Боровкова К.Е., Макарова М.Н. , Никифорова Л.Р., Салмова Ю.В. Модели грибковых инфекций на животных. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-03-05
С каждым годом количество инфекций, вызванных микроскопическими грибами, растет из-за повышения резистентности к различным противогрибковым препаратам и увеличения числа людей с ослабленной иммунной системой. Исследования на животных позволяют изучить патогенез, иммунологические реакции организма на грибковую инфекцию, тестировать новые противогрибковые соединения и многое другое. Наибольшее количество моделей грибковых инфекций связано с дерматофитами, кандидой и аспергиллами, так как они являются возбудителями большинства грибковых инфекций человека. В экспериментальных моделях используют различные виды животных от мелких грызунов до крупного рогатого скота. Наиболее предпочтительными животными, используемыми в исследованиях in vivo, являются мыши. Данный вид животных имеет ряд преимуществ, таких как большое разнообразие линий, небольшая стоимость, а также простота в содержании и удобство при проведении манипуляций. Однако этот вид животных подходит не для всех исследований. Например, морских свинок часто используют для тестирования противогрибковых соединений, применяемых против дерматофитов, так как строение их кожи близко к таковому у человека. При выборе вида животного необходимо учитывать тот факт, что большинство животных являются устойчивыми к возбудителям человеческих инфекций. Для того чтобы вызвать устойчивую инфекцию, у животных, как правило, подавляют иммунитет. Также при планировании исследования, кроме выбора животных и возбудителя, необходимо учитывать способы заражения и концентрацию возбудителя. Для формирования развития инфекционного процесса необходимо использовать способ заражения, близкий к естественному пути заражения. Помимо исследований грибковых инфекций на лабораторных животных, используются альтернативные модели на беспозвоночных. Данные модели не могут полностью заменить исследования на млекопитающих, но они применяются в качестве дополнительных для расширения знаний о грибковом патогенезе, изучения вирулентности грибов, а также открытия новых противогрибковых соединений. Таким образом, при планировании исследования грибковых инфекций in vivo необходимо учитывать множество факторов для получения инфекционного процесса с клиническими признаками, близкими к человеку.
Грибковые инфекции (микозы) – заболевания кожи, ногтей, слизистых оболочек, внутренних органов, вызванные различными видами грибов. Тяжелыми или хроническими грибковыми заболеваниями ежегодно во всем мире болеет около 150 млн пациентов, в результате которых умирает примерно 1,7 млн человек в год [1, 2]. Количество грибковых инфекций за последнее время увеличилось, в частности, из-за роста числа лиц с иммунодефицитом или тех, кто проходит иммуносупрессивное лечение. Также стали чаще регистрироваться глубокие висцеральные микозы, ассоциированные с ВИЧ-инфекцией, онкогематологической патологией, пересадкой органов, выхаживанием новорожденных, при этом возросла роль грибов, считавшихся ранее апатогенными [3]. Еще одним немаловажным фактором, затрудняющим лечение, является развитие устойчивости грибов к лекарственным средствам. Таким образом, все это представляет серьезную глобальную угрозу, что приводит к необходимости выполнения различных исследований по противодействию грибковым инфекциям и поиску новых эффективных лекарственных средств.
Из примерно 1,5–5,0 млн видов грибов на Земле только несколько сотен вызывает заболевания у людей и лишь немногие из них способны поражать здоровых людей [4]. Эпидемиология грибковых инфекций во многом зависит от типа больных (новорожденные, пожилые люди и т.д.), экологии патогенных грибов и распространенности грибов в окружающей среде. Люди ежедневно подвергаются воздействию многочисленных потенциальных грибковых патогенов, которые являются комменсалами или присутствуют в окружающей среде, при вдыхании, проглатывании и контакте [5]. Для того чтобы гриб мог паразитировать на человеке, должно быть выполнено 4 условия:
Грибы разделяют по форме на дрожжевые и нитчатые (плесневые) грибки. Дрожжи – это одноклеточные формы, которые размножаются почкованием, тогда как плесневые грибки образуют многоклеточные гифы. Грибы, имеющие более одной формы, называют диморфными. Диморфные грибы могут расти в виде дрожжей in vivo и in vitro при 37°C, а также, как и плесневые грибки, при 25°C. Диморфизм регулируется такими факторами, как температура, концентрация CO2, pH и уровень цистеина или других тиоловых соединений [6]. Более 600 видов грибов связано с болезнями, но <30 видов вызывает >99% инфекций. C 2013 г. международное общество LIFE (Leading International Fungal Education) собирает данные о грибковых инфекциях со всего мира. На портале LIFE предоставляется информация о грибках, грибковых инфекциях, диагностике и лечении. Согласно данным организации LIFE, большинство грибковых инфекций вызывается родами Trichophyton, Candida, Aspergillus и Cryptococcus. Также на их портале представлено разделение грибковых инфекций на 5 групп, в порядке уменьшения степени тяжести [7]:
1. Инвазивные грибковые инфекции, которые часто заканчиваются летальным исходом (криптококковый менингит, инвазивный аспергиллез, инфекция кровотока Candida, пневмоцистная пневмония).
