Селектированные линии крыс с высоким и низким порогом возбудимости: модель для изучения дезадаптивных состояний, зависимых от уровня возбудимости нервной системы

А.И. Вайдо, доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории генетики высшей нервной деятельности, Н.В. Ширяева, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики высшей нервной деятельности, М.Б. Павлова, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории генетики высшей нервной деятельности, А.С. Левина, младший научный сотрудник лаборатории генетики высшей нервной деятельности, Д.А.-А. Хлебаева, младший научный сотрудник лаборатории генетики высшей нервной деятельности, О.А. Любашина, доктор биологических наук, зав. лабораторией кортиковисцеральной физиологии, Н.А. Дюжикова, доктор биологических наук, зав. лабораторией генетики высшей нервной деятельности ФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6 Е-mail: dyuzhikova@infran.ru

Резюме

Обобщены сведения об основных характеристиках, связанных с генетически-детерминированным уровнем возбудимости нервной системы, а также вызванные длительным эмоционально-болевым стрессорным воздействием, долгосрочные устойчивые изменения в поведении, морфологические, генетические и эпигенетические модификации в клетках различных структур головного мозга крыс линий, селектированных по порогу возбудимости нервной системы к электрическому току: линия с высоким порогом (ВП) возбудимости (низковозбудимая), линия с низким порогом (НП) возбудимости (высоковозбудимая). В ходе многолетних исследований у крыс этих линий выявлены различия как по возбудимости большеберцового нерва, так и по порогам возбудимости других отделов нервной системы, как периферических, так и центральных. Обнаружена зависимость между возбудимостью нервной системы и проявлением безусловно- и условно-рефлекторных характеристик поведения, выявлены различия в стратегии поведения, изменения разных звеньев систем гормональной регуляции, метаболизма медиаторов, структурно-функциональных особенностей мембран нервных клеток. Линии имеют различную чувствительность к нейротоксикантам и мутагенам, а также стресс-реактивность в тестах лишения парадоксальной фазы сна, действии короткого и длительного эмоционально-болевого стресса (по схеме К. Гехта). После длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия на крысах ВП и НП продемонстрированы долгосрочные патологические изменения поведения, сохраняющиеся на протяжении 6 мес. Нарушения высшей нервной деятельности имеют специфические особенности у каждой из линий, что позволило использовать эти линии в качестве модельных вариантов для исследования постстрессорных патологических состояний тревожного спектра (посттравматического стрессового и компульсивного расстройств человека). В основе долгосрочных эффектов стресса лежат морфологические изменения нейронов в разных структурах мозга, дифференциальные постстрессорные модификации хроматина в нейронах и клетках периферических органов, связанные с определенными эпигенетическими изменениями ДНК и гистоновых белков. Обсуждается возможность использования этих линий в качестве оригинальной модели для изучения механизмов, вызванных экстремальными воздействиями (включая стрессорные) дезадаптивных состояний, зависимых от уровня возбудимости нервной системы.

Введение

Важная роль в процессах нейропластичности и формировании нейропатологии принадлежит функциональному состоянию нервной системы. И.П. Павлов первым обратил внимание на важность индивидуальных, генотип-зависимых признаков, а именно – возбудимости в реализации различных типов высшей нервной деятельности. Развитие этих представлений привело к созданию генетических моделей с четкими различиями по особенностям функционирования нервной системы, в том числе и с применением селекционного метода. При этом отбор по переменным с ясной физиологической основой более предпочтителен по сравнению с прямым отбором по поведенческим признакам, поскольку позволяет изучать механизмы наследственной изменчивости адаптивных и патологических процессов на основе целенаправленной стратегии.

Для исследования генетически детерминированных связей между функциональным состоянием нервной системы (возбудимостью), функционированием мозга и широким спектром поведенческих признаков в 70-е годы прошлого века в лаборатории генетики высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П. Павлова была начата селекционная программа, направленная на создание линий крыс с различиями в уровне возбудимости нервной системы. Исходным материалом служили крысы популяции Вистар (Столбовая, Московская область). Отбор вели по величине порога нервно-мышечной возбудимости при раздражении электрическим током большеберцового нерва – n. tibialis (прямоугольные электрические импульсы длительностью 2 мс). В первых 2 поколениях скрещивались полные сибсы. Начиная с 3-го поколения, внутрилинейные скрещивания осуществлялись в случайном порядке. С 10-го поколения селекция вышла на плато. При этом 4-кратные различия между линиями значительно превосходили внутрилинейную изменчивость. Первые результаты были опубликованы в журнале «Генетика» в 1979 г. [1].

