Макарова М.Н., Макаров В.Г. Диет-индуцированные модели метаболических нарушений. Сообщение 4: экспериментальная неалкогольная жировая болезнь печени. Лабораторные животные для научных исследований. 2018; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-04-04
Резюме. Неалкогольная жировая болезнь печени относится к наиболее часто диагностируемым хроническим заболеваниям печени, в этиологии которых особую роль играет увеличение доли сахарозы, фруктозы и жира в структуре рациона питания населения. Неалкогольная жировая болезнь печени опасна как осложнениями со стороны печени (цирроз, рак печени и др.), так и влиянием на развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому именно диет-индуцированные модели целесообразно использовать в экспериментах на животных с целью оценки эффективности методов и средств профилактики и лечения неалкогольной жировой болезни печени. Для моделирования неалкогольной жировой болезни печени наиболее часто используются грызуны (мыши, крысы, реже – морские свинки и хомяки), предпочтительнее самцы, у которых быстрее, чем у самок, развиваются нарушения в печени. Из крупных животных (например, мини-свиней) рекомендуется использовать линии с быстрым развитием неалкогольной жировой болезни печени, в частности, миниатюрных свиней Lee-Sung. Наиболее эффективными по скорости развития и интенсивности патологических изменений в печени являются модели с использованием метионин- и холин-дефицитного рациона, однако наиболее адекватными патогенезу развития неалкогольной жировой болезни печени человека признаны модели с высоким содержанием жира и углеводов типа западного и/или фаст-фудного рационов питания человека. Поэтому перспективным представляется использование рационов с высоким содержанием жира и углеводов на фоне дефицита метионина и холина. Для оценки развития неалкогольной жировой болезни печени и эффективности исследуемых лечебно-профилактических мероприятий у животных анализируют показатели состояния печени: АЛТ, АСТ, триглицериды и масса печени, гистология и гистохимия печеночной ткани и др.). Кроме того, широко применяют маркеры воспаления (ИЛ6, ФНОα, СРБ), исследование содержания альбумина, триглицеридов и холестерина сыворотки крови, глюкозы и инсулина натощак, инсулинорезистентности и др.
Рост распространенности неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) тесно связан с увеличением заболеваемости ожирением и сахарным диабетом 2 типа [1]. Причем в индустриально развитых странах НАЖБП относится к наиболее часто диагностируемым хроническим заболеваниям печени [2, 3]. Особую роль при этом, как отмечают исследователи во всем мире, играет увеличение доли рафинированных углеводов (сахарозы и фруктозы) и жира в структуре рациона питания населения (питание западного типа и/или фаст-фуд) [4]. Следует отметить, что НАЖБП опасна не только своими осложнениями со стороны печени (цирроз, рак печени и др.), но и тем, что она способствует росту сердечно-сосудистой патологии [1]. Это обусловливает актуальность поиска средств лечения данной патологии, необходимость создания и использования адекватных экспериментальных моделей на животных и критериев их оценки.
НАЖБП – гетерогенная группа патологических изменений печени, характеризующихся воспалительной инфильтрацией на фоне жировой дистрофии гепатоцитов у лиц, не употребляющих алкоголь в гепатотоксических дозах [1, 5]. НАЖБП является одним из проявлений метаболического синдрома и тесно связана с такими нарушениями, как ожирение, инсулинорезистентность (ИР), гипергликемия, сахарный диабет (СД) 2-го типа, дислипидемия, изменение профиля адипокинов и др. [5, 6]. Распространенность НАЖБП во всем мире продолжает расти параллельно с ростом эпидемии ожирения и ИР. В настоящее время НАЖБП – наиболее частая причина хронических заболеваний печени [2, 7], прогрессирующих от простого стеатоза печени до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), а в более тяжелых случаях – до неалкогольного стеатофиброза (НАСФ) и цирроза, а также рака печени (гепатоцеллюлярной карциномы).
