Экспериментальные модели для оценки моноклональных антител при заболеваниях органов дыхания

Введение

Использование моноклональных антител (МАТ) для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний давно и широко известно. Вместе с тем исследования об их применении при заболеваниях органов дыхания появились недавно; они довольно редки, хотя, как было показано на конференции «Терапевтические моноклональные антитела к респираторным заболеваниям: Современные проблемы и перспективы» во Франции 31 марта 2016 г., МАТ обладают огромным потенциалом в лечении пациентов с заболеваниями легких [1]. Особенно актуальным является возможность использования МАТ у пациентов с резистентностью к системным и/или ингаляционным кортикостероидам. Кроме того, применение МАТ расширяет возможности для лечения таких больных, позволяя снизить дозы кортикостероидов.

Внедрение любых лекарственных препаратов в клиническую практику начинается с экспериментальных исследований in vitro и in vivo. При этом важнейшее значение имеет выбор адекватных поставленным задачам моделей эксперимента как in vitro, так и на животных.

Цель настоящего обзора – анализ оценки новых МАТ и особенностей моделирования заболеваний органов дыхания у животных. Особое внимание уделялось видам животных, наиболее подходящим для конкретных задач и этапов исследования МАТ, а также методам оценки эффективности изучаемых лекарственных средств.

Моноклональные антитела и их использование для лечения болезней легких

Моноклональные антитела (МАТ) – это иммуноглобулины, производимые путем клонирования гибридомными клетками клеток, возникших из одной клетки [2]. Первыми МАТ, которые вошли в клинику, были мышиные (полученные только из мыши), но их высокая иммуногенность вызывала выраженную непереносимость и существенно ограничивала их использование. Рекомбинантные ДНК-технологии позволили заменить мышиные последовательности в МАТ на соответствующие человеческие аналоги. В настоящее время все антитела являются либо гуманизированными (часть участков мышиного антитела заменена на участки человека) либо полностью человеческими антителами IgG [3]. МАТ используются для подавления иммунитета при трансплантации органов, лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний, профилактике инфекционных заболеваний [2, 4, 5]. В 2015 г. было известно >100 МАТ на различных стадиях исследования и использования при различных заболеваниях, кроме вышеуказанных, при сердечно-сосудистых, неврологических и других заболеваниях. Исследования в отношении заболеваний органов дыхания начались совсем недавно, их совсем мало [1].

Как отмечают F. Marqués-García, E. Marcos-Vadillo [6], у некоторых пациентов с заболеваниями легких, лечение кортикостероидами может быть неэффективным или у них может развиваться резистентность к ингаляционным кортикостероидам. Поэтому для лечения таких тяжелых заболеваний легких, как бронхиальная астма (БА), идиопатический легочный фиброз и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), все чаще используются МАТ, нацеленные на связывание с различными цитокинами, включая интерлейкины (IL)-13 и IL5 [1]. Применение МАТ расширяет возможности для лечения таких больных.

Первым МАТ, одобренным FDA (U. S. Food and Drug Administration) для лечения БА в 2003 г., был омализумаб [6]. В настоящее время для лечения тяжелой БА, наряду с омализумабом, который является анти-IgE агентом, используются меполизумаб и реслизумаб, которые связываются непосредственно с IL-5 и предотвращают его соединение с рецептором IL-5 (IL-5R), а также бенрализумаб, который соединяется с Α-субъединицей IL-5R на эозинофилах и базофилах, предотвращая связывание IL-5, и дупилумаб, который был специально разработан для ингибирования сигнализации IL-4 и IL-13 [1, 2, 3]. Последние МАТ одобрены для лечения заболеваний легких в 2015–2018 гг., в том числе и для больных ХОБЛ.

Большинство МАТ, предназначенных для лечения заболеваний легких, вводят подкожно (омализумаб, бенрализумаб, дупилумаб), некоторые – внутривенно (меполизумаб, реслизумаб), обычно 1 раз в 2–3 недели. Вместе с тем для МАТ, используемых для лечения болезней легких, существенный интерес представляет ингаляционный путь введения, который в настоящее время только начали изучать. По сравнению с подкожным и внутривенным введением, ингаляция МАТ может обеспечить более быстрое действие при более низких дозах, чем системное лечение, и может быть целесообразна для более широкого круга пациентов [3]. Указанное позволит уменьшить токсичность, связанную с системным воздействием, улучшить переносимость, что приведет к устойчивым высоким уровням накопления молекул, сохраняющих МАТ.