Характеристики линий крыс с высоким и низким порогом возбудимости, связанные с наследственно-обусловленной возбудимостью нервной системы

Были выведены 4 линии крыс с разной градацией порогов возбудимости – линия с высоким порогом (ВП) возбудимости (низковозбудимая), линия с низким порогом (НП) возбудимости (высоковозбудимая): ВП1, НП1, ВП2, НП2 (высокий и низкий пороги, соответственно 1, 2 – номера селекционных программ) [1]. В настоящее время поддерживаются 2 линии – ВП1(ВП) и НП2(НП), с наиболее контрастными величинами порогов возбудимости, прошедшие более 70 поколений селекции. ВП – низковозбудимая линия крыс с высоким порогом нервной возбудимости, НП – высоковозбудимая линия с низким порогом нервной возбудимости.

На рис. 1 представлены средние значения порогов возбудимости большеберцового нерва (n. tibialis) у самцов и самок крыс линий ВП и НП последних поколений, демонстрирующие 4-х кратные различия между линиями. Аналогичным образом линии различались по порогу возбудимости других отделов нервной системы, как периферических (n. caudalis) [2], так и центральных, в частности по порогу реакции активации электроэнцефалограммы (ЭЭГ) в ретикулярной формации среднего мозга (отведение от сенсомоторной зоны коры) [3]. Следует отметить, что ретикулярная формация среднего мозга оказывает активирующее влияние на другие отделы центральной нервной системы, и от уровня ее функциональной активности во многом зависит тонус головного мозга в целом. Выявлены также межлинейные различия по длительной потенциации гиппокампа [4].

Согласно данным последних экспериментов, частота фоновой импульсной активности нейронов базолатеральной амигдалы также существенно различается у исследуемых линий, более высокие значения у высоковозбудимых крыс линии НП по сравнению с низковозбудимыми крысами линии ВП (рис. 2).

Селекционный процесс привел к накоплению у высоковозбудимой и низковозбудимой линий изменений в системах гормональной регуляции [5], метаболизма нейромедиаторов [6], структурно-функциональных особенностей мембран нервных клеток [7], нейроанатомических признаков [8].

Молекулярно-генетические исследования показали существенное снижение копийности гена rpl13α у низковозбудимых крыс ВП [9]. Продукт гена 60S рибосомального белка 13α выполняет, помимо канонической рибосомальной функции, роль в ингибировании провоспалительных генов и связан с липидным обменом. 

Обнаружена связь между генетически детерминированной возбудимостью нервной системы и комплексом безусловно- и условно-рефлекторных характеристик поведения. Более высокая двигательная активность и агрессивность, вызванная раздражительностью, характерна для высоковозбудимых крыс линии НП по сравнению с ВП [10, 11]. Для линии НП характерна стереотипность поведения при регистрации активности моторных подсистем и демонстрация выраженной реакции страха при действии экстремальных раздражителей [11].

Способность к обучению у крыс линий ВП и НП отличается в различных тестах. Так, формирование условного рефлекса активного избегания (УРАИ) более эффективно у крыс линии ВП [12, 13], тогда как крысы линия НП демонстрируют лучшие результаты при выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) и большую длительность сохранения памятного следа [13, 14]. Показатели, характеризующие пространственное обучение в водном лабиринте Морриса, не различаются у крыс обеих линий [15]. Однако в этом тесте были выявлены особенности латерального моторного предпочтения и ярко выраженное проявление спонтанного поведения ныряния у высоковозбудимых крыс линии НП [15]. В целом связь возбудимости с обучением при разном подкреплении и в разных методических условиях неодинакова, что связано, по-видимому, с различиями в оптимальном уровне функциональ-
ного состояния нервной системы, необходимом для каждого вида обучения.

На основании данных испытания животных в тестах «открытое поле» и «водный лабиринт Морриса» можно сделать заключение о различной стратегии поведения высоковозбудимых и низковозбудимых крыс [15, 16]. Крысы линии НП строят свое поведение высоковероятностными стереотипами, тогда как линии ВП – более пластично и разнообразно.

Обобщенные, связанные с наследственно обусловленной возбудимостью нервной системы, характеристики линий ВП и НП приведены в табл. 1.

Чувствительность линий крыс ВП и НП к нейротоксикантам и мутагенам

Обнаружена дифференциальная чувствительность к каинату у крыс линий ВП и НП по нейродегенеративным изменениям в гиппокампе, выявляемым с помощью окрашивания срезов мозга FluoroJadeB [17]. У крыс линии ВП нейродегенеративным изменениям подвержено поле СА3 гиппокампа, тогда как у линии
НП–СА1, что может быть связано с различиями в количестве и свойствах каинатных рецепторов [17].

