Патогенез инфицированной ожоговой раны у крыс

Введение

Ожог — серьезное нарушение целостности тканевого покрова, которое может привести к снижению основных функций организма, инвалидизации и смерти. По своей сути ожог представляет собой повреждение ткани, вызванное воздействием тепла, холода, электричества, ионизирующего излучения и некоторых химических веществ. Степень повреждения зависит от типа действующего фактора, его силы и продолжительности воздействия [1]. Ожоговая травма является тяжелым и распространенным видом повреждений, которые наиболее часто индуцируются термическим фактором [2, 3].

Течение термической раны — сложный процесс, при котором патологические нарушения затрагивают многие органы и системы [4–6]. Сравнительно часто при термической ожоговой ране возникают местные инфекционные осложнения [7]. Инфекция замедляет заживление раны и способствует образованию рубцов. Колонизация раны бактериями начинается практически сразу после термической травмы и обычно включает условно-патогенные бактерии из окружающей среды или собственного микробиома человека. Зачастую в ране развивается и сохраняется лишь небольшая популяция микроорганизмов, что не представляет существенного препятствия для заживления. Однако ожоговые раны обычно содержат экссудат, который облегчает первоначальную инокуляцию и прикрепление патогенных микроорганизмов. Бактерии начинают формировать микроколонии, из которых впоследствии высвобождаются патогенные микроорганизмы, способные колонизировать новые участки в ране. В некоторых случаях микробная популяция увеличивается до уровня, который превышает иммунный клиренс, что препятствует нормальному процессу заживления и приводит к распространению инфекции [8]. Бактериальные инфекции ожоговых ран наиболее часто ассоциированы с Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus [9–12]. Staphylococcus aureus способен вырабатывать клеточные факторы вирулентности, замедляющие заживление ран, мешающие пролиферации кератиноцитов, оказывающие неблагоприятное воздействие на миграцию и жизнеспособность фибробластов путем индукции апоптоза [13].

Принимая во внимание частоту возникновения термических травм, сохраняется необходимость в создании новых терапевтических средств, а также разработке и адаптации релевантных модельных систем. Хотя моделирование ожоговых ран широко распространено в доклинических исследованиях при изучении фармакологических агентов на большом количестве лабораторных моделей, сохраняется ряд некоторых практических вопросов. Какие лабораторные животные в большей степени подходят для проведения данного типа эксперимента; каким образом и в какой области тела животного моделировать ожог; какой инфекционный агент использовать для инфицирования раны, если стоит такая задача?

Как правило, выбор вида животных для модели основан на его наибольшей трансляционной способности [14–17]. Так, сходство между физиологией и анатомией кожи свиньи и человека делает свинью релевантной тест-системой в качестве основной доклинической модели для изу­чения ожоговых ран [18]. Однако стоит отметить, что молодые свиньи обладают высокой устойчивостью к заражению и инфекции, а это является существенным ограничением при изучении инфицированных ожоговых ран. Кроме того, свиньи относительно дороги. Их большой размер и необходимость проведения общей анестезии обычно требуют дополнительного высококвалифицированного персонала во время процедур.

Хотя архитектоника кожи, а также механизмы ранозаживления у грызунов отличаются от таковых у человека [19], мыши и крысы часто используются в качестве тест-систем в исследованиях [20], в том числе связанных с заживлением ожоговых ран [14, 21]. Кроме того, стоит отметить, что грызуны являются адаптируемой моделью для изучения различных возбудителей ожоговых ран человека, включая грамположительные и грамотрицательные, анаэробные и аэробные бактерии и грибы [12, 22, 23], это качество дает им несомненное преимущество при изучении инфекционного компонента патогенеза ожоговых ран.

Цель исследования — оценка патогенеза инфицированного ожога на крысах, позволяющая в дальнейшем использовать этот вид животных для моделирования патологии при изучении широкого спектра потенциальных антисептических и противоожоговых агентов.

