Морозова М.В., Калмыкова Г.В., Акулова Н.И., Литвинова Е.А. Определение содержания бактерий рода Bacillus в корме и фекалиях лабораторных мышей при содержании в стерильных и нестерильных условиях. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-03-02
В настоящее время эталон содержания лабораторных животных – барьерные виварии со стерильными условиями содержания и кормления. Однако такие условия не естественны и могут быть вредны для животных, поскольку лишают их пробиотической нагрузки бактерий-космополитов Bacillus spp. Эти бактерии не являются представителями естественной микрофлоры, населяющей кишечник, а попадают в него при случайном поедании, поскольку в окружающей среде они не редки. При иссякании источника Bacillus spp. кишечник естественным образом от них очищается, т.е. бактерии Bacillus spp. не колонизируют кишечник млекопитающих. В настоящее время накоплен большой массив данных о положительном действии представителей Bacillus spp. на пищеварение, устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям, репродуктивное здоровье животных и человека. Разработаны пробиотические препараты для ветеринарии и медицины на основе Bacillus spp. Наиболее распространены пищевые пробиотические добавки на основе B. subtilis и B. licheniformis. В данной работе мы исследовали неавтоклавированные и автоклавированные корма и подстил лабораторных мышей на наличие бактерий рода Bacillus как фактора, влияющего на благополучие и здоровье лабораторных животных. Было установлено, что неавтоклавированный корм для грызунов содержит 103 спор/г, а фекалии животных, поедающих неавтоклавированный корм, –104 спор/г. Стерильный подстил, автоклавированный корм, а также фекалии от животных, питающихся автоклавированным кормом, не содержали ни вегетативных, ни споровых форм Bacillus spp. ПЦР с праймерами к гену 16S рибосомальной РНК бактерий показал наличие бактериальной ДНК в неавтоклавированном корме и сильную деградацию бактериальной ДНК в автоклавированном. Таким образом, животные, потребляющие неавтоклавированный корм, имеют пробиотическую нагрузку в виде представителей Bacillus spp. в основном в споровой форме. Мыши, содержащиеся в стерильных условиях, лишены положительного влияния метаболитов представителей рода Bacillus. Активация иммунной системы у этих животных также снижена из-за фрагментации бактериальной ДНК.
Данная работа может быть полезна специалистам при принятии решения о необходимости поддержания стерильности корма для содержания лабораторных животных, а также для разработки и внедрения пробиотических бактериальных культур в рацион лабораторных животных в условиях барьерного содержания.
Лабораторных животных в научных исследованиях используют с конца ХIX века, однако регламент гуманного содержания лабораторных животных начал оформляться только во второй половине ХХ века с формулирования концепции 3R: замещение (replacement), сокращение (reduction), усовершенствование (refinement). Эталоном содержания животных в настоящее время считаются барьерные виварии, в которых содержатся SPF (свободные от патогенов) животные в условиях, соответствующих рекомендациям ECVAM, FELASA, OECD, FDA, EPA и др. Для этого в вивариях организованы «чистые» и «грязные» зоны и определены потоки движения персонала и оборудования. Для содержания животных и снижения риска контаминации используют системы с индивидуальной вентиляцией клеток, а также стерильный подстил, корм, воду и клетки. Стерилизацию осуществляют, используя автоклавирование, облучение гамма-лучами, обработку парами перекиси водорода или газом. Однако небольшие институты и лаборатории часто используют для содержания животных конвенциональные или улучшенные конвенциональные виварии, где животных содержат в открытых клетках, разделение зон по чистоте и потоки движения соблюдены условно или вообще не соблюдены, стерильность оборудования, корма и подстила не предусмотрена. Тем не менее риск заражения животных патогенами через корм минимален, так как в вивариях используют специальный корм промышленного производства. При этом велика вероятность наличия в корме бактерий рода Bacillus, поскольку они являются космополитами и распространены повсеместно. Многолетняя история изучения представителей Bacillus spp. показала, что они важны для нормальной работы пищеварительной и иммунной систем, оказывая противовоспалительное, антиоксидантное, иммуномодулирующее и антимикробное действие [1], а также могут повышать репродуктивные способности как самок, так и самцов [2].