Более высокая чувствительность к действию тиопентала натрия проявляется у высоковозбудимых крыс линии НП по сравнению с низковозбудимыми крысами линии ВП [14]. 

 Чувствительность клеток костного мозга к мутагену циклофосфамиду (мутаген непрямого действия, требующий трансформации микросомальными оксигеназами печени), определяемая по уровню хромосомных аберраций, значительно выше также у высоковозбудимых крыс линии НП по сравнению с ВП [18]. 

 Таким образом, использование экспериментальных животных с различным генетически-детерминированным функциональным состоянием нервной системы при исследовании механизмов действия нейротоксикантов и мутагенов может помочь в понимании причин индивидуальной изменчивости проявления патогенетических процессов как в центральной нервной системе (ЦНС), так и в периферийных органах при интоксикации и определении путей их коррекции, что является необходимым звеном доказательной медицины. 

Постстрессорные морфологические, генетические и эпигенетические изменения у линий крыс ВП и НП

Линии ВП и НП имеют различную стресс-реактивность в тестах лишения парадоксальной фазы сна, иммобилизации, короткого эмоционально-болевого стресса [13]. Однако, остановимся более подробно на последствиях длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС), осуществляемого по стохастической схеме К. Гехта [19].

При действии ДЭБС на крысах ВП и НП продемонстрированы долгосрочные постстрессорные изменения поведения, сохраняющиеся на протяжении 6 мес [19]. Нарушения высшей нервной деятельности имеют специфические особенности у каждой из линий: у низковозбудимой линии ВП – формирование депрессивно-подобного состояния, рост возбудимости, агрессивности, нарушение пластических процессов [13], у высоковозбудимой НП – появление и сохранение компульсивных движений [13]. Это позволило использовать эти линии в качестве модельных вариантов для исследования постстрессорных патологических состояний тревожного спектра, в частности посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) и компульсивного расстройства (КР) человека [20] (табл. 2).

Механизмы, лежащие в основе длительных постстрессорных патологических состояний, связанных с возбудимостью нервной системы:

  • изменения морфологических характеристик мозга;
  • устойчивые генетические и эпигенетические модификации нейронов разных районов мозга [13, 20, 21].

После действия ДЭБС (через 24 ч) было выявлено снижение численной плотности нейронов СА3 поля гиппокампа, сохраняющееся до 2 мес после воздействия у низковозбудимых крыс линии ВП, тогда как у крыс линии НП изменения происходили с латентным периодом 2 мес [20]. Как показали дальнейшие исследования, это не было напрямую связано ни с клеточной гибелью, ни со специфическими изменениями в морфологии клеток гиппокампа.

В основе долгосрочных эффектов ДЭБС лежат также дифференциальные постстрессорные модификации хроматина в нейронах разных структур мозга, связанные с определенными эпигенетическими изменениями ДНК и гистоновых белков [21].

Только у низковозбудимых крыс линии ВП после ДЭБС происходило устойчивое, сохраняющееся до 2 мес после воздействия, снижение площади районов сверхконденсированного хроматина (гетерохроматина) в ядрах нейронов поля СА3 гиппокампа, что сопровождалось увеличением уровня общей РНК [20].

Как известно, маркером активной транскрипции является ацетилирование гистонов, в частности ацетилирование Н3 гистона по лизинам в положении 9 и 14 (ацН3К9/14). Деацетилирование, напротив, ведет к репрессии транскрипции.

У крыс ВП и НП исследовали влияние ДЭБС на степень ацН3К9/14 иммуногистохимическим методом на срезах мозга в сенсомоторной зоне коры, ретикулярной формации среднего мозга,  районах мозга, непосредственно связанных с детерминацией уровня наследственно обусловленной возбудимости нервной системы, а также в медиальной префронтальной коре, гиппокампе и базолатеральной области амигдалы, входящих в патологический нервный контур посттравматического стрессового расстройства. Значительную активацию ацН3К9/14 во всех исследуемых районах мозга относительно контроля наблюдали у крыс линии ВП (рис. 3), наибольшее усиление в ретикулярной формации среднего мозга и СА3 поле гиппокампа, именно тех районах, где ранее были выявлены электрофизиологические и нейроанатомические особенности, связанные с низким уровнем возбудимости нервной системы. У высоковозбудимых крыс НП – менее выраженные разнонаправленные изменения.

