Регуляторные и методические аспекты доклинических и клинических исследований кормовых добавок для животных

Д.Р. Каргопольцева(1), ветеринарный врач группы специфической токсикологии, К.Л. Крышень(1), кандидат биологических наук, руководитель отдела токсикологии и микробиологии, М.Н. Макарова(2), доктор медицинских наук, директор, В.Г. Макаров(1), доктор медицинских наук, заместитель директора НПО «Дом Фармации» 1-Институт доклинических исследований, 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245; 2-Научно-производственное объединение «Дом Фармации», 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245 Е-mail: agasieva.dr@doclinika.ru

Резюме

В последние годы в связи с развитием сельского хозяйства и ростом числа владельцев домашних животных происходит стремительное развитие ветеринарии не только в Российской Федерации, но и во всем мире. Попутно с развитием ветеринарной медицины идет и совершенствование ветеринарной фармацевтики, которая разрабатывает и производит все больше ветеринарных препаратов и кормовых добавок для животных. Для попадания на рынок новых кормовых добавок для животных, так же как и лекарственных препаратов для человека, требуется государственная регистрация с соответствующим пакетом документов. Наиболее важные документы – результаты доклинических и клинических исследований. Однако если в отношении лекарственных препаратов для человека в Российской Федерации существует множество нормативных документов, которые описывают объем и схему проведения исследований, то в отношении кормовых добавок таковых документов и инструкций до настоящего времени не разработано. Поэтому требуется разработка регламентирующих документов, гармонизированных с международными требованиями. В данной работе рассмотрены основные международные регуляторные требования к проведению доклинических и клинических исследований кормовых добавок для животных.

Введение

В последние годы в Российской Федерации особое внимание уделяется развитию и совершенствованию сельского хозяйства. Сельское хозяйство – одна из ключевых и фундаментальных отраслей экономики любого государства, направленная на обеспечение населения продуктами питания и получение сырья для ряда областей промышленности. Одной из отраслей сельского хозяйства является животноводство, успех развития которого зависит от здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных. В связи с этим наблюдается непрерывное расширение ассортимента кормовых добавок для животных, которые не всегда отличаются хорошим качеством. 

В п. 4 проекта Административного регламента предоставления Россель-хознадзором государственной услуги по государственной регистрации кормовых добавок приведено следующее определение: «кормовые добавки – это продукты или их комбинации растительного, животного, микробиологического, минерального и синтетического происхождения, предназначенные для включения в состав кормов и рационов животных с целью обеспечения физиологической полноценности, стимуляции продуктивности животных, обеспечения сохранности компонентов, увеличения доступности питательных веществ, улучшения вкусовых и технологических свойств кормов» [1].

Использование некачественных кормовых добавок может негативно сказаться не только на самих сельскохозяйственных животных, но и на здоровье людей, потребляющих продукцию, получаемую от этих животных. 

Для поступления кормовой добавки в ветеринарную аптеку необходимо пройти государственную регистрацию, которую осуществляет Россельхознадзор на базе государственного учреждения «Всероссийский государственный центр контроля качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») в течение 6 мес со дня подачи регистрационных документов.  В соответствии с приказом Минсельхоза РФ №48 от 1 апреля 2005 г. «Об утверждении Правил государственной регистрации лекарственных средств для животных и кормовых добавок» [2] обязательной регистрации подлежат:

  • новые добавки; 
  • новые комбинации зарегистрированных ранее добавок; 
  • добавки, зарегистрированные ранее, но произведенные в других формах, или с новой дозировкой, или с другим составом вспомогательных веществ; 
  • воспроизведенные добавки.

Для государственной регистрации кормовых добавок в Россельхознадзор необходимо предоставлять результаты доклинических исследований. Проведение доклинических исследований является обязательной процедурой для регистрации кормовой добавки и занесения ее в Государственный реестр кормовых добавок.

Таким образом, производитель должен составить программу и провести доклинические исследования разрабатываемых кормовых добавок для животных с целью изучения их эффективности, безопасности применения для здоровья животных и подтверждения их качества. 