Созданная искусственная среда, свободная от любых микроорганизмов, не является естественной для животных. Зная, что многие представители Bacillus spp. встречаются в почве и растениях, то можно предположить, что природные кормовые базы Mus musculus содержат достаточное количество представителей этого рода на протяжении всего периода сосуществования. Это может означать, что многие физиологические и метаболические процессы мышей обязательно связаны с метаболитами Bacillus spp. Стерильность в барьерных вивариях, включая корма, может дать негативный эффект на здоровье и благополучие лабораторных животных. Особенно это касается различного рода трансгенных животных с нарушением иммунных процессов или недостатком ферментов, участвующих в пищеварении. Именно роль Bacillus spp. в формировании иммунитета и пищеварения привела к созданию пробиотиков на их основе. Наиболее часто в качестве пробиотиков используются B. subtilis [3] и B. licheniformis, менее известные – B. clausii, B. pumilus, B. coagulans и некоторые B. сereus [4].
Таким образом, цель данного исследования – изучить содержание Bacillus spp. как пробиотического микроорганизма в корме и подстиле у мышей, содержащихся в условиях барьерных и улучшенных конвенциональных вивариев. Для достижения этой цели были поставлены задачи исследовать автоклавированные и неавтоклавированные корма, подстил, а также фекалии мышей, содержащихся на стерильных и нестерильных кормах и подстиле.
В качестве объекта исследования был взят корм Дельта Фидс «Корм для лабораторных крыс и мышей категории разведение» (Р-22, БиоПро, Россия). Условия автоклавирования: давление 2 атм, температура 132оС, время 30 мин, автоклав GE 91415 AR-2 (Getinge Sterilization AB, Швеция).
Фекалии были собраны от 12–13-недельных мышей линии С57BL/6, из Российского национального центра генетических ресурсов лабораторных животных на базе SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН, содержащихся в условиях барьерного вивария (индивидуально-вентилируемые клетки, автоклавированные корм и подстил), и от этих же животных через 2 нед содержания в условиях улучшенного конвенционального вивария (открытые клетки, неавтоклавированные корм и подстил) сектора разведения экспериментальных животных Научно-исследовательского института нейронаук и медицины (НИИНМ). В обоих вивариях животные содержались по 3–4 особи в группах, доступ к корму и воде не ограничивался, температура поддерживалась на уровне 22–24°C, настройка светового режима 14/10 ч. Все животные проходили ежеквартальную проверку на отсутствие патогенов, рекомендованных для мониторинга FELASA 2014. Работа с животными была одобрена локальным этическим комитетом НИИНМ (выписка из Протокола от 11.03.21 № 3). После проведения данного исследования все животные были использованы для других научных задач.
Определение общего количества спорообразующих бактерий в образцах корма и фекалий мышей проводили высевом на Dextrose Casein-peptone agar (Merck, Германия). Образцы готовили в 3 повторах: 10 г корма вносили в 90 мл стерильного физиологического раствора или 100 мг фекалий мышей – в 0,9 мл стерильного физиологического раствора; 500 мкл гомогенизированного раствора корма или фекалий высевали на чашку Петри. Удаление вегетативных форм бактерий осуществляли прогреванием суспензии в течение 15 мин при 85°C.
Концентрацию спор и вегетативных форм бактерий или только спор после прогрева определяли методом посева в серийных разведениях по ГОСТу 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов». Посевы на чашках Петри инкубировали в термостате ТСО-1/80 при 36±1°С. Через 48 ч подсчитывали число выросших колоний.
Лецитиназную активность – дифференцирующий признак бактерий Bacillus cereus определяли точечным посевом изолированных колоний на среду Донована (ТУ 9229-163-00419785-98). Положительная реакция – образование зоны матового коагулята и просветления вокруг колонии.
Спорообразование у отобранных по морфологическим признакам изолятов подтверждали микроскопией после окрашивания метиленовой синью на микроскопе Olympus BX46 (Olympus Corp., Япония).
