Работа выполнена в соответствии с государственным заданием ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (тема 0521‑2019‑0002). Эксперименты проведены с соблюдением норм работы с животными и одобрены Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (протокол № 5 от 19.03.20).
Котельникова С.О., Садовский М.С., Крайнева В.А., Вальдман Е.А. Моделирование депрессивноподобного состояния выученной беспомощности у крыс разных стоков. Лабораторные животные для научных исследований. 2022; 2. https://doi.org/10.29296/2618723X-2022-02-03
Модель «выученной беспомощности» (ВБ) у крыс используется для оценки депрессивноподобного состояния и эффектов антидепрессантов. Проведено сравнение показателей состояния ВБ у крыс-самцов белых беспородных, Wistar и Sprague Dawley на 3‑й и 14‑й день после неизбегаемого аверсивного воздействия электрическим током. В группе беспородных крыс на 3‑й день было 34% животных, достигших критерия ВБ, 25 и более отказов от избегания из 30 возможных, на 14‑й день — 22%. В группе Sprague Dawley на 3‑й день отмечено 25%, на 14‑й — 28% крыс с ВБ. В группе крыс Wistar состояние ВБ не сформировалось ни у одного животного. У крыс с ВБ как беспородных, так и Sprague Dawley, на 3‑й день зарегистрированы достоверно более высокий средний латентный период до первого перехода в безопасный отсек, большее среднее количество отказов от избегания и меньшее количество избавлений при подаче тока по сравнению с контрольными группами. На 14‑й день все достоверные различия параметров поведения сохранялись только в группе Sprague Dawley. В группе беспородных крыс достоверность различий латентного периода до первого перехода в безопасный отсек у крыс с ВБ и контрольных не сохранилась. Поведенческие параметры контрольных групп крыс беспородных и Sprague Dawley достоверно не отличались. В нашем исследовании показана несколько более высокая предрасположенность к формированию и сохранению депрессивноподобного состояния ВБ у крыс популяции Sprague Dawley по сравнению с беспородными. Однако процент животных с ВБ во всех группах был невысоким, что ограничивает применение модели для изучения эффектов антидепрессантов. Сделано предположение, что разделение крыс по типу реакции на стресс и выработка депрессивноподобного состояния ВБ у низкоактивных животных могут повысить эффективность методики.
Мультифакторная природа депрессии исключает на сегодняшний день создание единой трансляционной экспериментальной модели, позволяющей изучать патогенез заболевания, эффективность существующих и разрабатываемых антидепрессантов. Поэтому большинством исследователей [1–4] признается необходимость использования для фармакологического изучения новых антидепрессантов нескольких моделей депрессии. Одной из таких моделей, включаемых в число возможных тестов для оценки депрессивноподобного состояния, является «выученная беспомощность» (ВБ) [5].
ВБ относится к моделям, основанным на воздействии стресса, при этом предъявление неконтролируемого аверсивного стимула (электрический ток) приводит к отказу от избегания в случае наличия такой возможности [6, 7].
Одним из серьезных ограничений модели является то, что далеко не у всех животных в тестовой сессии регистрируется состояние ВБ. Поведение крыс разных линий, популяций и даже в разных партиях внутри одного стока может значительно отличаться [8–10]. Вариативность в формировании у животных состояния ВБ, а также в длительности его сохранения создает значительные проблемы при оценке эффективности новых и существующих антидепрессантов.
Хорошо известно, что реакции на стресс определяются как генетическими, так и средовыми факторами [11]. Одним из подходов к повышению воспроизводимости методики является использование линий крыс с генетической предрасположенностью к ВБ [12]. Однако это не всегда возможно. К тому же поведение аутбредных животных с более выраженной генетической вариабельностью в большей степени отражает реакцию в человеческой популяции. При проведении экспериментов на доступных аутбредных крысах из отечественных питомников следует выбирать наиболее предрасположенных к формированию депрессивноподобного состояния ВБ [13].
Цель настоящей работы — анализ формирования состояния ВБ у крыс-самцов белых беспородных, Wistar и Sprague Dawley.