Как и в каком объеме проводить доклинические исследования кормовых добавок для животных? Для медицинских препаратов давно существуют руководства, стандартные правила и методические указания по организации и проведению доклинических исследований. В отношении ветеринарных препаратов до недавнего времени такие правила отсутствовали. Сегодня разработан Приказ Министерства сельского хозяйства Российской Федерации №101 от 06.03.2018 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения» [3]. В то же время в отношении кормовых добавок для животных правил по проведению исследований до настоящего времени в Российской Федерации не разработано. В связи с этим целью данной публикации стало рассмотрение международных регламентирующих документов. 

Международные регуляторные требования

При рассмотрении вопроса о кормовых добавках в Европейских странах руководствуются Регламентом комиссии (ЕС) №1831/2003 [4], который описывает порядок выдачи разрешений на размещение на рынке и применение кормовых добавок, правил контроля и маркировки кормовых добавок и премиксов в качестве основы для обеспечения высокого уровня защиты здоровья человека, здоровья и благополучия животных, окружающей среды и интересов потребителей, а также обеспечение эффективного функционирования внутреннего рынка. При проведении исследований токсичности и эффективности кормовых добавок руководствуются Регламентом №429/2008 [5], в котором содержатся правила по подготовке и представлению заявок, а также проведению оценки и выдаче разрешений в отношении кормовых добавок.

В соответствии с Регламентом (ЕС) №1831/2003 [4], если дело касается кормовых добавок, то исследования токсичности и эффективности не требуются в отношении:

  • мочевины;
  • аминокислот, их солей и аналогов;
  • микроэлементов и витаминов, провитаминов и веществ с установленным химическим составом, имеющих схожее действие и не накапливающихся в организме, уже разрешенных к применению в виде кормовых добавок;
  • кормовых добавок, произведенных путем ферментации, в случае если производственный организм рассматривается европейским агентством по безопасности пищевых продуктов в качестве организма с установленным безопасным статусом;
  • кормовых добавок, произведенных путем ферментации, действующее вещество которых отделяется от необработанного ферментированного продукта и подвергается высокой очистке.

Токсикологические исследования и исследования эффективности проводятся в целях совершенствования состава:

  • витаминов, провитаминов и веществ с установленным химическим составом, имеющих схожее действие и способных к накоплению, предполагаемая или подтвержденная способность к накоплению которых отличается от способности к накоплению витамина(-ов) с установленным составом;
  • производных мочевины;
  • аналогов аминокислот и соединений микроэлементов ранее не одобренных;
  • кормовых добавок, произведенных путем ферментации, не исключенных по вышеописанным правилам.

Исследования токсичности и эффективности кормовых добавок для животных проводят на лабораторных животных (проявляющих наибольшую чувствительность) и на целевых видах животных (табл. 1). Такие исследования осуществляют в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010 [6].

Далее рассмотрим необходимые исследования, проводимые на лабораторных и целевых животных.

Доклинические исследования кормовых добавок для животных, проводимые на лабораторных животных

Изучение острой токсичности

Исследования острой токсичности проводятся с целью установления принадлежности тестируемого объекта к определенному классу токсичности. Исследования острой токсичности осуществляются не менее чем на 2 видах млекопитающих. В случае необходимости один вид лабораторных животных может быть заменен целевым видом. Точное определение летальной дозы LD50 не является необходимостью, достаточным считается определение приблизительного значения летальной дозы [4, 5]. При проведении токсикологических исследований по изучению острой токсичности следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.420 «Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure», ГОСТ 32296-2013; Test No.423 «Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Class Method», ГОСТ 32644-2014) [7].

Изучение субхронической токсичности

Изучение субхронической токсичности тестируемых объектов проводят на мышах и крысах при пероральном/внутрижелудочном введении в течение не менее 90 сут. При необходимости исследование субхронической токсичности дополнительно проводится на животных, не относящихся к отряду грызунов. Для установления дозозависимых эффектов тестируемых объектов в исследование субхронической токсичности должно быть включено не менее 3 уровней доз, при этом минимальная доза не должна оказывать токсического действия на организм. Также должна быть сформирована контрольная группа, с помощью которой оцениваются результаты проведенного экспериментального исследования [4, 5]. При проведении исследований по изучению субхронической токсичности следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.408 «Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents», ГОСТ 32637-2014; Test No.409 «Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Non-Rodents», ГОСТ Р 56697-2015) [7].