ДНК выделяли из автоклавированного и неавтоклавированного корма с помощью QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) согласно рекомендациям производителя. Общее количество бактериальной ДНК определяли по участку гена 16S rRNA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с помощью BioMaster HS-qPCR SYBR Blue (BioLabMix, Новосибирск, Россия), 5 мкл ДНК из корма и 300 нмоль/л специфического праймера (16S rRNA: F-TCCTACGGGAGGCAGCAG, R-ATTACCGCGGCTGCTGG). Положительный контроль – ДНК из фекалий, отрицательный – деионизированная вода (Milli-Q тип I, Merck Millipore, Германия). ДНК денатурировали в течение 5 мин при 95°C, а затем амплифицировали в 45 циклах денатурации при 95°C в течение 15 с, отжиг праймеров и синтез ДНК осуществляли при 62°C в течение 50 с.
Обработку полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 10.0. (США, StatSoft). Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM).
Роста бактерий с образцов подстила обоих типов (до и после стерилизации) и автоклавированного корма не за-фиксировано. Количество спор и вегетативных форм бактерий рода Bacillus в неавтоклавированном корме и фекалиях от мышей, потребляющих неавтоклавированный корм, составило 2,14±0,32•103 и 1,80±0,25•104 КОЕ/г соответственно. В тех же образцах корма и фекалий количество только спор было 4,87±0,41•103 спор/г и 2,00±0,42•104 спор/г соответственно (рис. 1). В составе нормальной микрофлоры мышей, которые потребляют стерильный корм, ни споры, ни вегетативные формы бактерий рода Bacillus не обнаружены.
Рассев 36 изолированных бактериальных колоний, полученных из образцов неавтоклавированного корма и фекалий, и микроскопический анализ подтвердили, что все отобранные колонии способны образовывать споры. По морфологии колоний изоляты были разделены на 6 групп: 1-я – крупные колонии диаметром >12 мм со складчатым центром и слизистыми краями в виде накладывающихся лепестков; 2-я – округлые диаметром до 20 мм сероватые плоские матовые колонии с радиальными морщинками; 3-я – белые с фестончатым краем морщинистые с мелкими радиальными складками колонии диаметром до 15 мм; 4-я – крупные 25 мм в диаметре белые с волнистым краем и кратерообразным центром колонии; 5-я – небольшие белые колонии диаметром 10 мм округлые или неправильной формы плоские со слабым блеском; 6-я – одна колония белая диаметром 30 мм с ровным краем, блестящей сметанообразной поверхностью (рис. 2). Таким образом, было показано, что во всех образцах корма и фекалий присутствовали спорообразующие бактерии первых трех морфологических групп, только бактерии 4-й группы обнаружены в образцах фекалий мышей; бактерии 5-й группы выявлены в вегетативной форме в корме и фекалиях, а 6-й – в вегетативной форме в корме. Род Bacillus объединяет обширную группу строго аэробных или факультативно-анаэробных грамположительных хемоорганотрофных микроорганизмов палочковидной формы, образующих термоустойчивые эндоспоры. С учетом использования предпочтительной для Bacillus spp. среды, морфологии колоний, способности образовывать споры, устойчивые к прогреванию, мы заключили, что в неавтоклавированном корме присутствуют представители рода Bacillus. Полагаем, что корм – основной источник Bacillus spp. для лабораторных животных, поскольку в подстиле бактерий не обнаружено. Так как с нестерильного корма рост колоний Bacillus spp. составил примерно 5•103 спор/г, то считаем, что половозрелая мышь, съедая 4 г корма в сутки, потребляет около 24•103 спор. Соответственно животные, содержащиеся в стерильных условиях, лишены этой пробиотической нагрузки.
Обнаружение Bacillus в гранулах корма не удивительно, поскольку они способны колонизировать различные среды, включая водную [5]. В состав использованного корма входят зерновые и молочные компоненты. Наиболее распространенными видами Bacillus, обнаруживаемыми в молоке, на всех этапах обработки являются B. Licheniformis и B. сereus [6]. Bacillus из почвы может приникать в растительные органы зерна, поэтому продукты из переработанного зерна тоже содержат представителей рода Bacillus. Так, в панировочных сухарях выявляли B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus и изоляты B. clausii и B. firmus [7].