Материал и методы

Животные. Исследование было одобрено биоэтической комиссией на соответствие проекта исследования принципам 3Rs и Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, и выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. В качестве тест-системы использовали 7 самцов крыс Вистар, релевантный и экономически обоснованный вид животных для доклинических исследований [24–26]. Масса тела животных составила 260–300 г, возраст — 10–12 нед. Животных содержали в специализированной зоне лаборатории микробиологии в индивидуально-вентилируемых клетках (Shanghai Pretty Industries Co., Ltd, Китай) по одному животному, на подстиле. В помещениях для животных поддерживали цикл день/⁠ночь, температуру 20–26 °C и влажность 30–70%. Животным был предоставлен доступ к еде и воде ad libitum.

Проведение общей анестезии и анальгезии. Для обеспечения общей анестезии перед оперативным вмешательством при моделировании патологии экспериментальным животным и для инокуляции инфекционного патогена внутривенно однократно вводили комбинацию анестетиков — Золетил®100 (Virbac, Франция) в дозе 25 мг/⁠кг и Ксила в дозе 5 мг/⁠кг (Interchemie, Нидерланды). Внутривенный путь введения комбинации анестетиков позволил обеспечить животным необходимую глубину наркотического сна с короткой продолжительностью и ускоренным восстановлением. Для профилактики высыхания роговицы во время операции использовали глазные капли Систейн® Ультра («Алкон», США). В послеоперационный период животные получали препарат Флексопрофен® (ВИК — здоровье животных, Беларусь) в дозе 2,5 мг/⁠кг внутримышечно 1 раз в день на протяжении первых 4 дней с целью снижения болевых ощущений, которые могли развиться в результате формирования патологии.

Индукция патологии. Учитывая распространение термических ожоговых травм и последующее бактериальное обсеменение, формирование раны было осуществлено контактным способом, а в качестве инфекционного агента был выбран Staphylococcus aureus как наиболее часто ассоциированный с ожоговыми инфекциями микроорганизм. Формирование ожоговых ран произведено в 1‑й день эксперимента. Для этого предварительно покров шерсти в области холки по средней линии спины крысы, на границе между средней и верхней третью, удален с помощью электротриммера. Оперативное вмешательство выполнено в стерильных условиях под общей анестезией. Дезинфекцию кожного покрова проводили 70% этиловым спиртом. Формирование ожоговых ран осуществили при помощи электрического паяльника ЭПЦН-100/⁠220 (ООО «Слюдяная фабрика», Россия). Для обеспечения необходимых условий проведения индукции патологии паяльник был модифицирован. Было произведено спиливание жала паяльника, таким образом диаметр наконечника составил 8 мм. Для обеспечения массы 300 г на паяльнике была зафиксирована металлическая шайба. Продолжительность манипуляции 5 с, температура 100 °С. Размер сформированной раны составил примерно 200 мм².

На 4‑й день эксперимента для инфицирования ожоговой раны был использован возбудитель Staphylococcus aureus АТСС 25923, 10⁹ КОЕ/⁠мл, для этого у животных под наркозом скальпелем удаляли струпную корочку. После чего суспензию возбудителя при помощи шприца наносили поверхностно на область дна раны.

Планиметрическое исследование. Для оценки скорости заживления раны ежедневно, начиная с 5‑го по 14‑й день эксперимента, проводили оценку планиметрических параметров [27]. На рану накладывали простерилизованный лист полимерной пленки, на котором маркером наносили ее контуры. Пленку с полученным контуром прикладывали на миллиметровую бумагу, измеряли длину большой и малой полуоси и определяли площадь раны. Площадь раны рассчитывали по формуле:

S = πab, (1)

где S — площадь раны, мм²; a — длина большой полуоси, мм; b — длина малой полуоси, мм; π — 3,1415.

Эвтаназия. Эвтаназия экспериментальных животных была проведена на 15‑й день эксперимента. В соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 г. была выполнена эвтаназия животных при помощи передозировки анестетиков (начальный этап) с последующим перерезанием основных кровеносных сосудов (конечный этап). Данный вид эвтаназии сопровождался у животных минимальными болью, страданиями и дистрессом и был проведен компетентными сотрудниками.