Эксперименты проводили на животных, полученных из ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, самцы белых беспородных крыс поступали из филиала «Столбовая», крысы Wistar — из филиала «Андреевка», также использовали самцов крыс Sprague Dawley из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН, масса 180–200 г (возраст 2 мес) на начало эксперимента. После поступления из питомников животных содержали в групповых пластиковых клетках по 5 особей в каждой на мягком подстиле из древесных опилок в условиях вивария НИИ фармакологии имени В.В. Закусова при естественной смене светового режима со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде. Адаптация к условиям содержания до включения в эксперимент составляла 14 дней. Эксперименты параллельно на разных стоках крыс выполняли в апреле–июне в часовом интервале 9:00–16:00. В экспериментальную комнату животных приносили в домашних клетках и возвращали в них же после извлечения из установки.
Соблюдались требования Приказа Минздрава РФ от 01.04.16 №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Для моделирования депрессивноподобного состояния и поведения у крыс был применен модифицированный метод ВБ [6]. Формирование депрессивноподобного состояния проводили, используя системы для изучения ВБ фирмы Ugo Basile (Италия) c выработкой ВБ и тест двустороннего условного избегания. Установка представляет собой комплекс для исследования поведения крыс, состоящий из 4 двухкамерных боксов, снабженных перегородками, электродным полом и подключенных к компьютеру с программным обеспечением, позволяющим задавать разные параметры электрических импульсов. Для выработки ВБ в каждый бокс помещали по одной крысе и при закрытой перегородке между камерами (отсеками) через электродный пол подвергали воздействию 30 неизбегаемых электрических импульсов (ударов током) силой 0,7 мА, длительностью 30 с через произвольные интервалы со средним значением 30 с [6]. Крыс на группы разделяли случайным образом. Выработку ВБ проводили в течение 2 дней. В каждую группу было включено по 32 крысы. На 3‑й день осуществляли тестирование состояния ВБ. Для этого животных помещали в те же боксы, но открывали отверстие в перегородке, делящей бокс на «опасный» отсек (с током) и «безопасный», куда животное имело возможность легко перебежать и избавиться от удара током. Крысу через электродный пол подвергали 30 избегаемым ударам током силой 0,7 мА, длительностью 6 с через 33‑секундные интервалы. Переключатель тока срабатывал от тяжести животного, следующий электрический разряд подавался в тот отсек, куда перебежала крыса. При этом за 3 с до подачи тока включался звуковой сигнал, который продолжался в течение всего времени действия тока. Критерием состояния ВБ считали не менее 25 отказов от избегания из 30 ударов током [6]. На 14‑й день проводили повторное тестирование сохранения состояния ВБ у крыс по описанной выше схеме.
Животных контрольных групп в дни выработки ВБ помещали в установку, но ударам тока не подвергали. В контрольных группах 3‑го и 14‑го дня тестирования использовали разных животных.
Обработку результатов проводили с помощью программы статистического анализа StatPlus Pro 6.2. Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро–Уилка. Статистическую значимость различий между независимыми выборками оценивали с использованием непараметрического метода (U-критерий Манна–Уитни) при распределении, отличном от нормального. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Оценка состояния ВБ на 3‑й день после выработки показала, что в группе беспородных крыс у 34%, а в группе крыс Sprague Dawley у 25% животных сформировалось состояние ВБ, отвечающее критерию 25 и более отказов от избегания при 30 ударах током. В группе крыс Wistar ни у одного животного состояние ВБ не развилось (табл. 1).
Продолжительность депрессивноподобного состояния имеет большое значение особенно для изучения эффективности антидепрессантов при длительном введении. Оценка сохранения состояния ВБ на 14‑й день после выработки показала, что в группе беспородных крыс количество животных с ВБ сократилось, а в группе Sprague Dawley у всех крыс состояние ВБ сохранилось и развилось еще у одного животного. В группе крыс Wistar животных с ВБ не было и на 14‑й день (см. табл. 1).
В табл. 2 приведены поведенческие параметры беспородных крыс и Sprague Dawley, достигших критерия ВБ на 3‑й и 14‑й день, и контрольных животных. У беспородных крыс с ВБ на 3‑й день зарегистрированы более высокий латентный период до первого перехода в безопасный отсек, большее количество отказов от избегания и меньшее количество избавлений при подаче тока по сравнению с контрольной группой. Показатели на 14‑й день были схожими. Однако латентное время до первого перехода в безопасный отсек у крыс с ВБ значимо не отличалось от группы контрольных животных.
