Бочарова О.А. , Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Аксенов А.А., Кучеряну В.Г. Снижение роста спонтанных опухолей печени у мышей линии СВА при профилактическом воздействии cухим экстрактом фитоадаптогена. Лабораторные животные для научных исследований. 2022; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2022-01-02
Цель исследования – оценить возможность снижения частоты возникновения, количества и объема спонтанных опухолей печени у самцов мышей линии СВА на примере профилактического воздействия сухим экстрактом комплексного фитоадаптогена (КФА). Животные контрольной группы получали воду на всем протяжении эксперимента, опытной группы – 0,3% водный раствор сухого экстракта КФА в профилактическом режиме в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза, включая период (5–15-й день жизни), соответствующий завершению дифференцировки ткани печени. КФА – сублимированная форма фармацевтической композиции с биологически активными компонентами экстрактов 40 растений, в том числе адаптогенов Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea, Aralia elata, Schisandra chinensis, Oplopanax elatus, включая тритерпеновые сапонины, полифенолы, эфирные масла. У животных в возрасте 8 и 22 мес оценивали частоту возникновения, количество опухолей на 1 животное, объем 1 опухоли и общий объем опухолей на 1 животное. Проводили морфологическое исследование ткани печени контрольных и подопытных животных. Статистический анализ данных проводили в программе Statistica 10.0. Результаты исследования показали, что у контрольных 8-месячных мышей частота возникновения опухолей составила 10%, у подопытных животных в этот возрастной период опухоли не были выявлены. Применение сухого экстракта КФА в профилактическом режиме способствовало снижению у животных в возрасте 22 мес частоты возникновения опухолей на 33%. При этом отмечено уменьшение количества опухолей и общего объема опухолей на 1 животное.
В научной литературе обсуждается вопрос о ключевой роли нарушений межклеточной адгезии в тканевых системах и реакциях иммунитета в развитии злокачественных новообразований. Недостаточность экспрессии гистоспецифических молекул адгезии, возникающая в результате в том числе генетической мутации, повреждает важный механизм противоопухолевой защиты ткани, нарушая процессы пролиферации и дифференцировки. Как следствие дефицит гистонеспецифических молекул гомотипической адгезии ICAM (intercellular adhesion molecules) усугубляет ослабление контактных взаимодействий клеток опухоли и может приводить к снижению экспрессии соответствующих лигандов из семейства β2-лейкоцитарных интегринов (например, LFA-1, Mac-1), обеспечивающих контакт иммунных эффекторов (цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров) и опухолевых клеток. Это, в свою очередь, обусловливает снижение реакций иммунитета против опухоли [1–5]. Изучение роли цитокинов в контроле злокачественного канцерогенеза, в частности, интерлейкинов (ИЛ)-6 и -10, регулирующих межклеточные взаимодействия, также является важным направлением современных исследований [6, 7].
Инбредная линия мышей СВА – экспериментальная модель генетической предрасположенности к опухолям печени с высоким риском их возникновения. У мышей этой линии опухоли начинают развиваться с 6-месячного возраста. У самцов гепатокарциномы встречаются в 7 раз чаще, чем у самок, в 18-месячном возрасте у них выявляют опухоли в 100% случаев. [8]. Наличие дистальной хромосомы 1, несущей 1 ген и более, создает условие для повышения чувствительности мышей СВА, особенно самцов, к спонтанному и химически индуцированному канцерогенезу [9, 10]. Вместе с тем эта модель максимально приближена к ситуации в клинической онкологии, когда опухоли у больных возникают в том числе как результат наследственной предрасположенности.
В проведенном ранее исследовании у самцов мышей СВА выявлено снижение экспрессии β2-лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови при увеличении концентрации ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови. Кратковременное профилактическое воздействие сухим экстрактом комплексного фитоадаптогена (КФА) в течение 1-го месяца жизни животных приводило к усилению экспрессии LFA-1 и Mac-1, а также снижению уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 [11, 12]. Вероятно, коррекция адгезионных взаимодействий с участием сигнальной реактивности цитокинов может иметь значение для снижения частоты возникновения опухолей.
