Бочарова О.А., Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Вершинская А.А., Барышникова М.А., Девришов Д.А., Казеев И.В., Кучеряну В.Г., Киселевский М.В. Модуляция экспрессии молекул адгезии на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-01-05
Цель работы – изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18) на клетках периферической крови у мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепатоканцерогенезе под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена.
Контрольные мыши получали воду в качестве питья. Животные опытной группы – 0,3% водный раствор сухого экстракта комплексного фитоадаптогена в течение 1-го месяца жизни (профилактическое применение). Препарат был изготовлен по технологии сублимирования из жидкой формы комплексного фитоадаптогена, включающего компоненты экстрактов 40 растений, в том числе Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea и другие адаптогены. Уровень экспрессии CD11a и CD11b антигенов на клетках периферической крови определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Параметры фиксировали у мышей в возрасте 4, 8, 22 мес. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Спонтанный гепатоканцерогенез у мышей СВА сопровождался снижением экспрессии CD11a и CD11b антигенов на клетках периферической крови. Воздействие сухого экстракта комплексного фитоадаптогена способствовало повышению уровня экспрессии CD11a и CD11b антигенов по сравнению с контрольными животными. Эффективность сухого экстракта сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании.
Повышение уровня молекул LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе под воздействием нетоксичного иммуномодулятора в ранний период жизни животных на примере сухого экстракта комплексного фитоадаптогена может иметь значение для усиления адгезии между иммунными эффекторами и опухолевыми клетками.
β2-Интегрины, в частности LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1, CD11a/CD18) и Mac-1 (monocyte adhesion complex CD11b/СВ18), играют существенную роль в привлечении активированных цитотоксических лимфоцитов из периферической крови в опухолевую ткань. Контррецепторами LFA-1 и Mac-1 являются гистонеспецифические молекулы адгезии ICAM-1, участвующие также в поддержании гомотипической интеграции тканей [1].
Согласно исследованиям ряда авторов, ослабленная экспрессия ICAM-1 на мембранах опухолевых клеток представляет собой механизм, подавляющий экспрессию LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови, что снижает прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, а также приводит к внутриопухолевой инфильтрации лейкоцитов [2; 3]. Очевидно, что изучение возможности восстановления адгезионных контактов при опухолевом процессе может внести вклад в реализацию противоопухолевого эффекта.
Интерес в этой связи представляют фитоадаптогены, нормализующие межклеточную адгезию, усиливая процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма [4, 5].
На модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей СВА ранее было выявлено, что кратковременное в раннем онтогенезе воздействие на примере комплексного фитоадаптогена (КФА) в форме жидкого экстракта приводит к усилению экспрессии LFA-1 и Mac-1 интегринов на клетках периферической крови. Оно сопровождается признаками лейкоцитарной инфильтрации и деструкции гепатом, подавлением сывороточного уровня иммуносупрессивных интерлейкинов 6 и 10. Эти результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования и увеличения продолжительности и качества жизни животных [6–9].
Однако остался невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также не ясно, экспрессированы ли на этих клетках, в частности, адгезионные молекулы LFA-1 и Mac-1 при использовании комплексного фитоадаптогена. При этом с фармакологической точки зрения более современной и перспективной является сухая форма экстракта, практически субстанция препарата.
Таким образом, исследование возможности модуляции экспрессии молекул адгезии LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе на примере нетоксичного иммуномодулятора сухого экстракта комплексного фитоадаптогена (СКФА), а также оценка значимости коррекции нарушений для усиления адгезии между иммунными эффекторами и опухолевыми клетками весьма актуальны.
Цель исследования – изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18) на клетках периферической крови у мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепатоканцерогенезе на под воздействием СКФА.
Работа проведена на мышах-самцах высокораковой линии СВА, сублиния СВА/Lac Y [10]. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с требованиями Европейской директивы по охране животных, используемых в научных целях. Контрольные животные (n = 33) получали в качестве питья воду, животные опытной группы (n = 36) – 0,3% водный раствор СКФА в 1-й месяц жизни (профилактическое воздействие).
КФА представляет собой нетоксичную фармацевтическую композицию на основе компонентов экстрактов 40 растений, в том числе фитоадаптогенов (женьшеня, элеутерококка, аралии и др). В составе КФА определены тритерпеновые сапонины, флавоноиды, эфирные масла, аминокислоты, витамины и другие соединения. Разработаны способы его биологической и физико-химической стандартизации [11–13].Выявлены антиоксидантные, антистрессорные, гормономодулирующие, антимутагенные, противоопухолевые и иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства [14–17]. СКФА был приготовлен из жидкой формы с использованием технологии сублимирования.
У контрольных и опытных животных в возрасте 4, 8, 22 мес на клетках периферической крови исследовали уровни экспрессии СD11a и CD11b антигенов методом непрямой иммунофлюоресценции. Оставшиеся животные находились под наблюдением вплоть до их естественной гибели.
Статистический анализ данных проводили с использованием программы «STATISTICA 6.0», применяя дисперсионный анализ ONE–WAY ANOVA. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для оценки различий между группами применяли критерий Newman–Keuls. Статистически значимым считали различия при p <0,05.
