одном уровне, составляющем 3–4 lg БОЕ/⁠мл суспензии ткани, вне зависимости от заражающей дозы (рис. 4б). У всех животных, зараженных в дозе 5 lg БОЕ, зафиксирован инфекционный вирус в нижних отделах респираторного тракта, — трахее и легких. У хлопковых крыс, зараженных в дозе 6 lg БОЕ, на 5‑е сутки после инфекции вирусовыделение из легких не отмечено или было на очень низком уровне, что, по‑видимому, связано с более ранним началом и высокой интенсивностью воспалительного процесса при заражении вирусом в высокой дозе.

По итогам данного раздела можно заключить, что интраназальное введение вируса под наркозом необходимо для моделирования РСВ-инфекции в нижних дыхательных путях хлопковых крыс, так как заражение без наркоза приводит к вирусной репликации только в верхних дыхательных путях.

Патологические изменения в легких хлопковых крыс при заражении РСВ и вакциноассоциированном усилении инфекции

Для моделирования иммунопатологии на фоне РСВ-инфекции часть хлопковых крыс была иммунизирована прототипом ФИ-РСВ за 5 нед до заражения. После введения вируса в дозе 5 lg БОЕ у животных зарегистрировано снижение массы тела в среднем на 5% от исходного уровня в течение 6 дней (см. рис. 3б). При этом иммунизация прототипом ФИ-РСВ полностью предотвратила появление инфекционного вируса в нижних отделах респираторного тракта, а в носовых ходах вирус выделялся только на 4‑е сутки после заражения в среднем титре 3,5±1,2 lg БОЕ/⁠мл. По данным аналогичных исследований, описанных в литературе [19], иммунизация хлопковых крыс оригинальным препаратом ФИ-РСВ (lot 100) приводила к частичному снижению вирусной нагрузки в легких животных. При этом до конца неясна доза РСВ-антигена, входящего в состав оригинального препарата, и исследователи оперируют разведениями исходного материала (1:25, 1:125), а не конечной концентрацией вирусного белка [10]. Однако для вакцин на основе рекомбинантных белков показана зависимость между вирусной нагрузкой в легких и дозой антигена. Так, например, иммунизация хлопковых крыс рекомбинантным белком F в дозе 0,5–5 мкг/⁠животное полностью предотвращала репродукцию РСВ в легких [20, 21]. Можно предположить, что полное подавление вирусной нагрузки в нашем исследовании также связано с высокой дозой антигена, которая составляла 10 мкг ФИ-⁠РСВ/⁠животное.

Другая картина наблюдалась при гистологическом анализе срезов легких животных, привитых прототипом ФИ-РСВ и далее зараженных РСВ, по сравнению с непривитыми зараженными животными (рис. 5). Степень выраженности патологических изменений в легких непривитых крыс, зараженных под наркозом в дозе 5 lg БОЕ, была умеренной, проявлялась в незначительной смешанно-клеточной инфильтрации интерстициальной ткани и альвеолярных перегородок; наблюдалась гиперплазия бронхиального и бронхиолярного эпителия, сопровождавшаяся развитием слабо выраженного и умеренного бронхита. У крыс, иммунизированных прототипом ФИ-РСВ, степень выраженности и частота встречаемости отмеченных выше патологических изменений была выше, чем у контрольных животных. С большей частотой наблюдался альвеолит, сопровождавшийся накоплением в просвете альвеол клеток мононуклеарного ряда. В целом картина поражений совпадала с описанной ранее в литературе [20]. У животных группы ФИ-РСВ наблюдались тяжелые перибронхиальные и перибронхиолярные смешанно-клеточные инфильтраты с вовлечением в воспалительный процесс большого количества эозинофилов. Также регистрировалось утолщение интерстициальной ткани легких и альвеолярных перегородок с диффузно-очаговой полиморфно-клеточной воспалительной инфильтрацией, сопровождавшейся развитием выраженного альвеолита с накоплением в просвете альвеол большого количества альвеолярных макрофагов, лимфоцитов, в умеренном количестве дегенеративно-измененных и активированных нейтрофилов, эозинофилов с признаками частичной дегрануляции.