До сих пор нерешены такие вопросы, как причины, влияющие на подкожную биодоступность, прогнозирование иммуногенности, влияние молекулярных свойств МАТ (заряд, гидрофобность, гликозилирование) и их взаимозависимости. Кроме того, не проводились исследования лекарственного взаимодействия МАТ с другими средствами, используемыми при лечении заболеваний легких [3]. Вместе с тем применение МАТ может сопровождаться различными побочными, далеко не безопасными, эффектами. Поэтому весьма актуально создание адекватных моделей для исследования МАТ при болезнях органов дыхания.

Экспериментальные модели для оценки МАТ при заболеваниях органов дыхания

Доклинические исследования МАТ на животных, как и любых лекарственных препаратов, необходимы до начала их использования у людей. Причем МАТ человека могут быть протестированы не только на приматах при наличии достаточной перекрестной реактивности, но и на мышах, морских свинках, крысах, кроликах [7, 8]. Так, в последнее время благодаря созданию мышей с гуманизированной иммунной системой и нокаутных мышей, у которых мышиный белок заменен человеческим аналогом, например, фактор некроза опухоли (TNF), CD20 и другие, исследования по оценке МАТ стали гораздо доступнее и дешевле [1]. Эти новые гуманизированные мыши позволяют in vivo исследовать эффективность, фармакокинетику и, что важно, новые пути введения, такие как ингаляционный, особо важный для лечения болезней легких. Это позволит существенно снизить затраты на доклинические исследования и уменьшить стоимость препаратов МАТ, которая в настоящее время составляет десятки тысяч рублей за 1 дозу препарата.

Модели на животных имеют решающее значение в оценке влияния MAТ; при этом выбор вида животного зависит от конкретного научного вопроса и модели, которая способна лучше всего имитировать болезнь человека [1]. При этом за основу моделей заболеваний дыхательных путей следует брать современные наиболее эффективные и адекватные модели. Как указывалось выше, мыши все чаще используются в качестве модели для изучения патогенеза БА и ХОБЛ, а также для поиска новых методов лечения [1]. Так, наибольшее число доклинических исследований по БА проведено именно на мышах, причем преимущественно диких пород – C57BL/6 и BALB/c; несколько реже используются крысы линии Wistar, морские свинки и кролики [9]. По мнению S.D. Keir и соавт. [10], для моделирования БА и последующих процедур с животными хорошо подходят кролики, у которых развивается выраженный бронхоспазм, воспаление дыхательных путей и гиперчувствительность бронхов; при этом они достаточно велики для постоянного отбора проб крови и легких в течение всего эксперимента. Обезьяны, наиболее близкие по анатомии и физиологии человеку, используются крайне редко как по этическим соображениям, так и вследствие высокой их стоимости. В связи с этим большинство исследователей, рекомендуя модели на грызунах, для повышения точности исследований предлагают изучать как можно большее число показателей состояния животных, а не только несколько аллергологических проб [1].

Для моделирования БА в эксперименте наиболее часто применяется внутрибрюшинное, реже – подкожное, введение овальбумина в течение 7–14 дней с последующим интраназальным введением или распылением через несколько дней аэрозоля овальбумина с периодичностью 1–2 раза в неделю, обычно 3–5 раз по 20–30 мин в день [9]. Для внутрибрюшинного и подкожного введения применяют от 10 до 100 мкг у мышей, 1 мг – у крыс, от 1 до 20 мг – у морских свинок, 10 мг – у кроликов. Интраназально и для распыления в специальных камерах используют 1–4% аэрозоль овальбумина. Кроме овальбумина иногда используют пылевых клещей, хлопковую пыль и другие аллергены.