Изучение хронической токсичности

Для установления хронической токсичности исследования тестируемых объектов выполняют на протяжении не менее 12 мес. Так же, как при изучении субхронической токсичности, изучение хронической токсичности происходит с исследованием как минимум 3 доз и с добавлением контрольной группы животных [4, 5]. При проведении исследований по изучению хронической токсичности следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.452 «Chronic Toxicity Studies», ГОСТ 32437-2013; Test No.453 «Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity Studies», ГОСТ 32647-2014) [7].

В документе Регламента комиссии (ЕС) № 429/2008 не предусмотрено более подробное рассмотрение вопроса о длительности проведения исследования хронической токсичности, а также возможности проведения исследования хронической токсичности без исследования субхронической токсичности. Такие длительные исследования очень дорогостоящие и трудозатратные. Заметим, что доклинические исследования лекарственных препаратов для человека регламентируются ГОСТ Р 56701-2015 [8], где рекомендуемая продолжительность исследования общетоксических свойств при многократном применении у животных соответствует продолжительности применения препарата в клинике (табл. 2). 

Изучение генотоксичности

Для изучения генотоксичности тестируемых объектов существует целый ряд испытаний:

  • тесты на индукцию генных мутаций у бактерий и в клетках млекопитающих;
  • индукция хромосомных аберраций в клетках млекопитающих;
  • испытания in vivo.

При проведении исследований по изучению генотоксичности следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.471 «Bacterial Reverse Mutation Test», ГОСТ 32376-2013, Test No.473 «In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test»; Test No.474 «Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test» ГОСТ 32635-2014; Test No.476 «Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test»; Test No.476 «In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and xprt
genes») [7].

В регламенте Комиссии (ЕС) №429/2008 нет четких рекомендаций по объему исследований генотоксичности кормовых добавок для животных. Если рассматривать исследования генотоксичности лекарственных препаратов для человека, то существуют рекомендации ГОСТ 57130-2016 [9], где предлагается проведение следующей батареи  тестов:

Вариант 1

  • Испытание генных мутаций в бактериях.
  • Цитогенетический тест хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro или микроядерная проба in vitro) либо анализ генных мутаций Tk в лимфоме мышей in vitro.
  • Тест генотоксичности in vivo, обычно тест на хромосомные поломки на гемопоэтических клетках мышей в виде либо микроядерной пробы либо анализа на хромосомные аберрации в метафазе.

Вариант 2

  • Испытание генных мутаций в бактериях.
  • Оценка генотоксичности in vivo двух разных тканей, обычно микроядерная проба с использованием гемопоэтических клеток грызунов и 2-й анализ in vivo. Как правило, используется анализ поломки нитей ДНК в печени. 

Изучение репродуктивной токсичности

Цель изучения репродуктивной токсичности – установление возможных неблагоприятных воздействий тестируемого объекта на мужскую и женскую репродуктивную систему, а также патологического воздействия на развитие потомства. При проведении исследований репродуктивной токсичности тестируемый объект вводят в течение определенного времени до ссадки самцов и самок. Затем наблюдают за эффективностью оплодотворения, течением беременности и родов у самок, далее контролируют рост и развитие потомства  [4, 5]. При проведении исследований по изучению репродуктивной токсичности следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.416 «Two-Generation Reproduction Toxicity Study», ГОСТ Р 56698-2015) [7].

Также изучение репродуктивной токсичности включает в себя исследование токсических эффектов на внутриутробное развитие потомства, целью которого является установление неблагоприятного воздействия тестируемого объекта на беременных самок и плод при введении объекта на протяжении всего периода беременности [5, 6]. В ходе исследований следует соблюдать Руководящие принципы ОЭСР (OECD Test No.414 «Prenatal Development Toxicity Study», ГОСТ 32380-2013) [7].

В документе Регламента комиссии (ЕС) № 429/2008 также нет достаточно подробного описания необходимости проведения исследования тестируемых объектов на беременных самках. По нашему мнению, данной необходимости нет, если нет опасений в неблагоприятном воздействии кормовой добавки на течение беременности и плод в клинике и, если кормовая добавка не предусмотрена к применению в период беременности.