НАЖБП относят к группе болезней печени, обусловленных нарушениями питания и обмена веществ. При этом содержание жира в печени составляет более 5% от ее массы [2, 8]. В основе патогенеза НАЖБП лежит ИР, приводящая к ожирению. При этом увеличивается поступление в печень свободных жирных кислот (СЖК) и формируется стеатоз печени [5], который, при отсутствии воспаления и повреждения клеток печени, не переходит в следующие стадии поражения печени [1], имея доброкачественное течение. Если же под влиянием СЖК развивается оксидативный стресс, сопровождающийся активацией провоспалительных цитокинов (в первую очередь, фактора некроза опухоли – ФНОα) и повреждением гепатоцитов [1, 5], то развивается НАСГ, а при отсутствии лечения переходит в последующие стадии НАЖБП – НАСФ, цирроз и др. В этиологии НАЖБП большое значение имеет избыточное питание и недостаточная физическая активность, меньшее – прием некоторых препаратов (нестероидных противовоспалительных, гормональных и др.), дисбактериоз тонкого кишечника и пр. [1, 5].
Наиболее часто для моделирования НАЖБП используются грызуны, в особенности мыши [9–13] и крысы [13, 14], реже – морские свинки и хомяки [15, 16]. Это связано с выраженной генетической предрасположенностью мышей линии C57BL/6 и крыс линий Wistar и Sprague Dawley к НАЖБП. Причем самцы грызунов, в частности мышей, более чувствительны к нарушениям питания и у них легче и быстрее развивается НАЖБП (в точности, как и у мужчин, в сравнении с женщинами) [1]. Среди крупных животных исследователи отдают предпочтение мини-свиньям [4, 17], кролики используются реже [18].
Идеальная модель животного для НАЖБП должна отражать все аспекты сложного этиопатогенеза НАЖБП человека и типичную гистологическую картину ткани печени на различных этапах заболевания [14]. Однако разные модели способны воспроизводить только отдельные параметры и этапы развития НАЖБП человека. Как указывают J.T. Haas et al. [1], О. Kucera, Z. Cervinkova [14], высокожировая модель, широко используемая для индукции ожирения и сахарного диабета, редко применяется для моделирования НАЖБП в связи с тем, что на ней медленно развиваются такие важные характеристики, как воспаление клеток печени, фиброз и многие другие. Так, например, J.K. Lau et al. [6] приводят данные о том, что только высокожировой рацион вообще не вызывает в печени изменений, свойственных НАБЖП, у мышей линии C57BL/6. В то же время A. Nakamura, Y. Terauchi [8] наблюдали у мышей и НАБЖП, и даже опухоли печени при очень длительном (60 нед) введении высокожирового рациона питания.
Вместе с тем, если наиболее часто используемый для моделирования НАЖБП у грызунов рацион с дефицитом метионина и холина вызывает стеатоз, воспаление и фиброз клеток печени на фоне существенной потери веса, то высокожировой рацион с высоким содержанием сахарозы и холестерином способствует подобным изменениям, но уже на фоне ожирения [1, 6], что ближе к этиологии и патогенезу НАЖБП человека. Поэтому рекомендуется для индукции НАЖБП применять высокожировые рационы с сахарозой и холестерином и исключением из них метионина и холина [10]. Следует отметить, что при рационе с выраженным дефицитом метионина и холина уже на 2-й неделе развивается стеатоз печени, наблюдается рост аланин- и аспартаттрансаминаз, к которым на 3-й неделе присоединяется воспаление и некроз клеток с последующим развитием фиброза печени [1, 4, 13].
Для моделирования НАЖБП у мышей наиболее часто используют рационы питания с выраженным дефицитом метионина и холина, в том числе на фоне высокого содержания жиров и углеводов (в основном фруктозы), а также рационы питания типа западного и фаст-фуда [9–12]. Причем как показали исследователи из клиники Майо (Рочестер, Миннесота) [11, 12], наиболее выраженные изменения, характерные для НАЖБП, развиваются на фоне рациона питания с высоким содержанием и жира (40% от энергоценности), и углеводов (47%), в то время как только высокожировой рацион (60% энергоценности за счет жира и 25–29% – углеводов) не вызывал развития НАЖБП. В частности, если на фаст-фудном рационе (ФФР) изменения, характерные для воспаления и цирроза печени, к концу 25-й недели были довольно выраженными, то на высокожировом – они практически отсутствовали [11].