В настоящее время «золотым стандартом» для исследования ХОБЛ является мышиная модель, при этом мыши подвергаются воздействию сигаретного дыма в течение 6 мес [11]. Так, например, G. Desoubeaux и соавт. [1] указывают следующие преимущества таких моделей:

• развитие патологии сходной с таковой у человека (воспаление легких, фиброз мелких дыхательных путей и расширение воздушного пространства);
• геномом мышей можно манипулировать, чтобы удалять или чрезмерно экспрессировать отдельные гены;
• высокая скорость размножения;
• низкая стоимость ухода и исследования.

Однако имеются и недостатки подобных моделей для изучения ХОБЛ на мышах: существенные отличия от анатомии и иммунологии человека, отсутствие гиперсекреции слизи, имеющей важное значение в патогенезе хронического бронхита у человека, а также сложности в заборе крови и ткани легких на протяжении длительного эксперимента [1]. Поэтому ряд исследователей выявленные на грызунах особенности рекомендуют подтверждать на нечеловекообразных обезьянах [12].

Таким образом, мышей можно и нужно использовать на начальных этапах исследования МАТ для предварительной оценки их действия при моделировании заболеваний органов дыхания. Однако окончательные экспериментальные исследования МАТ следует проводить на более крупных и близких человеку животных (морские свинки, кролики, мини-свиньи, обезьяны). При этом необходимо изучение различных путей введения: подкожного, внутривенного и ингаляционного. При оценке эффективности МАТ следует учитывать, что период полувыведения МАТ, введенных внутривенно, составляет около 3 нед [1].

Показатели, используемые для оценки заболеваний легких у животных

Критерии эффективности исследуемых лекарственных средств при экспериментальном моделировании БА: оценка резистентности бронхов и трахеи в ответ на введение метахолина или гистамина, эозинофилии в крови и лаваже легких, воспалительных медиаторов и цитокинов (при развитии БА уменьшается число клеток CD4⁺ и CD25⁺, а IL-5, TNFα, NF-κB, NO, IL8, IL2, IL6, IL13, а некоторых других – увеличивается). Кроме того, при развитии БА увеличивается содержание кортикостерона в плазме крови, а также гистамина в лаваже легких. Гистологическая картина БА характеризуется отеком, утолщением мембраны, нарушением целостности эпителия и воспалительной клеточной инфильтрацией слизистой трахеи и бронхов, метаплазией бокаловидных клеток, гипертрофией эпителия, субэпителиальным фиброзом и гиперплазией гладкой мускулатуры [9].

Заключение

Как показал анализ литературы по моделированию в эксперименте на животных заболеваний дыхательных путей (бронхиальной астмы, хронической обструктивной болезни легких) для оценки лечебного влияния моноклональных антител, главным является выбор наиболее современных, эффективных и адекватных исследуемому заболеванию моделей.

Для моделирования заболеваний органов дыхания у животных используют внутрибрюшинное и подкожное введение овальбумина с последующим его интраназальным введением или распылением (БА) или воздействие сигаретного дыма (ХОБЛ). При этом дозы овальбумина варьируют в зависимости от вида животных от 10 мкг у мышей до 10 мг у кроликов.

Несмотря на то, что модели болезней органов дыхания на мышах имеют определенные недостатки (различия с человеком в анатомии, физиологии и иммунологии, сложности отбора проб крови и ткани легких в динамике и др.), мыши все-таки чаще используются для поиска средств лечения этих заболеваний, в том числе и МАТ. Причем широко применяются наиболее дешевые мыши диких пород – C57BL/6 и BALB/c. Однако, если мышей можно использовать на начальных этапах исследования МАТ для предварительной оценки их действия на организм, то подтвердить полученные на мышах данные следует на более крупных и близких человеку животных – морских свинок, кроликах, мини-свиньях, обезьянах. Важным при изучении влияния МАТ на состояние дыхательных путей, наряду с такими стандартными для МАТ путями введения, как внутривенный и подкожный, является оценка ингаляционного пути. Для повышения точности результатов исследований МАТ, в особенности на грызунах, рекомендуется изучить максимальное число показателей состояния организма. Так, для оценки эффективности исследуемых МАТ при заболеваниях дыхательных путей, наряду с показателями резистентности бронхов и трахеи, содержание эозинофилов в крови и лаваже легких, отдельных медиаторов и цитокинов, необходимо углубленное изучение гистологической картины бронхолегочного аппарата.