2. Хроническая инфекция легких или глубоких тканей (хронический аспергиллез легких).
3. Аллергические грибковые заболевания (аллергический бронхолегочный аспергиллез, тяжелая астма с грибковой сенсибилизацией).
4. Инфекция слизистой оболочки (кандидоз полости рта и пищевода, кандидозный вагинит (молочница)).
5. Инфекция кожи, волос и ногтей (стригущий лишай, дерматомикоз, микоз стопы, онихомикоз).
В отечественной дерматологии пользуются классификацией Н.Д. Шеклакова (1976). В соответствии с ней выделяют 4 группы микозов и 5-ю группу так называемых псевдомикозов. К микозам относятся:
В группу псевдомикозов относят эритразму, нокардиоз и др. [8].
Наиболее часто грибковые инфекции классифицируют по клиническим проявлениям. Таким образом, грибковые инфекции подразделяют на поверхностные, подкожные, системные и оппортунистические микозы, что является наиболее простым и удобным вариантом классификации. На основании данных литературы [9–12] была составлена общая таблица микозов по клиническим проявлениям с указанием основных видов возбудителей грибковых инфекций (табл. 1).
В данной статье рассмотрим наиболее распространенные модели микозов, вызванных дерматофитами, кандидой и аспергиллами с использованием животных.
Дерматофития – это поверхностная грибковая инфекция, вызываемая нитчатыми грибами дерматофитами, которые проникают в ороговевшие ткани людей и животных. Дерматофиты представлены родами Epidermophyton, Microsporum и Trichophyton [13, 14].
Поражение дерматофитами кожи человека происходит в несколько этапов. На первом этапе артроконидии, образующиеся в результате фрагментации гиф в месте перегородок [15], прикрепляются к эпидермису хозяина через специализированные белки, присутствующие на поверхности грибов, а также выделяемые грибами протеазы, такие как субтилизин. На втором этапе – прорастание – артроконидии в благоприятных условиях инициируют реактивацию метаболической активности и их рост в гифы. Во время третьего этапа, называемого инвазией, гифы, образующиеся из прорастающих трубок, проникают в ороговевший слой эпидермиса, при этом переваривая кератин до небольших пептидов и аминокислот. Наконец, гифы начинают продуцировать новые артроконидии, которые высвобождаются локально, чтобы инфицировать новых хозяев или участки тела [16].
Для разработки экспериментальной модели дерматофитии применяют различные виды животных, которые обычно не являются естественными хозяевами для выбранного дерматофита. В экспериментальных моделях дерматофитии используют мышей [17–19], крыс [20, 21], морских свинок [22–25], кур [26], хомяков [27], кроликов [13], крупный рогатый скот [28], кошек [29]. Чаще всего в исследование берут мышей и морских свинок, так как с ними легко выполнять манипуляции, они относительно недорогие, восприимчивы к заражению дерматофитами, поэтому такие виды этически более приемлемы, чем мелкие домашние животные (кошки). Морских свинок чаще используют для оценки эффективности противогрибковых соединений против дерматофитов, так как кожа морских свинок близка по строению к коже человека. Модели на мышах более предпочтительны для изучения иммунного ответа, возникающего во время болезни [14, 30].