Микробиологическое исследование. Микробиологическое исследование включало количественное определение микроорганизмов в 1 г ткани раны на 15‑й день эксперимента. После эвтаназии осуществляли забор участка раны в стерильные пробирки. Для этого стерильным лезвием иссекали участок мягких тканей дна и прилежащего края раны с захватом здоровой ткани и помещали в пробирки, взвешивали на электронных лабораторных весах Adventurer AR2140 (Ohaus Europe, Швейцария). Биологический материал измельчали с помощью гомогенизатора Даунса. К измельченным образцам добавляли стерильный физиологический раствор в соотношении 1:9. Далее пробирки встряхивали на мульти-вортексе V-32 (SIA «Biosan», Латвия) до получения однородной суспензии. Из полученной суспензии готовили ряд 10‑кратных разведений в стерильном физиологическом растворе до 10^–4. Из каждого разведения проводили посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с плотной селективной питательной средой (BAIRD-PARKER Agar, Merck KGaA, Германия) и добавлением желточно-теллуритовой эмульсии Egg Yolk Tellurite Emulsion (Merck KGaA, Германия). Посевы инкубировали в термостате ТС-1/⁠80 СПУ (ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия) при температуре 35±2 °С в течение 48 ч. После инкубации проводили подсчет колоний, выросших на чашке, и делали соответствующий пересчет на 1 г ткани. Количественное содержание микроорганизмов в 1 г биоптата определяли по формуле:

N = n×10×10 (или ×100, или 1000), (2)

где N — количество микроорганизмов в 1 г биоптата; n — количество микроорганизмов, выросших на чашке; 10 — пересчет на 1 г суспензии; 10, 100 или 1000 — разведение материала, засеянного на чашку, где вели подсчет колоний.

Цитологическое исследование. Образцы для цитологического исследования получали методом поверхностной биопсии [28] на 15‑й день эксперимента. Материал для исследования отбирали посредством легкого соскоба поверхностного слоя раны ручкой хирургического скальпеля во время проведения эвтаназии и переносили тонким слоем на подготовленное предметное стекло. В дальнейшем проводили окраску препаратов по Романовскому—Гимзе и подсчет клеток (сегментоядерные нейтрофилы, фибробласты, лимфоциты и макрофаги) на различных участках. При оценке клеточного состава обращали внимание на преобладающее количество клеток в ране, характеризующее течение раневого процесса.

Гистологическое исследование. Раневые биоптаты для гистологического исследования были отобраны на 15‑й день эксперимента у эвтаназированных животных. Стерильным лезвием иссекали участок мягких тканей дна и прилежащего края раны с захватом здоровой ткани. Отобранный биологический материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после чего образцы заливали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Анализ гистологических препаратов проводили при помощи светооптического микроскопа Accu-Scope 3000 SERIES (Accu Scope Inc., СШA) при увеличении в 40, 100, 200 и 1000 раз. Микрофотографирование проводили, используя цифровую фотокамеру «Toupcam UCMOS05100kpa» (Китай) и программное обеспечение ToupView 3.7.7892 (Китай).

При оценке гистологических препаратов обращали внимание на выраженность воспалительных реакций, состояние грануляционной ткани, возникновение краевой эпителизации, структурную полноценность вновь образованного эпителия.

Анализ данных. Для всех данных была применена описательная статистика — результаты проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для данных, подчиняющихся закону нормального распределения, подсчитаны среднее значение (М) и ошибка среднего (SEM). Для оценки связанных результатов использовали дисперсионный анализ c повторными измерениями (Repeated measures ANOVA) и проведением в последующем post-hoc-теста Даннетта (Dunnett’s test). Статистический анализ и построение графиков выполняли с помощью GraphPad Prism 9.2.0 (GraphPad Software, США).

