Матичин А.А., Фаустова Н.М., Каргопольцева Д.Р., Макарова М.Н. Циркадианные колебания уровня тестостерона в плазме крови половозрелых самцов крыс . Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 2. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-02-04
Тестостерон — это плейотропный гормон, который играет важную роль в организме человека, оказывая влияние на различные органы и системы, включая головной мозг, периферические нервы, мышцы, жировую и костную ткань, сердечно-сосудистую систему, а также мужские половые органы и репродуктивную систему, способствует возникновению либидо. У животных при изучении фармакодинамической активности новых лекарственных препаратов, патологических физиологических процессов одним из параметров оценки является уровень тестостерона в биологических жидкостях и тканях. Однако при определении концентрации тестостерона необходимо учитывать, что возраст, пол, эндокринный статус, а также время сбора биологического материала и ряд других факторов влияют на результат исследования. Правильная интерпретация полученных в эксперименте данных невозможна без учета биоритма.
В настоящей работе представлены сведения о колебании уровня тестостерона в периферической крови интактных половозрелых лабораторных крыс-самцов за 25 ч (циркадианный ритм). В эксперименте регистрировали значимый по амплитуде подъем уровня гормона у большей части животных в период с 12:00 до 20:00 ч с максимумом концентрации в 12:00 ч, что было сопоставимо с данными литературы. Полученные результаты сильно варьируют, например, на точке 8:00 ч значения составили 5,43±2,11 (SEM) нмоль/л. Вариабельность параметров отмечена в работах авторов как в экспериментах на животных, так и в клинической практике. Эксперимент показал, что высокая вариабельность данного показателя у интактных животных может привести к статистически значимым различиям, которые затруднят интерпретацию данных по лечебному эффекту лекарственного средства. В связи с чем при планировании исследования, требующего изучения уровня гормонов, необходимо увеличивать выборку животных, проводить отбор животных для эксперимента, а также планировать и контролировать забор биологического материала в один и тот же промежуток времени.
Тестостерон — основной мужской половой гормон, относящийся к андрогенам. Синтезируется из холестерина клетками Лейдига в тестикулах у мужчин и в небольшом количестве в яичниках у женщин, а также секретируется корой надпочечников и у мужчин, и у женщин [1].
Тестостерон обладает широким спектром физиологических функций, оказывая влияние на различные органы и системы, включая головной мозг, периферические нервы, мышцы, жировую и костную ткань, сердечно-сосудистую систему, а также мужские половые органы и репродуктивную систему (созревание сперматозоидов), способствует возникновению либидо. Он регулирует метаболизм углеводов, липидов и белков, оказывает действие на рост мышечной ткани, процесс адипогенеза, стимулирует эритропоэз [1, 2]. Описана связь между дефицитом тестостерона и инсулинорезистентностью, воспалением, дислипидемией, метаболическим синдромом и риском сосудистых заболеваний [3, 4]. До сих пор остается актуальным изучение влияния тестостерона на сердечно-сосудистую систему. По данным литературы, склероз коронарных артерий – одна из основных причин смертности, при этом риск развития ишемической болезни сердца у мужчин вдвое превышает таковой у женщин. Полагают, что это связано с разной секрецией половых гормонов у мужчин и женщин. Известно, что тестостерон стимулирует выработку эндогенного оксида азота, который дает антигипертензивный и антиатерогенный эффект [5], следовательно, снижение его уровня может оказывать негативное влияние на состояние сердечно-сосудистой системы у мужчин старшего возраста. Подтверждают данное утверждение результаты исследований, в которых у мужчин с ишемической болезнью сердца обнаружено снижение в крови уровня тестостерона и/или дегидроэпиандростерон сульфата [6, 7]. Кроме того, отмечено, что терапия с использованием тестостерона снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний, уменьшает жировую и увеличивает мышечную ткань, при этом снижается риск развития сахарного диабета [8-10].