Большинство моделей дерматофитии на животных были получены с использованием зоофильных грибов (Trichophyton mentagrophytes или Microsporum canis), так как они являются более патогенными для лабораторных животных, чем антропофильные штаммы [14]. Во многих исследованиях для заражения животных используют инокулят, состоящий из конидий или смеси конидий и гифальных элементов. Некоторое количество экспериментов было выполнено с использованием артроконидий (артроспор). Конидии продуцируются исключительно in vitro на среде Сабуро, тогда как артроконидии – дерматофитами in vivo, это указывает на то, что среда имеет решающее значение для типа споруляции и роста гриба [16]. Однако посевной материал, состоящий из конидий, обычно предпочтительнее из-за длительности и сложности процедур, необходимых для получения артроконидий.
Очень важно в исследованиях на животных подобрать способ заражения в зависимости от целей исследования. В естественных условиях дерматофиты первоначально встречаются в ороговевшем слое кожи, поэтому лучше использовать надкожный способ инокуляции. В исследованиях с использованием животных без шерсти (например, у морских свинок [31]) были получены многообещающие результаты, но большинство исследований продолжают проводить на животных с шерстью, кожа которых была предварительно очищена от волос. Чтобы повысить восприимчивость к инфекции, кожу слегка повреждают путем бритья [22], эпиляции или с помощью лезвия скальпеля [17, 23], наждачной бумаги [20, 24, 25]. Помимо эпикутанного пути заражения, существую и другие способы инокуляции. Хотя дерматофиты лишь изредка поражают другие органы, кроме кожи и кожных придатков, некоторые авторы разработали экспериментальные модели системных дерматофитозов на животных [30].
Несмотря на обширное количество исследований дерматофитии на животных, возникает много трудностей в создании модели in vivo. Основные причины: у животных и людей разные структура кожи, иммунная система и возбудители инфекции, при этом грызуны обладают плохой восприимчивостью к антропофильным дерматофитам. Основные модели дерматофитии с использованием животных представлены в табл. 2.
Кандидоз – одна из разновидностей грибковой инфекции, которая вызывается грибами рода Candida. Кандида – это диморфный гриб, который может существовать как в дрожжевой фазе (бластоспора, бластоконидии), так и в гифальной (мицелиальной). Candida размножается путем многостороннего почкования и может развиваться как мицелиальная форма, состоящая из длинных ветвящихся перегородок или нитей, либо как сферические или яйцевидные дрожжевые клетки [32].
Некоторые виды грибов Candida являются нормальными комменсалами кожи, слизистых оболочек, желудочно-кишечного тракта человека и других млекопитающих. Примерно из 100 известных видов Candida относительно немногие (12–14) вызывают инфекции у человека. Грибы Candida могут провоцировать широкий спектр заболеваний: от поверхностных инфекций (молочница и инфекции ногтевого ложа) до серьезных, опасных для жизни заболеваний (эндокардит, менингит, остеомиелит и кандидемия). Наиболее часто из клинических образцов, полученных от людей, выделяется Candida albicans в сочетании с другими видами: C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, и C. krusei, они составляют примерно 99% всех человеческих заболеваний, связанных с кандидозом [33].
Наиболее распространенные виды животных, используемых для моделирования кандидоза, – мыши [34–39], крысы [40–43], морские свинки [44, 45] и кролики [46, 47]. Среди грызунов чаще всего в моделях кандидоза in vivo используют мышей. На таких моделях были изучены различные клинические формы Candida, включая инфекции слизистой оболочки полости рта [38, 39], влагалища [37, 39], желудочно-кишечного тракта [36, 39], глубокие и системные формы кандидоза [34, 39], которые были вызваны экспериментально у беспородных и инбредных линий мышей [48]. Большинство моделей кандидоза на животных получены с применением штаммов C. albicans. С целью имитации клинических ситуаций, близких к человеку, экспериментальные инфекции Candida могут быть вызваны не только у интактных мышей, но также у мышей с ослабленным иммунитетом путем предварительной обработки различными цитотоксическими агентами, такими как циклофосфамид [35, 38, 46, 49], 5-фторурацил [38], облучение [36] и др.
Однако не во всех опытах корректно использовать мышей. В фармакологических экспериментах метаболизм противогрибковых препаратов на мышах может отличаться от фармакокинетики или фармакодинамики, наблюдаемых у людей. На доклинических этапах исследования вориконазола обнаружено, что при введении мышам концентрации вориконазола в сыворотке были очень низкие и часто не определялись. Это было связано с быстрым метаболизмом при первом прохождении и быстрым клиренсом препарата при повторных дозах. В результате большая часть последующих работ с вориконазолом проведена на морских свинках [50, 51]. Основные модели кандидоза с использованием животных представлены в табл. 3.