Исследование фармакокинетики кормовых добавок и остаточных веществ

Решающим фактором при идентификации и количественном определении остаточных веществ в продуктах питания, полученных от животных (молоко, мясо, субпродукты и др.), в рацион которых была включена кормовая добавка, является установление метаболического пути добавки у целевых видов животных. При исследовании фармакокинетики представляются результаты исследований всасывания, распределения, метаболизма и экскреции (выведения) действующего вещества (и его метаболитов) кормовой добавки.

Исследования фармакокинетики действующего вещества кормовых добавок должны проводиться при введении животным в максимальной дозе, согласно инструкции по применению кормовой добавки. Исследования предусматривают приблизительную оценку скорости и степени всасывания, распределения в крови и выделения с экскретами (с мочой, желчью, экскрементами, молоком, яйцами), а также установление фармакокинетического профиля, порядка распределения действующего вещества в тканях и продуктах после введения повторных доз до достижения метаболического равновесия. 

Исследования должны включать в себя идентификацию остаточных веществ действующего вещества, оказывающих токсическое действие, в продуктах животноводства (печень, почки, мышцы, кожа, кожа + жир, молоко, яйца), а также установление периода выведения.

Фармакокинетические исследования проводятся на лабораторных видах животных. Однако в случае исследований на определенные метаболиты могут потребоваться дополнительные исследования, если такие метаболиты вырабатываются в организме целевых животных и не образуются в значительной степени в организме лабораторных животных.

Исследования кормовых добавок для животных, проводимые на целевых животных

Согласно Регламентам (ЕС) №1831/2003 [4] и №429/2008 [5], исследования проводятся также на целевых видах животных, которые включают в себя выявление переносимости и эффективности кормовых добавок. 

Исследование переносимости кормовых добавок

При установлении переносимости кормовой добавки проводят кратковременные исследования, длительность которых зависит от вида животных (табл. 3–7). Обычно исследуют максимально рекомендуемую дозу и дозы в 10 раз ее превышающие, при этом учитывают результаты доклинических исследований на лабораторных животных. В случае переносимости кормовых добавок целевыми видами животных в дозах, превышающих максимально рекомендуемые менее чем в 10 раз, при проведении исследования необходимо предусматривать определение предельно допустимого безопасного уровня добавки. 

Исследования на переносимость должны включать в себя не менее 3 групп животных (количество животных в группе должно обеспечивать возможность статистического анализа данных):

  • контрольная группа животных (группа, не получающая добавку);
  • экспериментальная группа, получающая максимально рекомендуемую дозу кормовой добавки;
  • экспериментальная группа, получающая кормовую добавку в дозе, многократно превышающую рекомендуемую дозу.

В период всего исследования за животными должно вестись клиническое наблюдение с целью выявления признаков интоксикации. В случае гибели животных необходимо проведение патоморфологического исследования трупов животных и гистологического исследования тканей и органов, где обнаружены изменения. 

В случае получения данных о переносимости кормовой добавки поросятами-отъемышами выполнение отдельного исследования с участием свиней на откорме не требуется.

Результаты исследований на переносимость, проведенных на цыплятах и индейках на откорме, могут использоваться для подтверждения переносимости цыплятами и индейками, которые выращиваются для разведения.

В случае если в инструкции по применению рекомендуемый срок применения кормовых добавок для целевых видов животных меньше установленного для проведения исследований на переносимость, кормовые добавки вводят в течение периода, рекомендованного в инструкции. При этом длительность наблюдения в любом случае должна составлять не менее 28 дней. 

Исследование эффективности кормовых добавок

Цель исследования – подтверждение эффективности кормовых добавок. При этом исследования должны отвечать не менее чем одной из характеристик, предусмотренных п. 3 ст. 5 Регламента (ЕС) №1831/2003 [6]:

  • оказывать благоприятное воздействие на характеристики корма; 
  • оказывать благоприятное воздействие на характеристики продуктов животного происхождения;
  • оказывать благоприятное воздействие на окраску декоративных рыб и птиц; 
  • удовлетворять пищевые потребности животных; 
  • оказывать благоприятное воздействие на экологические последствия животноводческой деятельности; 
  • оказывать благоприятное воздействие на продукцию животноводства, производительность и благополучие животных, в частности путем воздействия на желудочно-кишечную флору и усвояемость кормов; 
  • обладать кокцидиостатическим действием.