При моделировании НАЖБП на мышах следует также учитывать линии используемых животных. Так, например, N. Pejnovic et al. [18] показали, что наиболее часто применяемые линии мышей C57BL/6 и BALB/c по-разному реагируют на одинаковые гиперкалорийные рационы питания: мыши C57BL/6 больше склонны к развитию висцерального ожирения, гликемии, воспалению и фиброзу печени, в то время как у мышей BALB/c развивается преимущественно стеатоз печени. Длительное кормление метионин-дефицитным рационом приводило к более выраженному повреждению печени у мышей DBA/2J, чем у мышей линии C57BL/6, при этом у последних не развивался рак печени, в отличие от мышей линии DBA/2J [6].
Как указывают O. Kucera и Z. Cervinkova [14], на основании анализа большого числа исследований, для индукции НАЖБП у крыс, так же как и у мышей, используются различные пищевые модели: высокожировая, атерогенная, высокофруктозная и высокосахарозная, высокофруктозная и высокожировая, метионин и холин-дефицитная, диета кафетерия, холин-дефицитная. При этом наибольшее число патогенетических нарушений, свойственных НАЖБП, отмечено на атерогенных рационах питания, на рационах с дефицитом метионина и холина, рационах с высоким содержанием фруктозы и жира и некоторых других [14]. Менее выраженный эффект был на рационах с высоким содержанием только фруктозы и/или сахарозы, а также с дефицитом только холина. Из атерогенных рационов питания наиболее эффективными в развитии стеатогепатита были рационы с высоким содержание жира (230 г/кг рациона), сахарозы (430 г/кг рациона) и холестерина (1,9 г/кг рациона) [6]. Рацион питания, дефицитный по метионину и холину, наряду со стеатозом и фиброзом печени, повышает содержание триглицеридов в печени, а также активность трансаминаз и щелочной фосфатазы сыворотки крови у крыс, резко снижая при этом массу тела и печени [19].
Для индуцирования НАЖБП у мини-свиней используется стандартный рацион (53% от веса корма) + Лярд (10%) + сахароза (37%) [17], у миниатюрных свиней Lee-Sung – западный рацион (35,3% углеводы, 45,7% жиры и 18,3% белки, энергетическая плотность – 3,8 ккал/кг) [20], у кроликов – стандартный рацион с добавлением 10% Лярда и 2% холестерина [21] или только 1% холестерина [22]. Длительность наблюдения составляет около 2 лет для мини-свиней, 5 мес – у миниатюрных свиней Lee-Sung и около 12–13 нед для кроликов [17, 21, 22].
Для оценки развития неалкогольной жировой болезни печени в условиях эксперимента в первую очередь используются показатели состояния печени: аланин- (АЛТ) и аспартат-трансаминазы (АСТ) печени, триглицериды и масса печени, гистология и гистохимия печеночной ткани и др.) [9, 10]. Кроме того, определяют маркеры воспаления: интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухолей-α (ФНО-α) в плазме крови и гомогенате ткани печени [9]; а также содержание альбумина, триглицеридов и фракций холестерина сыворотки крови, глюкозы натощак и инсулинорезистентность, гиалуроновую кислоту, гаптоглобин и др. [1]. Доказано существенное влияние на развитие НАЖБП холестерина липопротеидов низкой плотности, рост которых приводит к развитию воспаления, НАСГ и фиброза печени [16]. Как указывают S.J. Li et al. [20], одним из наиболее адекватных маркеров НАЖБП у свиней является ИЛ-6. В таблице приводятся показатели, характерные для различных животных, используемых в диет-индуцированных моделях НАЖБП.