Аспергиллез – грибковая инфекция, передающаяся воздушно-капельным путем, вызываемая повсеместно распространенными сапрофитными плесневыми грибами, принадлежащими к роду Aspergillus [52]. Виды Aspergillus присутствуют в окружающей среде и ежедневно вдыхаются в виде конидиальных спор. Споры (конидии) легко проникают в альвеолы легких из-за небольшого размера. У здоровых людей конидии эффективно элиминируются макрофагами и нейтрофилами, у иммунокомпрометированных ингаляция конидий аспергиллов может привести к развитию инфекции, при этом происходит трансформация конидий (прорастание) в гифы, которые поражают ткань [53]. Инфекция, вызванная аспергиллезом, чаще всего возникает из-за A. fumigatus, A. flavus, A. terreus и A. niger, которые провоцируют клинически разные формы – аллергический бронхолегочный аспергиллез, аллергический грибковый риносинусит, хронический легочный аспергиллез, хронический некротический аспергиллез легких и первичный кожный аспергиллез [54, 55].
Различными исследователями было разработано множество моделей аспергиллеза на животных. В ветеринарии аспергиллез является важным заболеванием легких у птиц, в результате было разработано несколько моделей на птицах. Птицы – один из немногих видов, которые могут заразиться естественным путем при отсутствии иммуносупрессии. В целом в моделях использовались разные виды птиц – японские перепела [56], индюки [56, 57], куры [56, 58], возраст которых варьировал от вылупившихся птенцов до взрослых животных. Для заражения животных использовались как внутривенная инокуляция, так и легочные пути введения (интратрахеальный или аэрозольный). По большей части в исследованиях устанавливается быстро развивающееся заболевание со смертельным исходом уже через 2 дня после заражения [52, 59].
Эксперименты, проведенные для имитации болезней человека (или млекопитающих), основывались на моделях с использованием обычных видов лабораторных животных, таких как крысы [60–63], мыши [64–67], морские свинки [68–70], кролики [71, 72]. Данные виды животных использовались в исследованиях патогенеза, иммунного ответа, вирулентности и противогрибковой терапии. Большинство опытов проводилось на животных с ослабленным иммунитетом. Модели аспергиллеза на мышах являются предпочтительными для большинства исследователей, так как мыши демонстрируют сходство с людьми в органах и системах, биохимии и патологии. Однако по сравнению с кроликами и другими грызунами небольшой размер этого вида позволяет собирать небольшие объемы крови. Кроме того, маленький размер легких мышей может вносить вклад в иную кинетику по сравнению с людьми. При той же скорости роста грибка гораздо меньшее по размеру легкое мыши будет поражено быстрее, чем легкое человека, с возможными последствиями, касающимися вероятности гематогенного распространения [52, 59].
Низкая чувствительность и специфичность ограничивают современные методы диагностики аспергиллеза. Таким образом, в последних рекомендациях для повышения вероятности постановки точного диагноза рекомендуется одновременное использование нескольких тестов. Наличие роста Aspergillus при микробиологическом посеве не позволяет установить истинный диагноз инфекции; это может отражать простую колонизацию верхних дыхательных путей, учитывая, что споры Aspergillus распространены повсеместно [52]. Согласно рекомендациям Европейской организации по исследованию и лечению рака (EORTC) и Национального института здоровья (MSG), определение галактоманнанового антигена Aspergillus spp. включено в состав микробиологических критериев диагностики инвазивного аспергиллеза [73]. Кроме того, доступны тесты с использованием грибковых биомаркеров клеточной стенки, включая (1-3) β-D-глюканы в крови, но они не позволяют дифференцировать инвазивный аспергиллез от других грибковых заболеваний. Следовательно, эти тесты следует рассматривать как способ исключить грибковую инфекцию при отрицательном результате. Количественный ПЦР-анализ все еще не стандартизирован для обнаружения ДНК Aspergillus в образцах крови или дыхательных путей. Выявление антител Aspergillus является ценным только для диагностики хронического аспергиллеза, включая аспергиллому и аллергический бронхолегочный аспергиллез [52].
