Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов мышей и их абсолютным значениям
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Рощина Е.А. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов мышей и их абсолютным значениям. Лабораторные животные для научных исследований. 2022; 3. https://doi.org/10.57034/2618723X-2022-03-03
Резюме
Анализ массы органов в токсикологических исследованиях является важной конечной точкой для выявления органов-мишеней тестируемых объектов. В настоящей статье определены референсные интервалы для массовых коэффициентов органов аутбредных мышей (ICR CD-1), а также их абсолютных значений. Данные по массе органов мышей получены от животных контрольных групп токсикологических исследований, проведенных в АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» за период с 2017 по 2021 г. Возраст животных на момент некропсии составлял 12–18 нед. Исследования были выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики.
В соответствии с рекомендациями Общества токсикологической патологии (The Society of Toxicologic Pathology, STP) у экспериментальных мышей регистрировали массу следующих органов: печень, сердце, почки, головной мозг, селезенка, тимус, семенники. Дополнительно анализировали массу легких с трахеей. В связи с малыми размерами надпочечников и яичников массу данных органов не регистрировали.
Чтобы учесть биологические различия между животными, при статистическом анализе массы органов необходимо использовать массу тела животного. Расчет массовых коэффициентов относительно массы тела снижает диапазон полученных значений из‑за различий в массе тела у животных, в то же время резкое увеличение или уменьшение массы тела может привести к ложной интерпретации данных. При значительных изменениях массы тела могут быть полезны соотношения массы органов и мозга, поскольку масса мозга не меняется с изменением массы тела. Таким образом, существуют различные методы оценки массы органов в исследованиях токсичности, поэтому для формирования референсных интервалов анализировали массовые коэффициенты органов относительно массы тела и головного мозга, а также абсолютные значения массы органов.
Для данных был применен непараметрический метод определения референсных интервалов. В выборках по массовым коэффициентам органов количество значений в среднем было более 120, по абсолютным коэффициентам органов — более 60.
По соотношению выбросов массовых коэффициентов относительно массы тела животных и головного мозга у самок мышей различий не выявлено, но у самцов наименьшее количество выбросов установлено при расчете массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных.
Введение
Аутбредные линии мышей используют в качестве тест-системы в токсикологических, онкологических, инфекционных и фармакологических исследованиях. Аутбредная линия определяется не только как ограниченное поголовье животных с таким же незначительным приростом коэффициента инбридинга (менее 1% в поколение), но и с высокой степенью генетической изменчивости [1].
Мышей стали широко использовать в лабораторных целях, так как они имеют следующие характеристики:
1) некоторые схожие анатомические и физиологические особенности с людьми, а также успешное секвенирование их генома, позволяющее выполнять моделирование патологий;
2) относительно короткий репродуктивный цикл, который обеспечивает доступ к воспроизводству большого количества особей за короткий промежуток времени.
На данный момент существует много источников литературы, касающихся оптимальных требований к питанию и условиям содержания, что также является преимуществом для данной тест-системы.
Одним из главных недостатков является небольшой размер животных, что затрудняет выполнение ряда процедур, таких как введение объектов исследования, отбор образцов крови и мочи, некоторые аспекты некропсии [2].
Регистрация массы органов является важной частью данных исследований. Общество токсикологической патологии (STP) рекомендует регистрировать массу печени, сердца, почек, головного мозга, селезенки, тимуса, семенников и яичников, а также надпочечников у мышей, задействованных в токсикологических исследованиях [3]. Однако регистрация массы яичников и надпочечников при практической реализации оказывается не выполнима ввиду их малого размера и отсутствия средств измерений с достаточной точностью. Для получения дополнительной информации можно регистрировать массу легких с трахеей.
Цель настоящей работы — определение референсных интервалов массовых коэффициентов органов, рассчитанных относительно массы тела и головного мозга, и абсолютных значений массы органов аутбредных мышей.
Материал и методы
Для расчета референсных интервалов использованы данные, полученные от контрольных/интактных групп токсикологических экспериментов в период с 2017 по 2021 г. Все исследования проведены в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) [4], и правилами надлежащей лабораторной практики.
Во всех экспериментах модельным объектом являлись аутбредные мыши линии ICR (CD1) в возрасте 12–18 недель (всего 124 самца и 128 самок), предоставленные АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ». Самки не являлись беременными и рожавшими. Животных содержали в стандартных условиях: температура в помещении 18–26 °C, относительная влажность воздуха 45–65%, 12‑часовой световой день, группы размещали в стандартных пластиковых клетках на подстиле, площадь пола клетки содержания на одно животное соответствовала регламентирующим стандартам [5]. Эвтаназию выполняли в рамках проводимых исследований при помощи диоксида углерода (СО2) с последующим удалением жизненно важных органов (легкие, сердце, головной мозг). В течение эксперимента доступ к корму и воде не был ограничен, за исключением 4 ч перед эвтаназией. Массу тела определяли непосредственно перед некропсией. Процедуру взвешивания внутренних органов осуществляли на электронных весах «Adventurer» модель RV 214 («OHAUS», Китай). Максимальный предел взвешивания составлял 210 г, минимальный — 0,001 г. Цена поверочного деления 0,001 г. Класс точности 1.
Массовые коэффициенты относительно массы тела были рассчитаны по формуле:
(mо/mт)×100,
где mо — масса органа, mт — масса тела животного.