Влияние андрогенов на формирование и нейронную организацию мозга до рождения является предметом дискуссии [2]. Были опубликованы исследования на грызунах и обследования людей, фокусирующиеся на конкретных поведенческих и когнитивных параметрах (тревожность, депрессия, пространственные способности, память) под действием тестостерона. Результаты, к сожалению, противоречивы. В основном в опубликованной литературе ученые приходят к общему мнению, что тестостерон является анксиолитиком, антидепрессантом и улучшает способность к пространственному мышлению [11].
У животных при изучении фармакодинамической активности новых лекарственных препаратов или патологических физиологических процессов одним из параметров оценки является уровень тестостерона в биологических жидкостях и тканях [12-14]. В качестве показателей стрессорной реакции рационально использовать изменение концентрации в крови кортикостерона и тестостерона — гормонов, отражающих активность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и гипоталамо-гипофизарно-гонадной систем организма соответственно [15, 16]. С 70–80-х годов прошлого века в экспериментах на животных была показана вариабельность концентрации тестостерона [17], которая имеет место и сейчас, включая данные, полученные у человека [18]. Возраст, пол, эндокринный статус, а также время забора биологического материала и ряд других факторов влияют на результат [11]. Правильная интерпретация полученных в эксперименте данных невозможна без учета биоритма. Любому организму присущи ультрадианные (период меньше 20 ч), циркадианные (околосуточный период, 20-28 ч), инфрадианные (больше 28 ч), сезонные и многолетние биоритмы [19].
В данной работе представлены сведения о колебании уровня тестостерона в периферической крови интактных половозрелых лабораторных крыс-самцов за период 25 ч (циркадианный ритм).
Исследование выполнено в соответствии с нормативными документами [20, 21]. Использовали 5 аутбредных половозрелых крыс-самцов, полученных из питомника АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (Ленинградская обл., Россия). Возраст крыс 12 нед, поскольку, по данным литературы и вивария, он является оптимальным для начала спаривания с целью получения потомства у крыс [22]. Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 и с Директивой 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. В качестве корма использовали «Корм для содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленный по ГОСТу Р50258-92. Воду в стандартных поилках со стальными крышками-носиками давали ad libitum. В качестве подстила применяли древесные гранулы размером 6 мм из лиственных пород древесины.
У каждого животного отбирали кровь прижизненно из хвостовой вены в соответствующей временной точке в объеме 500 мкл: 8:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00 (00:00) и 9:00 ч (следующий день).
Кровь забирали в пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин натрия (для 500 мкл крови в пробирку вносили 5 мкл раствора гепарина натрия концентрацией 5000 МЕ/мл). Обязательным условием во время сбора образцов крови являлось размещение пробирок в штативах на хладоэлементах для поддержания необходимой температуры (2-8°C). Отобранный объем крови за 25 ч составил не более 10% от общего объема циркулирующей крови.
Кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1840 g и 4°C и далее отбирали плазму. Анализ выполняли с использованием коммерческого набора для определения концентрации тестостерона «Тестостерон-ИФА-Бест» (Вектор-Бест, Россия, №X-3972, серия 118) в соответствии с методикой, описанной в инструкции к набору. Оптическую плотность измеряли при помощи микропланшетного анализатора CLARIOstar® («BMG LABTECH», Германия).
Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft, США). Данные подчинялись закону нормального распределения (критерий Шапира-Уилка; р>0,05). Рассчитывали среднее значение (M) и стандартную ошибку среднего (SEM). Различия определены при р=0,05)
Уровень тестостерона в плазме крови крыс в рамках одной временной точки варьировал (рис. 1 и 2). Так, на первой точке (8:00 ч) диапазон колебался от 0,64 до 11,8 нмоль/л со средним значением 5,43±2,11 (SEM) нмоль/л.