Экспериментальные модели аспергиллеза на животных помогают в изучении патофизиологических процессов, оценке диагностических средств, терапевтических эффектов противогрибковых препаратов, позволяющих бороться с инфекционными заболеваниями. Основные модели аспергиллеза с использованием животных представлены в табл. 4.
В соответствии с руководящими принципами, лежащими в основе гуманного использования животных в научных исследованиях, приверженность указанным принципам предписывается директивой 2010/63/EU, при планировании исследования на животных необходимо соблюсти принципы «трех R» (reduction – сокращение, refinement – улучшение, replacement – замена). Использование альтернативных моделей на беспозвоночных может заменить исследования на более сложноорганизованных организмах.
В качестве моделей для изучения патогенеза грибов, помимо млекопитающих, часто используют беспозвоночных, таких как амеба (Acanthamoeba castellanii [74–76] и Dictyostellium discoideum [75]), насекомые (Drosophila melanogaster [76], Galleria mellonella [75, 76] и Bombyx mori [77, 78]) и нематода Caenorhabditis elegans [75, 76]. Эксперименты с этими моделями беспозвоночных проходят намного быстрее и проще, чем с млекопитающими. Более того, многие аспекты их врожденного иммунитета сохранены по сравнению с таковыми у млекопитающих. Однако важно отметить, что даже в рамках модельной категории беспозвоночных не все представители подвержены заражению определенным грибковым патогеном, а в некоторых случаях хозяин не подходит для изучения определенного признака патогенеза [74]. Модели на беспозвоночных имеют множество преимуществ и недостатков по сравнению друг с другом и с традиционной моделью млекопитающих (мышиной), как показано в табл. 5.
Выбор модельной системы беспозвоночных для изучения вирулентности грибов в значительной степени зависит от конкретных факторов, связанных с вирулентностью патогенов, представляющих интерес конкретных врожденных иммунных реакций хозяина. Если цель – изучение врожденных иммунных ответов, то выбирают, как правило, многоклеточный модельный организм, такой как Drosophila или C. elegans. Если цель – изучение фагоцитоза и/или результат приема внутрь, выбор включает одноклеточные организмы, такие как амебы. Точно так же, если целью является изучение грибковых процессов, которые происходят при температуре около 37°C, необходимо выбрать термостойкую модельную систему, такую как G. mellonella или Acanthamoeba castellanii [76].
Использование беспозвоночных моделей в исследованиях грибковых инфекций имеет не только множество плюсов, но и минусов, из-за которых они не могут полностью заменить млекопитающих. Данные модели можно рекомендовать в качестве дополнительных моделей для расширения знаний о грибковом патогенезе, а также об открытии новых противогрибковых лекарственных средств.
С каждым годом количество грибковых инфекций растет за счет увеличения числа людей с ослабленным иммунитетом, а также развития устойчивости грибов к лекарственным средствам. Все это подталкивает к необходимости изучения патобиологии грибковых инфекций: определение факторов вирулентности, возникновение болезни, адаптации к среде хозяина различных грибковых патогенов человека и реакции организма на патоген. Для решения этих проблем используют различные модельные системы in vivo. Модели на мышах являются стандартными и часто используемыми. Большое разнообразие различных линий мышей, в том числе растущее число генномодифицированных и трансгенных, а также относительно низкая стоимость и использование небольшого пространства для содержания, сделали модели грибковых инфекций на мышах самыми популярными. В табл. 6 представлены основные возбудители грибковых заболеваний и очаги поражений людей, а также соответствующие грибковые модели на мышах со способами заражения.
Однако по этическим и экономическим соображениям для некоторых целей можно использовать альтернативные модели беспозвоночных. Очень важно при выборе грибковой модели на животных максимально близко воспроизвести клиническое течение заболевания человека. Для подтверждения достоверности полученных данных необходимо, чтобы модель была высоковоспроизводимой, для этого необходимо стандартизировать используемые методы. Таким образом, для проведения исследования на животных необходимо тщательно определить модель и вид используемого животного.
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
К.Е. Боровкова – идея, сбор данных литературных источников, сбор и анализ данных, написание и редактирование текста статьи
М.Н. Макарова – концепция и дизайн исследования, редактирование текста статьи, научное консультирование и утверждение окончательного варианта статьи для публикации
Л.Р. Никифорова – научное консультирование
Ю.В.Салмова – научное консультирование
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.