Результаты и обсуждение

Ожоговая травма разрушает защитный кожный барьер, вызывая различные реакции, в том числе усиление метаболизма, потерю влаги и нарушение работы иммунной системы [29]. Заживление ожоговой раны состоит из трех перекрывающихся фаз — воспаления (реактивной), пролиферации (репаративной) и созревания (ремоделирования). При воспалении вначале происходит очищение раны, обеспечивающее дальнейшую защиту от бактериальной инфекции [30].

На рис. 1 отражено изменение площади ран у крыс на протяжении эксперимента.

В ходе планиметрического исследования была отмечена тенденция к ранозаживлению на 5‑й день эксперимента. Уже на 9‑й день выявлено статистически значимое уменьшение площади раны у крыс по сравнению с исходным значением (5‑й день). Так, площадь раны сократилась на 27% на 9‑й день, а к 15‑му дню данный показатель достиг 65%.

Микробиологическое исследование показало сохранение бактериальной обсемененности раны животных. Так, титр Staphylococcus aureus ATCC 25923 log10 составил 6,7 КОЕ/⁠г.

Цитологическое исследование образцов раневой поверхности также подтвердило сохранность воспалительного процесса в ране. В первое время после ожоговой травмы популяция лимфоцитов снижается, а впоследствии лимфоциты активно привлекаются цитокинами нейтрофилов в ожоговую рану и играют важную роль в переходе от фазы воспаления к фазе ремоделирования ткани при заживлении посредством дифференцировки фибробластов [31]. На 15‑й день эксперимента в цитограммах животных отмечали преобладание сегментоядерных нейтрофилов над другими типами клеток, свидетельствующее о протекании воспалительного процесса в тканях (рис. 2). Нейтрофилы являются первыми иммунными клетками, проникающими в рану [32, 33], и представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток, отвечающих за удаление патогенов [34]. Нейтрофилы, выполнившие свои задачи, подвергаются апоптозу, а это приводит к ослаблению воспалительной реакции. При этом меньше всего в клеточном инфильтрате содержалось макрофагов, что характерно для ожоговых ран [35].

Фаза пролиферации обычно происходит с образованием грануляционной ткани и продолжается около 2 нед. На этой стадии формируются новые кровеносные сосуды с целью обеспечения трофики ткани, а фибробласты мигрируют в рану для последующей пролиферации [36, 37].

В ходе гистологического исследования были зафиксированы начальные этапы формирования грануляционной ткани, которая заполняет дефект и необходима для сокращения поверхности раны и последующего заживления. Среди незрелой соединительной ткани наблюдали диффузный выраженный воспалительный инфильтрат, представленный большим количеством гранулоцитов и фибробластов. Краевая эпителизация не полная, слабо выражена, а в строении регенерирующего эпителия не прослеживалась структурированность (рис. 3).

В центре раны сохранялись небольшие участки некроза, постепенно замещаемые грануляционной тканью, в которой присутствовало большое количество капилляров. Однако ближе к периферии раны процесс ангиогенеза более выражен, и можно наблюдать вновь образованные толстостенные сосуды, которые прорастали к центру раны. Вероятно, процесс ангиогенеза начинается относительно быстро после ожоговой травмы [38]. В целом это динамическое протекание ангиогенного процесса согласуется с развитием грануляционной ткани для последующего замещения ее зрелой соединительной, а также эпителизации раневого дефекта.

Заключение

Разработанная модель инфицированной ожоговой раны кожи у крыс является релевантной и доступной для доклинических исследований противоожоговых терапевтических агентов. Показатели, полученные в планиметрическом, микробиологическом, цитологическом и гистологическом исследованиях, наиболее значимо отображают очищение раны и происходящие репаративные процессы. Данная модель является релевантной для изучения фармакологического действия антисептических средств и местных противоожоговых агентов с противомикробным компонентом механизма действия. Принимая во внимание естественную скорость заживления ожоговой раны у крыс, оптимальный курс введения тестируемого объекта составляет 10 дней. Описанная модель является подходящей для изучения лекарственных средств со следующими кодами анатомо-терапевтическо-химической классификации (АТХ): D03; D06; D08; G01.