У крыс Sprague Dawley с ВБ также оказались более высокий латентный период до перехода в безопасный отсек, большее количество отказов от избегания и меньшее количество избавлений при подаче тока по сравнению с контрольной группой. На 14‑й день все различия с контролем параметров поведения крыс с ВБ сохранялись. Поведенческие реакции беспородных крыс и Sprague Dawley, использованных в качестве контроля на 3‑й и 14‑й день, не отличались как внутри каждого стока, так и между животными.
Результаты, полученные в исследовании, указывают на то, что состояние ВБ может быть сформировано как у беспородных, так и крыс Sprague Dawley. Однако при этом в группе беспородных крыс к 14‑му дню снизилось количество животных с ВБ, а в группе Sprague Dawley — нет. Различия с контролем в группе Sprague Dawley сохранялись на 14‑й день по всем оцениваемым показателям, характеризующим состояние ВБ, а беспородных — не по всем. У крыс Wistar состояние ВБ не сформировалось.
Крысы Sprague Dawley и Wistar широко используются для моделирования различных патологий, в том числе депрессивноподобного состояния ВБ [10, 14, 15]. Результаты сравнительных исследований предрасположенности крыс Sprague Dawley и Wistar к формированию ВБ не опубликованы. Показаны различия двух стоков по метаболическому профилю [16]. Получены данные о неодинаковой чувствительности крыс Wistar и Sprague Dawley к повреждающим агентам в процессе развития и определены разные паттерны поведения в ряде тестов, что позволило сделать вывод о необходимости выбора стока, наиболее подходящего для изучения отдельных показателей поведения [17]. В сравнительном исследовании поведения и гормонального фона крыс разных стоков показана большая предрасположенность к развитию депрессивноподобного поведения в тесте вынужденного плавания крыс Wistar, но при этом более высокий базальный уровень кортикостерона установлен у крыс Sprague Dawley [18]. На модели нейропатической боли установлены не только различия порогов болевой чувствительности крыс разных линий, но и популяций крыс Sprague Dawley, полученных из разных питомников [19].
На моделях депрессии установлены индивидуальные различия в реакции на воздействие стресса, обусловленные генетически детерминированными типологическими характеристиками животного. В частности, в одних и тех же условиях у животных с противоположными стратегиями поведения формируются принципиально различные постстрессовые депрессивноподобные состояния [11, 20, 21]. Кроме генетических факторов, индивидуальные различия поведения определяются также влиянием множества факторов окружающей среды во все периоды жизни экспериментальных животных, что подтверждает необходимость характеристики локальных стоков и популяций крыс, а также сложность сравнения результатов, полученных в разных лабораториях [22, 23].
По результатам нашего исследования можно рекомендовать крыс Sprague Dawley для изучения депрессивноподобного поведения ВБ. Однако следует отметить, что выявленное количество животных с ВБ в группе крыс Sprague Dawley (25–28%) значительно ниже, чем описывается в ряде исследований, проводимых в зарубежных лабораториях (60–70%) [6, 24, 25].
В группе беспородных животных разброс индивидуальных различий выражен максимально. В ранее проведенных исследованиях мы разделяли беспородных крыс по типу эмоционально-стрессовой реакции и активности в тесте «ярко освещенное открытое поле» и показали, что низкоактивные в условиях стресса крысы более подвержены формированию депрессивноподобного состояния [7].
С учетом результатов, полученных в настоящем исследовании, в дальнейшем целесообразно провести разделение крыс Sprague Dawley по типу эмоционально-стрессовой реакции и активности в тесте «ярко освещенное открытое поле». Выработка депрессивноподобного состояния у низкоактивных животных, возможно, позволит повысить количество животных с ВБ в группе.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
С.О. Котельникова, М.С. Садовский — разработка дизайна исследования, сбор, анализ и интерпретация экспериментальных данных, статистическая обработка данных, подготовка материала к публикации.
В.А. Крайнева — анализ и интерпретация экспериментальных данных, подготовка текста к публикации.
Е.А. Вальдман — научное руководство работой в целом, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.