Бочарова О.А., Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Аксенов А.А., Кучеряну В.Г., Матвеев В.Б. Регуляция интерлейкинов-6 и -10 cухим экстрактом фитоадаптогена для профилактики спонтанных гепатокарцином. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-04-01
Цель работы — изучить возможность регуляции уровня интерлейкинов (ИЛ) -6 и -10 в сыворотке крови мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY), генетически предрасположенных к спонтанному гепатоканцерогенезу. Животные контрольной группы получали воду в качестве питья на всем протяжении эксперимента, опытной группы — 0,3% водный раствор сухого экстракта комплексного фитоадаптогена (КФА) в течение 1-го месяца жизни (профилактическое применение). Препарат представляет собой сублимированную форму водно-спиртового экстракта КФА, включающего компоненты 40 растительных экстрактов, в том числе адаптогенов (Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea, Aralia mandshurica spp.). Показаны иммуномодулирующие, антимутагенные, антиоксидантные, антистрессорные, противоопухолевые свойства КФА. Образцы сыворотки крови анализировали у животных в возрасте 4, 8 и 22 мес. Уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Статистический анализ данных проводили в программе Statistica 6.0. В результате было показано, что развитие спонтанных гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА сопровождается повышением уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови. Воздействие нетоксичного иммуномодулятора на примере сухого экстракта КФА в профилактическом режиме приводило к снижению уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. Аналогичный эффект был выявлен ранее и для жидкой формы КФА. Высокие уровни ИЛ-6 и ИЛ-10, вероятно, являются компонентами сети цитокинов, ассоциированными с канцерогенезом, и могут быть подвержены регуляции при воздействии КФА в раннем онтогенезе. Совместный ансамбль усиления адгезионных взаимодействий эффекторов иммунитета с опухолевыми клетками и снижения ИЛ-6 и ИЛ-10 может иметь существенное значение для профилактики возникновения генетически обусловленных гепатокарцином.
Цитокины играют важную роль в межклеточных взаимодействиях при регуляции таких процессов, как эмбриогенез, дифференцировка иммунокомпетентных клеток, синтез белков острой фазы воспаления, ангиогенез, хемотаксис лейкоцитов, гемопоэз, апоптоз [1].
Данные литературы указывают, что в большинстве случаев опухолевая прогрессия сопровождается увеличением уровня интерлейкинов (ИЛ) 6 и 10 в сыворотке крови. Так, ИЛ-6 и ИЛ-10 были повышены при остеосаркоме, раке желудка, толстой кишки, гепатоцеллюлярном раке, меланоме, раке поджелудочной железы. Обсуждается связь этих цитокинов с негативным прогнозом заболевания и «уклонением» от иммунологического надзора [2, 3]. Вместе с тем встречаются результаты, в которых эта корреляция не прослеживается [4, 5].
ИЛ-6 — многофункциональный провоспалительный цитокин. Имеются убедительные доказательства его роли в прогрессировании опухолевого процесса, развитии метастазирования, кахектических явлений, ангиогенезе опухоли. ИЛ-6 является серьезным кандидатом в качестве основного медиатора как местных, так и системных воспалительных реакций, связанных с развитием новообразований [6, 7]. Вместе с тем повышение уровня ИЛ-6 приводит к активации сигнальных путей различных киназ (JAK, STAT3, PI3K, Akt, Ras-MAPK), что способствует пролиферации опухолевых клеток, а также усилению множественной лекарственной устойчивости у онкологических больных [8].
ИЛ-10 в свою очередь рассматривается как ключевой противовоспалительный цитокин. ИЛ-10 является мощным ингибитором антигенпрезентирующей способности дендритных клеток и макрофагов. Его активация может приводить к дисфункции эффекторных механизмов в отношении опухоли [9].
В связи с изложенным исследование участия ИЛ-6 и ИЛ-10 в контроле опухолеобразования остается актуальным. Также важен поиск воздействий, регулирующих их продукцию.
Проведенные ранее исследования на примере профилактического воздействия комплексного фитоадаптогена (КФА) в форме жидкого экстракта у мышей-самцов СВА показали значимость коррекции иммуноадгезионных параметров, в том числе экспрессии β2-лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, а также содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови для снижения частоты опухолеобразования, повышения продолжительности и качества жизни животных [10–14]. КФА — стандартизованная фармацевтическая композиция, обладающая адаптогенными свойствами, включая иммуномодулирующее, антимутагенное, антиоксидантное, антистрессорное, противоопухолевое [15–21]. В состав препарата входит широкий спектр биологически активных веществ, в том числе тритерпеновые сапонины, флавоноиды, эфирные масла, аминокислоты, витамины и другие соединения [22–24].