Согласно Регламенту (ЕС) №429/2008 [5], дизайн исследования эффективности кормовых добавок должен предусматривать экспериментальные группы животных, получающих кормовую добавку, а также группу позитивного контроля и (при возможности) негативного контроля. При этом структура исследования должна обеспечивать возможность подтверждения эффективности минимальной рекомендованной дозы кормовой добавки. Исследования на эффективность кормовых добавок могут быть краткосрочными и долгосрочными. Краткосрочные исследования могут проводиться для подтверждения биодоступности в отношении кормовых добавок с новой формой или источником питательного вещества, способных заменить одобренные и допущенные к применению эквивалентные добавки. Краткосрочные исследования возможны в случае подтверждения механизма действия кормовой добавки.

В других случаях рекомендуются долгосрочные исследования, длительность которых должна соответствовать периоду, указанному в табл. 8–11 для разных видов животных. В том случае, если в инструкции рекомендуемый срок применения кормовых добавок для целевых видов животных меньше срока, установленного для проведения исследований на переносимость, кормовые добавки так же, как в исследовании на переносимость, вводят в течение периода, рекомендованного в инструкции. При этом длительность наблюдения в любом случае должна составлять не менее 28 дней. 

Заключение

Таким образом, Регламенты (ЕС) №1831/2003 и №1831/2003 содержат описание доклинических и клинических исследований кормовых добавок для животных. Однако в некоторых разделах описание и рекомендации недостаточно четкие и требуют уточнения. Поэтому в Российской Федерации также необходима разработка регламентирующих документов, гармонизированных с международными требованиями, которые бы подробно описывали схему и объем проведения исследований. Исследования должны осуществляться в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 г., этическими принципами и Принципами Надлежащей лабораторной практики (Good laboratory practice, GLP). Разработка требований к проведению исследований позволит выпускать в ветеринарную аптеку потенциально безопасные кормовые добавки для животных. А это позволит добиться хороших показателей продуктивности животных, будет способствовать росту и гармоничному развитию потомства.

Список литературы

  1. Проект Административного регламента предоставления Россельхознадзором государственной услуги по государственной регистрации кормовых добавок Приказ Минсельхоза РФ №48 от 1 апреля 2005 г. «Об утверждении Правил государственной регистрации лекарственных средств для животных и кормовых добавок».
  2. Приказ Минсельхоза РФ №48 от 01.04.2005 «Об утверждении Правил государственной регистрации лекарственных средств для животных и кормовых добавок».
  3. Приказ Минсельхоза РФ №101 от 06.03.2018 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения».
  4. Регламент (ЕС) №1831/2003 Европейского Парламента и Совета от 22 сентября 2003 г. о добавках, применяемых в питании животных.
  5. Регламент ЕС 429/2009 от 25 апреля 2008 г. о подробных правилах применения Регламента (ЕС) № 1831/2003 Европейского Парламента и Совета по подготовке и представлению заявок, а также проведения оценки и выдачи разрешений по кормовым добавкам.
  6. Директива 2010/63/EU Европейского Парламента и Советом Европейского Союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях (Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22Sep2010 on the protection of animals used for scientific purposes).
  7. OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. Электронный ресурс. http://dx.doi.org/10.1787/2077785x.
  8. Лекарственные средства для медицинского применения. Руководство по планированию доклинических исследований безопасности с целью последующего проведения клинических исследований и регистрации лекарственных средств. ГОСТ Р 56701-2015. Введ. 01-07-2016. М.: Стандартинформ, 2016.
  9. Лекарственные средства для медицинского применения. Исследование генотоксичности и интерпретация полученных данных: ГОСТ Р 57130-2016. Введ. 01-05-2016. М.: Стандартинформ, 2016.

Вас может заинтересовать