Цель исследования – оценка возможности снижения частоты возникновения, количества и объема спонтанных опухолей печени у самцов мышей линии СВА на примере профилактического воздействия сухим экстрактом КФА.
Мыши СВА получены из питомника лабораторных животных «Пущино». Эта линия поддерживается в отделе разведения лабораторных животных ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» (Россия). В исследование было включено 58 самцов мышей СВА, выведенных в отделе разведения лабораторных животных ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
Мышей содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, температура воздуха 22–26°С, относительная влажность воздуха 40–75%) на стандартном рационе питания. Животных выводили из эксперимента в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) и надлежащей лабораторной практики.
Для исследования мыши СВА были разделены случайным образом на 2 группы – контрольную и опытную. Животные контрольной группы (n=33) получали воду на всем протяжении эксперимента, опытной группы (n=25) – 0,3% водный раствор сухого экстракта КФА в профилактическом режиме. Профилактический режим: КФА применяли в течение 1-го месяца жизни мышей, включая период (5–15-й день постэмбрионального онтогенеза), соответствующий завершению дифференцировки ткани печени [13–15]. Самки получали препарат, начиная с 16–17-го дня беременности, до отъема детенышей в возрасте 3 нед. Затем в течение 1 нед детеныши-самцы пили воду с препаратом самостоятельно. После этого до конца эксперимента подопытные животные получали воду.
Коррекцию иммуноадгезионных взаимодействий проводили на примере КФА – сублимированной формы фармацевтической композиции с компонентами экстрактов 40 растений, включая адаптогены Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea, Aralia elata, Schisandra chinensis, Oplopanax elatus. КФА обладает адгезиогенными, иммуномодулирующими, в том числе интерфероногенными, антиоксидантными, антистрессорными, гормономодулирующими, антимутагенными свойствами, определяющими его геропротекторную направленность [16–22].
Эвтаназию животных осуществляли в возрасте 8 и 22 мес методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Оценивали частоту возникновения опухолей (количество мышей с опухолями), число опухолей на 1 животное, объем (мм3) 1 опухоли на мышь, а также общий объем (мм3) опухолей на 1 мышь. Опухоль отделяли скальпелем от окружающей нормальной ткани, которая отличалась от опухолевой по цвету. Печень животных подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином и эозином. Для оценки объема (мм3) 1 опухоли применяли стандартную формулу:
V=А • В • С • π/6,
где А, В, С – максимальные размеры опухоли по длине, ширине и высоте, π – 3,14 (или ее упрощенный вариант V=А • В • С • 0,52).
Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 10.0. Для определения нормального характера распределения данных использовали тест Колмогорова–Смирнова; межгрупповые различия оценивали по однофакторному дисперсионному анализу One-Way ANOVA c пост-хок-тестом Ньюмена–Кейлса (Newman–Keuls). Данные представлены как среднее значение±стандартная ошибка среднего (M±SEM).
В табл. 1 представлены данные о количестве животных с опухолями (частота возникновения опухолей), числе опухолей на 1 животное, об объеме 1 опухоли, а также общем объеме опухолей на 1 животное у самцов мышей СВА в возрасте 8 мес при воздействии сухим экстрактом КФА.
У контрольных животных в возрасте 8 мес частота возникновения опухолей составила 15%, число опухолей на 1 животное определено как 0,2±0,1, объем 1 опухоли составил 22,6±11,3 мм3, общий объем опухолей на 1 животное – 4,5±3,0 мм3. В других органах опухолей не выявлено. При макроскопической ревизии печени и других органов (с помощью серийных срезов) у подопытных мышей признаков злокачественного опухолевого перерождения не выявлено.
При гистологической верификации опухоли печени контрольных животных в возрасте 8 мес определены как умеренно дифференцированные трабекулярные гепатокарциномы (рис. 1).
В табл. 2 представлены результаты определения частоты возникновения опухолей и размеров гепатокарцином у мышей СВА в возрасте 22 мес при воздействии сухим экстрактом КФА. У всех животных контрольной группы возникли опухоли, т.е. частота возникновения опухолей составила 100%, число опухолей на 1 животное – 2,8±0,5 (показатель множественности), объем 1 опухоли – 393,6±102,3 мм3, общий объем опухолей на 1 животное – 1120,2±350,5 мм3.