Цель исследования — изучить возможность коррекции уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови мышей-самцов СВА при спонтанном гепатоканцерогенезе сухим экстрактом комплексного фитоадаптогена для контроля иммуноадгезионных механизмов.
Исследование проводили на 105 мышах-самцах СВА (сублиния СВА/Lac Y), генетически предрасположенных к спонтанному гепатоканцерогенезу. В исследование были включены опытная (n = 39) и контрольная (n = 66) группы животных. Источник получения мышей: локальная колония ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» (Россия). Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, температура воздуха 22—26оС, относительная влажность воздуха 40–75%) на стандартном рационе питания. Животных выводили из эксперимента в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), согласно правилам надлежащей лабораторной практики.
Животные контрольной группы получали воду в качестве питья на всем протяжении эксперимента, опытной группы — 0,3% водный раствор сухого экстракта КФА в профилактическом режиме. Профилактический режим: КФА применяли в течение 1-го месяца жизни мышей, включая период (5–15-й день постэмбрионального онтогенеза), соответствующий завершению дифференцировки нормальной ткани печени [25]. Самки получали препарат, начиная с последних сроков беременности, до отъема детенышей в возрасте 3 нед. Затем 1 нед детеныши-самцы пили воду с препаратом самостоятельно. После этого до конца эксперимента опытные животные получали воду.
Содержание ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови определяли у животных в 3 временных периодах — в возрасте 4, 8 и 22 мес. В первой временной точке исследования (4 мес) масса тела контрольных мышей составила 30,4 ± 0,3 г, опытных — 31,0 ± 0,4 г. ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с использованием тест-наборов фирмы «Diaclone» (Франция), спектрофотометра (λ = 450 нм).
Сухой экстракт КФА представляет собой сублимированную форму водно-спиртового экстракта КФА, включающего компоненты 40 растительных экстрактов, в том числе адаптогенов (Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea, Aralia mandshurica и др.).
Статистический анализ результатов проводили с использованием компьютерной программы Statistica 6.0. Для определения нормального характера распределения данных использовали тест Колмогорова—Смирнова; межгрупповые различия оценивали по однофакторному дисперсионному анализу One-Way ANOVA c post-hoc-тестом Ньюмена—Кейлса (Newman—Keuls). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M ± SEM).
В табл. 1 представлена динамика уровня ИЛ-6 в сыворотке крови мышей-самцов СВА контрольной группы, а также опытной, получавших сухой экстракт КФА кратковременно в раннем онтогенезе.
У контрольных животных в возрасте 4 и 8 мес сывороточный уровень ИЛ-6 статистически не различался (84,2±5,2 и 89,7±4,1 пг/мл соответственно). К 22-месячному возрасту значение данного показателя статистически достоверно возросло до 140,2±7,2 пг/мл.
У мышей опытной группы сывороточный уровень ИЛ-6 в возрасте 4 и 8 мес также статистически не различался (82,0±4,4 и 85,1±5,8 пг/мл соответственно). Различий не выявлено и по сравнению с контрольной группой в эти же периоды онтогенеза. К 22-месячному возрасту значение изучаемого показателя статистически значимо возросло до 117,0±7,2 пг/мл, отставая статистически достоверно от значения у контрольных мышей.
Динамика уровня ИЛ-10 в сыворотке крови контрольных мышей-самцов СВА, а также получавших сухой экстракт КФА кратковременно в раннем онтогенезе, представлена в табл. 2.
У контрольных животных к 8-месячному возрасту изменения показателя не наблюдали по сравнению с 4 мес (37,0±3,9 и 30,3±3,0 и пг/мл соответственно), а к 22-месячному возрасту отмечали статистически достоверное повышение до 65,0±4,1 пг/мл.
У мышей опытной группы содержание ИЛ-10 в сыворотке крови в возрасте 4 и 8 мес статистически не различалось (25,3±2,4 и 29,4±3,4 пг/мл соответственно). В возрасте 22 мес этот показатель достоверно увеличился по своей группе до 50,3±4,7 пг/мл, но не достиг уровня значения у контрольных мышей. Таким образом, воздействие сухого экстракта КФА способствовало снижению уровня образования ИЛ-10 по сравнению с контрольными животными.