Проведенная полуколичественная оценка морфометрических показателей повреждения различных элементов ткани легких показала усиление респираторной патологии у животных, иммунизированных прототипом ФИ-РСВ, по сравнению с животными из группы контроля заражения (рис. 6а, б). У животных, привитых прототипом ФИ-РСВ, наблюдалось повышенное количество эозинофилов и бокаловидных клеток в ткани (рис. 6в, г), что является классическим маркером вакцино-ассоциированного усиления патологии при РСВ-инфекции [20]. В целом использованный подход (предварительная иммунизация хлопковых крыс прототипом ФИ-РСВ) позволил смоделировать эффект вакцино-ассоциированного усиления респираторной патологии при последующем заражении РСВ.

Обсуждение результатов

Модель респираторно-синцитиальной вирусной (РСВ) инфекции у хлопковых крыс была впервые описана в 1971 г. группой советских ученых, показавших высокую восприимчивость животных к респираторно-синцитиальному вирусу и развитие патологии в респираторном тракте [22]. Несколько лет спустя модель была воспроизведена в США и дополнена исследованиями зависимости тяжести инфекции от возраста животных [23, 24]. Позднее на данных животных удалось воспроизвести вакцино-ассоциированное усиление респираторной патологи при РСВ-инфекции [25], что определило выбор хлопковых крыс в качестве незаменимой модели при исследованиях данного эффекта.

Несмотря на давнюю историю и достоинства модели хлопковых крыс, применение этих животных имеет целый ряд ограничений. Хлопковые крысы сложны в содержании и при проведении манипуляций, поскольку сохранили поведенческие реакции диких животных, избегают контакта, быстро передвигаются, а также способны высоко прыгать [26]. В нашем опыте обучение обращению с животными занимало в среднем 2–3 дня на каждого оператора. Дополнительную сложность вносило отсутствие необходимых обучающих ресурсов на русском языке. Для освоения способов проведения манипуляций с хлопковыми крысами мы использовали ресурсы на английском языке [18, 26, 27], при этом критическое значение имели видеозаписи [15, 28].

Кроме того, существует лишь весьма ограниченное количество питомников хлопковых крыс. В России и Европе таких питомников в настоящее время нет. В связи с этим первые контакты с дистрибьютором хлопковых крыс были инициированы за год до эксперимента. Время от начала переговоров по соглашению до доставки хлопковых крыс из питомника Envigo Inc. (США) в виварий института составило около 5 мес, однако на длительность этого периода, очевидно, могла повлиять пандемия COVID-19.

Несмотря на описанные трудности, нам удалось получить хлопковых крыс, адаптировать их и воспроизвести у них инфекцию верхних и нижних дыхательных путей при интраназальном заражении РСВ. У большинства хлопковых крыс, зараженных без наркоза, экспериментальная инфекция была ограничена преимущественно верхней частью респираторного тракта и не приводила к появлению существенных микро- и макроскопических патологических изменений в легких независимо от заражающей дозы. При интраназальном заражении хлопковых крыс под наркозом наблюдаемые признаки инфекции были дозозависимыми, вирусовыделение наблюдалось как в верхней, так и в нижней части респираторного тракта, в легких выявлялись гистологические признаки поражения. Заражение в высокой дозе (6 lg БОЕ на животное) приводило к развитию выраженных макропоражений в легких и существенному ухудшению состояния животных. Предварительная иммунизация хлопковых крыс прототипом препарата формалин-инактивированной вакцины ограничивала репликацию вируса в респираторном тракте животных, однако приводила к усилению гистологических признаков поражения в легких, что свидетельствует о проявлении вакциноассоциированной иммунопатологии.

Заключение

В целом в рамках данного исследования успешно смоделирован инфекционный процесс при заражении хлопковых крыс респираторно-синцитиальным вирусом, в том числе воспроизведено вакциноассоциированное усиление респираторной патологии, что позволит использовать данную модель для изучения защитных свойств и безопасности вакцин против респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.