Таким образом, характер изменения транскрипционной активности в разных структурах мозга в ответ на ДЭБС зависит от базового, наследственно-обусловленного уровня возбудимости нервной системы. Обнаруженные изменения могут отражать известную адаптивную роль процесса усиления ацетилирования гистонов в механизмах развития депрессии и стрессорной реакции, как механизма противодействующего развитию депрессии [21]. В то же время устойчивое усиление ацетилирования гистона Н3, сохраняющееся до 2 мес после ДЭБС в клетках сенсомоторной и медиальной префронтальной коры у крыс линии ВП может быть связано и с долговременными постстрессорными нарушениями высшей нервной деятельности, которые зависят от низкого уровня возбудимости нервной системы.

Исследование, наряду с ацетилированием, метилированием ДНК и гистона Н3 по лизинам 4 и 9 с противоположным характером влияния на транскрипционные процессы, в динамике изменений до 2 мес после ДЭБС, в медиальной префронтальной коре, гиппокампе и базолатеральной амигдале, позволило построить матрицу долговременных эпигенетических изменений в этих структурах мозга, связанных с уровнем возбудимости нервной системы (рис. 4). У животных низковозбудимой линии ВП большинство изменений возникают через 1 сут после воздействия и длительно сохраняеюся, у линии НП наблюдаются отсроченные изменения, иного спектра и направленности.

ДЭБС приводило также к дестабилизации генома в клетках костного мозга у крыс обеих исследуемых линий, более выраженное возрастание уровня хромосомных аберраций происходило у низковозбудимых животных линии ВП [22].

ПЦР-скрининг для идентификации инсерций ретротранспозона LINE1 в ген grin1 ключевой NR1 субъединицы NMDA рецептора после эмоционально-болевого стрессорного воздействия позволил выявить множественные внедрения в клетках зубчатой извилины гиппокампа. Паттерн этих изменений различен у крыс ВП и НП [23].

Также необходимо оценить влияние ДЭБС на степень генетических изменений непосредственно в нейронах различных структур мозга и длительность их сохранения с помощью современных генетических технологий.

В целом, основываясь на обобщенных в обзоре базовых характеристиках линий ВП и НП и анализе изменений, вызванных стрессом, целесообразно их использовать в качестве модельных объектов для исследования механизмов стресс-индуцированных дезадаптивных состояний на основе персонифицированного подхода с учетом характеристик возбудимости нервной системы, что важно как для выявления генетически-детерминированных факторов риска, связанных с различиями в функциональном состоянии нервной системы, так и для изучения особенностей проявления и длительного течения стресс-зависимой патологии.

***

Работа поддержана программами фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013–2020 гг. (ГП-14, раздел 65) и Президиума РАН (0134-2017-0001).