Обсуждая полученные результаты с учетом предыдущих исследований, следует отметить, что при физиологической регуляции воспаления наряду с другими провоспалительными цитокинами — ИЛ-1, ИЛ-12 и фактор некроза опухолей-α (ФНО-α) — ИЛ-6 подавляется c участием ИЛ-10, который способствует снижению воспалительной реакции [26]. При опухолевом процессе этого не происходит. Показано, что независимо от типа опухоли у пациентов на поздних стадиях заболевания наблюдается одновременная иммуностимуляция и иммуносупрессия с повышенными концентрациями цитокинов, включая ИЛ-6 ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-18, ФНО-α, трансформирующий фактор роста-β (TФР-β), т.е. нарушается отрицательная обратная связь между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами [27].
Результатом повышения провоспалительных цитокинов является местное воспаление, которое сопровождает развитие злокачественных опухолей. Параллельная индукция иммуносупрессивных цитокинов ИЛ-10 и TФР-β приводит к подавлению антигенпрезентирующей способности дендритных клеток и макрофагов, а также дисфункции эффекторных клеток как врожденной, так и адаптивной иммунной системы, что в конечном итоге защищает опухолевые клетки от иммунологического надзора [28].
Снижение содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови при профилактическом воздействии КФА как в жидкой, так и сухой форме согласуется с данными литературы о подобных эффектах фенольных соединений (тритерпеновых сапонинов, танинов, катехинов) [29]. Последние являются составляющими компонентами КФА [15, 22, 24]. В качестве одного из механизмов полагают ингибирование сигнального пути NF-κB, а также активацию ферментов антиоксидантной защиты [30, 31].
Вместе с тем снижение концентрации ИЛ-6 в сыворотке крови мышей СВА под влиянием сухого экстракта КФА, вероятно, блокирует синтез антител, экранирующих антигены опухолевых клеток и рецепторы эффекторов иммунитета. Таким образом нарушается защита клеток опухоли от элиминации последними.
Принимая во внимание взаимосвязь цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10, следует учесть, что обнаруженное под влиянием сухого экстракта КФА снижение концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови влечет за собой уменьшение и синтеза ИЛ-6. Последнее может приводить к восстановлению экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 на опухолевых клетках, что способствует повышению функциональной активности эффекторов иммунитета и синтеза ими реактивных интермедиатов кислорода и азота. Вместе с тем может увеличиваться продукция ИФН-γ, ИЛ-2, в том числе Т-лимфоцитами, макрофагами, моноцитами, дендритными клетками, нейтрофилами, что также важно для активизации реакций иммунитета против опухоли [32].
Учитывая результаты предыдущих работ о повышении экспрессии β2-лейкоцитарных интегринов на клетках крови мышей-самцов СВА при спонтанном гепатоканцерогенезе при воздействии КФА [10, 14, 33], можно полагать, что совместный ансамбль усиления адгезионных взаимодействий эффекторов иммунитета с опухолевыми клетками и нормализации ИЛ-6 и ИЛ-10 может иметь существенное значение для профилактики возникновения генетически обусловленных гепатокарцином.
При спонтанном гепатоканцерогенезе у мышей-самцов СВА в позднем онтогенезе концентрация ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови возрастает. Высокие уровни ИЛ-6 и ИЛ-10, вероятно, являются компонентами сети цитокинов, ассоциированными с опухолеобразованием и могут быть подвержены регуляции при воздействии комплексным фитоадаптогеном в раннем онтогенезе. Совместный ансамбль усиления адгезионных взаимодействий эффекторов иммунитета с опухолевыми клетками и нормализации ИЛ-6 и ИЛ-10 может иметь существенное значение для профилактики возникновения генетически обусловленных гепатокарцином.
О.А. Бочарова — разработка дизайна исследования, планирование работы, анализ рукописи;
Р.В. Карпова — получение данных и анализ результатов, написание текста рукописи;
Е.В. Бочаров — получение данных и анализ результатов, написание текста рукописи;
А.А. Аксенов — обзор публикаций по теме исследования;
В.Г. Кучеряну — обзор публикаций по теме исследования;
В.Б. Матвеев — анализ рукописи
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.