Для определения массовых коэффициентов относительно массы головного мозга использовали следующую формулу:
(mо/mгм)×100,
где mо — масса органа, mгм — масса головного мозга.
Полученные данные по массовым коэффициентам органов относительно массы тела и головного мозга были отдельно представлены для самцов и самок мышей. Данные по абсолютным значениям органов были разделены на 2 группы в зависимости от массы тела животных (самцы: 24–31 и 32–42 г — по 62 особи, самки: 20–28 г — 63, 29–40 г — 65), так как при расчете коэффициентов используется масса тела и при анализе можно рассматривать результаты, не учитывая массу тела, но в случае с абсолютными значениями необходимо отталкиваться от показателей массы тела животных.
Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica 10 (StatSoft, США). Статистические выбросы оценивали при помощи метода Тьюки. Референсные интервалы определяли непараметрическим методом.
Результаты и обсуждение
По данным каждого органа отдельно определяли статистические выбросы, лежащие за пределами интервала
(Q1–1,5IQR)–(Q3+1,5IQR), где Q1 и Q3 — границы 1‑го и 3‑го квартилей, а IQR — межквартильный интервал (Q3–Q1) [6] (табл. 1). Обнаруженные выбросы были исключены из массива данных.
Референсные интервалы для полученных результатов были определены в промежутке 2,5–97,5‰, представленные в табл. 2 и 3 [7].
Ввиду возможного влияния тестируемых объектов на массу тела животных (в сторону снижения) при анализе полученных данных массовые коэффициенты органов, рассчитанные относительно массы тела, увеличиваются. В таких случаях можно выполнить анализ данных по массе органов относительно массы головного мозга, поскольку масса мозга не изменяется с увеличением или снижением массы тела. Также для исключения подобных ошибок можно выполнить анализ абсолютных значений массы органов.
Статистические выбросы, определенные методом Тьюки, при расчете массовых коэффициентов органов самцов и самок мышей относительно головного мозга и представлении абсолютных значений были исключены из массива данных. Общее количество выбросов представлено в табл. 4–6.
Соотношение выбросов, полученных при анализе массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных и массы головного мозга, у самок мышей не различалось. У самцов мышей меньшее количество выбросов выявлено при расчете массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных.
В табл. 7 и 8 представлены референсные интервалы по массовым коэффициентам органов, рассчитанных как отношение массы органа к массе головного мозга (данные представлены без деления на диапазоны масс).
Масса остальных органов зависит от массы тела, поэтому в случае анализа абсолютных значений массы органов данные были разделены на две выборки в соответствии с двумя интервалами массы тела животных (табл. 9 и 10).
Заключение
Одна из основных целей любого доклинического исследования токсичности — определение органов-мишеней. При анализе данных нужно учитывать, что чем меньше масса органа, тем больше погрешность его массы при взвешивании. Поэтому регистрация массы яичников и надпочечников у мышей является недостаточно точным показателем. При значительном снижении массы тела животного предпочтительнее использовать массовые коэффициенты органов относительно массы головного мозга.
Данные о массе органов следует оценивать в контексте всего исследования, включая изменение массы тела, фармакологического действия тестируемого препарата, данных клинико-лабораторных, макроскопических и микроскопических показателей.
Список источников
-
Shin H.J., Cho Y.M., Shin H.J. et al. Comparison of commonly used ICR stocks and the characterization of Korl: ICR // Laboratory Animal Research. 2017. Vol. 33. N. 1. P. 8–14. doi: 10.5625/lar.2017.33.1.8.
-
Gad S.C. Biomarkers in toxicology: Chapter 2. Rodents model for toxicity testing and biomarkers. Academic Press, 2017. P. 7–69. doi: 10.1016/B978‑0‑12‑404630‑6.00002-6.
-
Sellers R.S., Mortan D., Michael B. et al. Society of Toxicologic Pathology Position Paper: Organ Weight Recommendations for Toxicology Studies // Toxicologic Pathology. 2007. Vol. 35. N. 5. P. 751–755. doi: 10.1080/01926230701595300.
-
European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes, Strasbourg, 1986.
-
Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Восьмое издание / пер. с англ. Под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой. М.: ИРБИС, 2017. 336 с. [Rukovodstvo po soderzhaniyu I ispolsovaniyu laboratornykh zhivotnykh. Vos’moe izdanie / per. c angl. Pod red. I.V. Belozercevoi, D.V. Blinova, M.S. Krasil’shikovoi. M.: IRBIS, 2017. 336 p. (In Russ.)].
-
Луговик И.А., Макарова М.Н. Токсикологические исследования. Референтные интервалы массовых коэффициентов внутренних органов на выборке в 1000 аутбредных крыс // Лабораторные животные для научных исследований. 2021. № 1. С. 3–11 [Lugovic I.A., Makarova M.N. Toksicologicheskie issledovaniya. Referentnye intervaly massovykh koefficientov vnutrennykh organov na vyborke v 1000 autbrednykh krys // Laboratory animals for scientific research. 2021. N. 1. P. 3–11 (In Russ.)]. doi: 10.29296/2618723X-2021‑01‑01.
- Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов // Лабораторная служба. 2019. Т. 8. № 2. C. 36–44. doi: 10.17116/labs2019802136 [Evgina S.A., Savel’ev L.I. Sovremennye teoriya i praktika referentnykh intervalov // Laboratornaya sluzhba. 2019. Vol. 8. N. 2. P. 36–44 (In Russ.)].
Поиск