Следует отметить, что трансаминазы сыворотки крови, в частности у кроликов и мини-свиней, существенно
не изменяются при индукции НАЖБП, а АСТ у мини-свиней даже снижается после 2 лет эксперимента (см.
таблицу). Хотя при этом у кроликов в 16 раз повышается С-реактивный белок, а у мини-свиней
в 3 раза увеличивается число воспаленных клеток в ткани печени. Однако у мышей на ФФР отмечен
рост уровня АЛТ сыворотки крови почти в 3 раза, а у мышей на западном рационе – увеличение
содержания обеих трансаминаз в ткани печени. Важным представляется рост маркеров воспаления (ИЛ6
и ФНОα) в сыворотке крови мышей, получавших ФФР, а также у кроликов на рационе,
обогащенном свиным жиром и холестерином (см. таблицу). Практически на всех рационах у разных видов
животных отмечается рост содержания триглицеридов и общего холестерина,
а у мини-
свиней – на высокожировом рационе, обогащенном сахарозой, и у мышей на
ФФР достоверно растет концентрация инсулина сыворотки крови (см. таблицу).
Интересны также данные об изменении спектра жирных кислот в ткани печени на фоне рациона с повышенным содержанием жира и сахарозы у мини-свиней; наблюдалось существенное увеличение насыщенных жирных кислот (миристиновой, пальмитиновой, стеариновой и др.), а также олеиновой и арахидоновой, в то время как содержание линолевой кислоты было почти в 2 раза меньше, чем у животных на контрольном рационе [17]. Использование западного рациона у 4-месячных миниатюрных свиней Lee-Sung уже в течение 5 мес способствовало развитию у них НАСГ, близкого по характеристикам к НАСГ человека, с нарушением чувствительности к инсулину, толерантности к глюкозе и ростом СЖК, ИЛ6 и ФНОα; при этом инфильтрация клеток печени макрофагами у них возрастала почти в 3 раза (29,72±7,03 клеток/мм2) в сравнении с показателями у животных на контрольном рационе питания (10,47±2,48 клеток/мм2); отмечался также фиброз печени [20].
Для моделирования НАЖБП современные исследователи наиболее часто используют грызунов, преимущественно мышей и крыс, в основном аутбредных линий, реже – морских свинок и хомяков. В моделях на грызунах предпочитают использовать самцов, у которых быстрее, чем у самок, развиваются нарушения в печени. Из крупных животных применяют мини-свиней Ossabaw, миниатюрных свиней Lee-Sung и др., а также кроликов. Мини-свиней Ossabaw и многих других линий используют ограниченно из-за необходимости длительных сроков исследования и дороговизны в обслуживании. Однако у некоторых мини-свиней, в частности миниатюрных свиней Lee-Sung, сроки развития НАЖБП близки к таковым у грызунов, т.е. их целесообразно использовать для моделирования болезни.
Наиболее эффективными по скорости развития и интенсивности патологических изменений в печени среди диет-индуцированных моделей НАЖБП являются модели с использованием метионин- и холин-дефицитного рациона, однако наиболее адекватными патогенезу развития НАЖБП человека признаны модели с высоким содержанием жира и углеводов типа западного и/или фаст-фудного рационов питания человека. Перспективно использование моделей, сочетающих в себе высокую скорость развития патологии печени с близостью патогенеза изменений к таковому у человека: рационы с высоким содержанием жира и углеводов на фоне дефицита метионина и холина.
Для оценки не только развития НАЖБП, но и эффективности исследуемых лечебно-профилактических мероприятий у животных следует в первую очередь использовать показатели состояния печени: АЛТ, АСТ, триглицериды и масса печени, гистология и гистохимия печеночной ткани и др. Кроме того, большинство исследователей широко применяют маркеры воспаления (ИЛ6, ФНОα, СРБ) сыворотки крови и гомогената печени, исследование содержания альбумина, триглицеридов и холестерина сыворотки крови, глюкозы и инсулина натощак, инсулинорезистентности и многие другие показатели, хорошо зарекомендовавшие себя для решения указанных задач.