Результаты воздействия СКФА на экспрессию CD11a антигена клетками крови у мышей-самцов СВА в онтогенезе представлены в табл. 1, из которой видно, что в возрасте 4 и 8 мес у мышей обеих групп количество клеток, экспрессирующих CD11a антиген, статистически не различалось (p≥0,5). К 22-месячному возрасту у мышей контрольной группы выявлено статистически достоверное снижение этого показателя с 45,9±3,4% (в возрасте 8 мес) до 36,5±1,9% (р8–22=0,03). У мышей опытной группы к 22 мес изменение экспрессии CD11a антигена по сравнению с ранним периодом онтогенеза происходит статистически не значимо (52,3±3,0 и 44,6±2,1% соответственно, р4–22=0,05). По сравнению с 8 месячным возрастом этот показатель статистически не различался (р8–22=0,2). Отметим, что значение этого показателя оказалось выше в сравнении с аналогичным периодом онтогенеза (22 мес) у контрольных мышей (р1–2=0,01).
Таблица 1
Экспрессия CD11a антигена на клетках периферической крови у мышей СВА при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена
Группа животных |
CD 11a+ клетки, % |
||||
4 мес |
8 мес |
22 мес |
p |
||
1 |
Контроль (интактные) |
49,4±3,6 |
45,9±3,4 |
36,5±1,9 |
р4–8=0,5 р8–22=0,03 р4–22=0,005 |
|
n=33 |
n=11 |
n=10 |
n=11 |
|
2 |
Опыт (воздействие СКФА) |
52,3±3,0 |
49,0±2,9 |
44,6±2,1 |
р4–8=0,4 р8–22=0,2 р4–22=0,05 |
|
n=36 |
n=11 |
n=10 |
n=11 |
|
|
р |
р1–2=0,5 |
р1–2=0,5 |
р1–2=0,01 |
|
Примечание. Здесь и в табл. 2: n – количество животных; р1–2 – различие показателя между группами; р4–8 – различие показателя в 4 и 8 мес.; р8–22 – различие показателя в 8 и 22 мес.; р4–22 – различие показателя в 4 и 22 мес.
Результаты воздействия СКФА на экспрессию CD11b антигена клетками крови мышей СВА в онтогенезе представлены в табл. 2, из даееых которой следует, что у мышей контрольной группы количество клеток, экспрессирующих CD11b антиген, в возрасте 8 мес (12,1±1,7%) достоверно не отличалось от такового у 4-месячных животных (13,4±1,7%; р4–8=0,6). В возрасте 22 мес этот показатель статистически достоверно снизился до 6,8±1,1% (р8-22=0,02; р4-22=0,004). У опытных мышей уровень экспрессии CD11b антигена в возрасте 4 и 8 мес не различался (17,2±1,5 и 15,6±1,4%; р4–8=0,5), но имел тенденцию к повышению по сравнению с контрольными животными в аналогичные периоды онтогенеза (р1–2=0,1). К 22-месячному возрасту уровень экспрессии снизился до 12,1±1,1% (р8–22=0,06; р4–22=0,01). Вместе с тем в позднем онтогенезе в данной группе уровень экспрессии CD11b антигена достоверно превышал таковое у мышей контрольной группы в этом возрасте (р1–2=0,003).
Таблица 2
Экспрессия CD11b антигена на клетках периферической крови у мышей СВА при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена
Группа животных |
CD 11b+ клетки, % |
||||
4 мес |
8 мес |
22 мес |
p |
||
1 |
Контроль (интактные) |
13,4±1,7 |
12,1±1,7 |
6,8±1,1 |
р4–8=0,6 р8–22=0,02 р4–22=0,004 |
|
n=33 |
n=12 |
n=12 |
n=12 |
|
2 |
Опыт (воздействие СКФА) |
17,2±1,5 |
15,6±1,4 |
12,1±1,1 |
р4–8=0,5 р8–22=0,06 р4–22=0,01 |
|
n=36 |
n=12 |
n=12 |
n=12 |
|
|
p |
р1–2=0,1 |
р1–2=0,1 |
р1–2 =0,003 |
|
Таким образом, согласно полученным результатам, при профилактическом воздействии СКФА у опытных мышей число клеток крови, экспрессирующих молекулы LFA-1 (СD11a/CD18) и Mac-1 (СD11b/CD18), выше по сравнению с таковым показателем у контрольных животных.
Так как лигандами LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, возможно, что увеличение числа клеток периферической крови, экспрессирующих интегрин CD11a, под воздействием СКФА будет способствовать более высокой иммунореактивности таких животных в осуществлении киллинга клеток-мишеней эффекторами иммунитета (NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами) [18, 19].
При этом молекула Mac-1 экспрессируется на нейтрофилах, лимфоцитах и NK-клетках, являясь лигандом, в том числе ICAM-1. Поэтому аналогичные выводы уместны и в отношении повышенного уровня экспрессии CD11b антигена у мышей опытной группы по сравнению с контрольными животными. В данном случае также возможна активация способности иммунных эффекторов инфильтрировать опухоль, контактировать с клетками-мишенями, что способствует гибели последних [20].
На основании предшествующих и настоящих исследований можно полагать, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе сниженная активность Т-лимфоцитов обусловлена, в том числе недостатком экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета. Фитоадаптогены, оказывающие адгезиогенное действие, способны нормализовать указанные показатели.
Таким образом, при введении СКФА в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза высокогепатомным мышам, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени (5–15-й день постнатального развития) можно обеспечить длительный по времени эффект повышения экспрессии на клетках крови молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1.
Вместе с тем, эффективность профилактического воздействия СКФА на уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании [6].
Повышение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови при профилактическом воздействии сухого экстракта мультифитоадаптогена может иметь значение для усиления контактных взаимодействий иммунных эффекторов с опухолевыми клетками.
Вклад авторов: все авторы внесли существенный вклад в работу над статьей и несут ответственность за ее содержание.