При индивидуальном подходе к каждому значению на первой временной точке были выделены два животных с уровнем тестостерона 0,87 и 0,64 нмоль/л, который сохранялся практически на протяжении всего эксперимента. Максимальный подъем уровня гормона у данных животных был зарегистрирован в 20:00 ч и составил 11,9 и 2,35 нмоль/л соответственно, в то время как у остальных трех животных регистрировали увеличение показателя в период с 12:00 до 20:00 ч с максимумом концентрации в 12:00 ч. На рис. 2 представлен график динамики изменений уровня тестостерона в плазме крови крыс-самцов, за исключением данных, полученных от животных с обнаруженными изменениями в биоритме синтеза гормона.
Большое количество исследований по изучению суточных колебаний концентрации тестостерона в крови животных приходятся на 70 – 80-е годы прошлого века [17, 23, 24]. В отечественной литературе данному вопросу у разных видов животных (крысы, мыши, кролики, птицы и др.) посвящены работы М.Е. Диатроптова [19, 25, 26]. Автор установил в сыворотке крови крыс-самцов 8-часовой ритм уровня тестостерона, являющийся наиболее значимым по амплитуде среди других ультрадианных ритмов этого показателя, при этом максимальные значения выявлены около 24:00, 8:00 и 16:00 ч [25, 26]. Наши результаты частично сопоставимы с данными М.Е. Диатроптова на точках 8:00 и 16:00 ч, L.H. Heywood (1980) на точке 12:00 ч и E.J. Mock и соав. (1978) на точках 12:00 и 20:00 ч (рис. 3) [17, 27]. Кроме того, полученная в эксперименте зависимость была сопоставима с таковой у контрольной группы в исследовании авторов, изучающих взаимосвязь андрогенного дефицита со стрептозотоциновым диабетом различной степени тяжести [13] (рис. 4).
Амплитуда полученных данных близка клиническим значениям у людей. На рис. 5 приведен суточный уровень тестостерона в сыворотке крови здоровых мужчин [28]. Самое высокое значение приходится на утро (на графике пик смещен влево, у животных — вправо) и далее мягко снижается в течение дня. В связи с этим врачи при диагностике гипогонадизма рекомендуют отбирать кровь для определения уровня тестостерона между 7:00 и 11:00 ч утра. Также стоит отметить большой разброс данных на каждой временной точке, например, на точке 12:00 ч концентрация тестостерона в сыворотке крови находится в диапазоне от 13 до 30 нмоль/л (см. рис. 5).
В табл. 1 представлены диапазоны значений уровня тестостерона из экспериментальных работ на животных.
Несмотря на сильную вариабельность, полученные в нашем исследовании концентрации тестостерона (0,64 — 11,8 , 5,43±2,11 нмоль/л) и данные из разных источников частично пересекаются или накладываются на отдельные отрезки границ. Однако вопрос по референсным интервалам по уровню тестостерона в крови лабораторных крыс-самцов остается открытым.
Таким образом, установленная в эксперименте кривая по циркадианному ритму тестостерона в крови крыс-самцов сопоставима с данными литературы.
Полученные результаты в отношении гормона тестостерона важны для разработки дизайна эксперимента. Результат будет зависеть от того, в какое время суток введут лекарственное вещество или индуктор патологии, воздействуют фактором стресса, а также в какое время берут биологический материал. Как правило, лечебные эффекты оцениваются путем сравнения средних концентраций тестостерона в плазме/ткани обработанных и контрольных (интактных) животных без учета ранее указанных факторов. В ходе исследования выявлено: вариабельность данного показателя у интактных животных может быть велика, что в свою очередь способно привести к статистически значимым различиям между группами лечения и контроля, при этом такие результаты будут неотличимы от тех, которые возникают в следствие эффекта лечения. Поэтому при планировании эксперимента, требующего изучения уровня гормонов, необходимо увеличивать выборку, проводить отбор животных для эксперимента, поскольку возможно попадание в одну группу животных с нарушенным суточным ритмом продукции тестостерона, а также планировать и контролировать забор биологического материала в одно и то же время.
А.А. Матичин – концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста статьи
Н.М. Фаустова – сбор и анализ данных
Д.Р. Каргопольцева – сбор данных литературных источников
М.Н. Макарова – идея исследования, редактирование текста статьи
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.