Список литературы

  1. Вайдо А.И., Ситдиков М.Х. Селекция линий крыс по долгосрочному порогу возбудимости нервно-мышечного аппарата. Генетика. 1979; ХV(1): 144–8.
  2. Вайдо А.И., Енин Л.Д., Ширяева Н.В. Скорость проведения потенциалов действия по хвостовому и большеберцовому нервам у линий крыс, селектированных по возбудимости нервно-мышечного аппарата. Генетика. 1985; 21(2): 262–4.
  3. Александрова Н.П., Ширяева Н.В., Кратин Ю.Г., Лопатина Н.Г. Порог активации мозга у крыс, селектированных по возбудимости нервно-мышечного аппарата. ДАН СССР. 1981; 259: 1233–5.
  4. Вайдо А.И., Ширяева Н.В., Хиченко В.И., Любославская П.Н., Старостина М.В. Развитие длительной посттетанической потенциации и изменение содержания белка S-100 в срезах гиппокампа крыс с различным функциональным состоянием нервной системы. Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1992; 113 (6): 645–-8.
  5. Ордян Н.Э., Вайдо А.И., Ракицкая В.В., Ширяева Н.В., Проймина Ф.И., Лопатина Н.Г., Шаляпина В.Г. Функционирование гипофизарно-адренокортикальной системы у крыс, селектированных по порогу чувствительности к электрическому току. Бюлл.экспер.биологии и медицины.1998; 4: 443–5.
  6. Алехина Т.А., Шульга В.А., Лопатина Н.Г., Ширяева Н.В., Вайдо А.И. Нейрогормональные характеристики крыс, селектированных по длительности пассивно-оборонительной реакции и порогу нервно-мышечной возбудимости.Журн. высшей нервной деятельн. 1994; 44 (4-5): 837–41.
  7. Герасимова И.А., Флеров М.А., Вайдо А.И., Ширяева Н.В. Фосфолипидный состав синаптосом коры головного мозга крыс, различающихся по порогу возбудимости нервной ткани. Нейрохимия.2001;18 (4): 273–8.
  8. Дмитриева Н.И., Гоццо С. Структурные особенности головного мозга крыс, селектированных по порогу возбудимости. Арх. анат.1985; 88 (2): 5–10.
  9. Kalendar R., Belyaev A., Zachepilo T., Vaido A., Maidanyuk D., Schulman A., Dyuzhikova N. Copy-number variation of housekeeping gene rpl13a in rat strains selected for nervous system excitability Molecular and Cellular Probes.2017; 33: 11–5.
  10. Ширяева Н.В., Вайдо А.И., Левкович Ю.И., Лопатина Н.Г. Поведение в открытом поле крыс с различным уровнем возбудимости нервной системы в разные сроки после невротизации.Журн. высш.нерв.деят. 1992; 42 (4): 754–7.
  11. Алехина Т.А., Вайдо А.И., Ширяева Н.В., Лопатина Н.Г. Общие характеристики поведения крыс, селектированных по длительности пассивно-оборонительной реакции и порогу нервно-мышечной возбудимости. Журн. высшей нервн. деятельн. 1994; 44 (3): 597–603.
  12. Лопатина Н.Г., Пономаренко В.В. Исследование генетических основ высшей нервной деятельности. В кн.: Физиология поведения. Нейробиологические закономерности Под ред. А.С. Батуева. Л.: Наука. 1987: 9–59.
  13. Вайдо А.И. Физиолого-генетический анализ возбудимости нервной системы и поведения лабораторной крысы. Дисс … д-ра биол. наук. СПб. 2000; 197.
  14. Швецов А.В., Вайдо А.И., Дюжикова Н.А., Бельская А.В., Михайлова М.В., Скоморохова Е.Б., Батоцыренова Е.Г. Влияние тиопентала натрия на сохранение условного рефлекса пассивного избегания у крыс с различной возбудимостью нервной системы. Токсикол. вестник. 2018; 1: 8–11.
  15. Левина А.С., Захаров Г.А., Ширяева Н.В., Вайдо А.И. Сравнительная характеристика поведения крыс двух линий, различающихся по порогу возбудимости нервной системы, в модели пространственного обучения в водном лабиринте Морриса. Журн. высшей нервной деят. 2018; 68 ( 2): 1–12.
  16. Ширяева Н.В., Вайдо А.И., Петров Е.С., Хофман Г.Ю., Забродин И.Ю., Макарова Т.М. Поведение в открытом поле крыс с различным уровнем возбудимости нервной системы. Журн. высш. нерв. деят.1987;37 (6):1064–9.
  17. Левина А.С., Савенко Ю.Н., Дюжикова Н.А., Вайдо А.И. Каинатные рецепторы в гиппокампе крыс линий, различающихся по уровню возбудимости нервной системы.Морфология. 2011;139 (3): 25–9.
  18. Быковская Н.В., Дюжикова Н.А., Вайдо А.И., Лопатина Н.Г., Шварцман П.Я. Частота хромосомных аберраций, индуцированных стрессорным воздействием и циклофосфаном в клетках костного мозга крыс, селектированных по порогу возбудимости нервной системы. Генетика.1994;30 (9):1224–8.
  19. Ширяева Н.В., Вайдо А.И., Лопатина Н.Г. Влияние невротизации спустя длительные сроки после ее окончания на поведение крыс, различающихся по возбудимости нервной системы. Журн. высш. нервн. деят.1996;46 (1):157–62.
  20. Вайдо А.И., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В., Савенко Ю.Н., Соколова Н.Е., Вшивцева В.В. Системный контроль молекулярно-клеточных и эпигенетических механизмов долгосрочных последствий стресса. Генетика. 2009; 45(3): 342–8.
  21. Дюжикова Н.А., Скоморохова Е.Б., Вайдо А.И. Эпигенетические механизмы формирования постстрессорных состояний. Успехи физиологических наук. 2017; 45 (1): 47–74.
  22. Дюжикова Н.А., Даев Е.В., Павлова М.Б., Ширяева Н.В., Левина А.С., Вайдо А.И. Изменение транскрипционной активности и дестабилизация генома под влиянием психоэмоционального стресса у крыс с контрастной возбудимостью нервной системы. Труды Х1V Международного междисциплинарного конгресса: Нейронаука для мед. и психол. Россия. Судак. Крым. 2018: 191–2.
  23. Zachepilo T.G., Kalendar R., Schulman A.H., Vaido A.I., Dyuzhikova N.A. Emotionally painful stress causes changes in L1 insertion pattern in the hippocampus in rats with different nervous system excitability/27th ECNP Congress, Berlin, Germany. Eur. Neuropsychopharmac. 2014; 24 (2): 163.

Вас может заинтересовать