Частота возникновения опухолей у животных опытной группы статистически значимо была ниже на 33% по сравнению с контролем. Число опухолей на одно животное и общий объем опухолей на одно животное также ниже контрольных значений (1,5±0,4 и 378,9±126,8 мм3, соответственно). Объем 1 опухоли (258,4±71,3 мм3) статистически не отличался от величины, полученной у контрольных животных.
В результате гистологической верификации опухоли печени контрольных и подопытных животных в позднем онтогенезе определены как низкодифференцированные трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы (рис. 2). Морфологических различий в гепатокарциномах контрольных и подопытных мышей не наблюдали. В опытных образцах была выявлена инфильтрация гепатокарцином лейкоцитами (результаты исследования опухоль-инфильтрирующих лейкоцитов будут являться предметом дальнейших публикаций).
Таким образом, можно полагать, что кратковременное профилактическое воздействие сухим экстрактом КФА на мышей СВА, включая критический этап завершения дифференцировки печени [13–15], оказывает длительный по времени эффект нормализации гомотипической адгезии клеток ткани-мишени, наследственное ослабление которой обеспечивает предрасположенность мышей, особенно самцов, данной линии к спонтанному гепатоканцерогенезу. Усиление тканевой интеграции может способствовать коррекции экспрессии β2-лейкоцитарных интегринов (LFA-1 и Mac-1) на лимфоцитах и уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови, показанной в предыдущих исследованиях [11, 12]. Результатом этого явилось отсутствие опухолей у животных в возрасте 8 мес и снижение в позднем онтогенезе частоты спонтанно возникающих опухолей на 33%, а также числа опухолей и общего объема опухолей на 1 животное.
Опираясь на предыдущие исследования отдельных фитоадаптогенов на примере родиолы розовой (Rhodiola rosea), полагаем, что кратковременное воздействие КФА (как адаптогенного агента) в другие периоды онтогенеза вне критического этапа развития ткани печени не приведет к усилению взаимной адгезивности клеток данной ткани. Так, применение экстракта родиолы розовой у мышей СВА на протяжении 2-го месяца жизни (завершение дифференцировки тимуса), а также 6-го месяца (возникновение первых опухолей) приводило лишь к временной нормализации межклеточных контактов в ткани печени и параметров клеточного иммунитета как механизмов местного и общего звена противоопухолевого надзора. При этом высокий уровень частоты возникновения опухолей сохранился таким же, как и наблюдаемый у интактных мышей СВА, происходило лишь торможение роста опухолей без изменения частоты их возникновения [23].
Следует отметить, что эффективность профилактического воздействия сухим экстрактом КФА на частоту возникновения, число и объем гепатокарцином сравнима с таковой, выявленной в ранее проведенных исследованиях для жидкой формы КФА [24, 25].
Эффекты КФА в отношении снижения роста опухолей у мышей СВА могут быть связаны с основными биологически активными соединениями, входящими в его состав. Химико-аналитический качественный и количественный анализ КФА выявил в составе препарата тритерпеновые сапонины (гинзенозиды, аралозиды, элеутерозиды), полифенолы и др. [26–29]. В качестве узкобороздочных лигандов эти соединения оказывают не только антиканцерогенное действие, но прямо или опосредованно влияют на репарацию ДНК. Поэтому их считают перспективными в составе препаратов для профилактической онкологии [30–33].
Частота возникновения опухолей у самцов мышей СВА в возрасте 8 и 22 мес составила 15 и 100% соответственно. По морфологическому строению опухоли представляют собой умеренно дифференцированные трабекулярные (в возрасте мышей 8 мес) и низкодифференцированные трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы (у мышей 22 мес).
Профилактическое воздействие сухим экстрактом КФА привело к снижению частоты возникновения опухолей, числа и общего объема опухолей на 1 животное, что может быть опосредовано нормализацией иммуноадгезионных взаимодействий эффекторов иммунитета и клеток-мишеней.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.