Проверка 36 бактериальных изолятов для определения лецитиназной активности показала, что 3 изолята из 13, выделенных из корма, 1 изолят из 9 колоний, выделенных из фекалий мышей, давали большую зону помутнения среды вокруг колоний, а 2 других из тех же фекалий – небольшую зону слабого помутнения. Такую же зону давали 2 изолята из 9 колоний спор, полученных из фекалий. В изолятах из прогретого корма помутнения среды вокруг колоний спор не обнаружено (см. рис. 1). Это свидетельствует о присутствии в корме вегетативных форм Bacillus, которые обладают лецитиназной активностью. Полученные данные говорят о том, что в корме и фекалиях присутствуют B. cereus, что ожидаемо, поскольку эти бактерии обнаруживаются в небольших количествах повсеместно [8]. Среди B. cereus встречаются штаммы, вырабатывающие токсины и вызывающие отравления, но некоторые не вырабатывают токсины и являются пробиотическими. В случае токсичных штаммов количество бактерий для отравления должно составлять ≥105–108 КОЕ/г [9], у нас в корме всех бактерий было 103 КОЕ/г.
Таким образом, возможные преобладающие микроорганизмы из рода Bacillus, обсеменяющие корм для лабораторных животных, это: B. subtilis, B. licheniformis и B. cereus. Эти микроорганизмы являются пробиотическими, и препараты на их основе используются в ветеринарии и медицине [10].
Представители рода Bacillus в норме не колонизируют кишечный тракт млекопитающих, а являются аллохтонными микроорганизмами, которые попадают туда в результате либо случайного поедания, либо осознанного употребления. Показано, что споры B. subtilis (PY79) и B. indicus остаются жизнеспособными после попадания в желудочный и кишечный соки в отличие от чувствительных к таким факторам вегетативных форм [11]. Споры бактерий могут достигнуть тощей и подвздошной кишок и там прорасти. Показано, что B. subtilis может пройти весь свой жизненный цикл от спор к вегетативным клеткам и снова в споры в желудочно-кишечном тракте [12]. Однако если животное перестает употреблять B. subtilis и B. indicus, то через 14 дней представители данного рода полностью элиминируют [11]. Таким образом, для поддержания пробиотического эффекта животные должны регулярно получать с кормом бактерии рода Bacillus.
Пробиотические микроорганизмы оказывают воздействие на организм хозяина, участвуя в метаболизме и активируя иммунную систему. Очевидно, что животные, содержащиеся в стерильных условиях, лишены влияния метаболитов этих бактерий. Для активации иммунной системы необходимы составляющие бактериальной стенки (полисахариды, белки) и ДНК. Известно, что бактериальная ДНК может модулировать иммунный ответ хозяина, снижая воспаление [13]. Автоклавирование приводит к серьезной деградации ДНК на короткие фрагменты [14]. Определение количества бактериальной ДНК в стерилизованном и нестерилизованном корме выполнили с помощью ПЦР в реальном времени консервативного участка гена 16S рибосомальной РНК. Анализ автоклавированного и неавтоклавированного корма показал, что только в неавтокливируемом корме детектировалась бактериальная ДНК. Таким образом, в стерильном корме ДНК бактерий сильно фрагментирована и не может вызвать реакции организма хозяина со стороны иммунной системы.
Таким образом, лабораторные животные, получающие неавтоклавированный корм, вместе с ним потребляют бактерии рода Bacillus как в вегетативной, так и в споровой форме, которые могут положительно влиять на их здоровье. Животные из барьерных вивариев, конечно, в большей степени защищены от патогенной микрофлоры, однако стерильность условий содержания и кормления лишает их пробиотических микроорганизмов рода Bacillus, что непременно сказывается на их здоровье. В связи с этим можно рекомендовать при содержании лабораторных животных по возможности ограничить использование автоклавированного корма или для барьерных вивариев и исследований, где важны стерильность корма, искусственное обогащение корма бактериальной культурой Bacillus spp. до уровней естественного обсеменения кормов для обеспечения надлежащих условий содержания.
Представленная в статье методика определения Bacillus spp. в корме может быть полезна для принятия решения о необходимости дополнительного введения в корм бактерий рода Bacillus при отсутствии или малом их количестве в используемом корме.
М.В. Морозова – исполнение молекулярной части исследования (ПЦР), написание, редактирование текста статьи.
Г.В. Калмыкова и Н.И. Акулова – проведение микробиологических исследований
Е.А. Литвинова – утверждение окончательного варианта статьи для публикации.
Работа выполнена при поддержке исследовательского гранта Rus-LASA (Договор № НИ2 от 04.03.2021) и средств федерального бюджета на проведение фундаментальных научных исследований № 0533-2019-0003.