Возможность использования поведенческих ответов Danio rerio в оценке дозозависимых эффектов феназепама

В.А. Лебедев, кандидат биологических наук, инженер, А.А. Лебедев, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник, aalebedev-iem@rambler.ru Е.Р. Бычков, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, П.Д. Шабанов, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом, pdshabanov@mail.ru Отдел нейрофармакологии им. С.В.Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Россия, 197376. Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12,

Резюме

Рассматривается возможность использования Danio rerio для оценки дозозависимых эффектов феназепама. Ранее у Danio rerio изучали действие анксиолитиков диазепама и хлордиазепоксида, но не феназепама. Использовали метод тест-стресса новизны: рыбу помещали сначала в мерный стакан с растворенным фармакологическим веществом (или водой), а затем – в просмотровый аквариум на 6 мин, где автоматически регистрировали траекторию движения, длину пути, число перемещений в верхнюю часть аквариума, время пребывания в нижней части аквариума, число и время паттерна «фризинг» за каждую минуту опыта. Результаты. Показано, что в ответ на новизну помещения в просмотровый аквариум рыбы реагируют погружением на дно, увеличением фризинга и снижением числа перемещений в верхнюю половину аквариума. На фоне введения феназепама рыбы находились уже не только в нижней, но и в верхней части просмотрового аквариума. Средняя длина пути существенно не изменялась в диапазоне использованных доз (0,1–1 мг/л). Число и время паттерна «фризинг», а также время пребывания в нижней части аквариума в эксперименте снижались более чем в 2 раза по сравнению с контролем и проявляли дозозависимый эффект. Число перемещений в верхнюю часть аквариума за опыт существенно увеличивалось: с 1 – в контроле до 57 – при использовании феназепама в дозе 1 мг/л. При анализе динамики параметров за каждую минуту показано, что время пребывания рыбы в нижней части аквариума снижалось, начиная с 3-й минуты опыта при использовании феназепама в дозе 0,5 мг/л. При этом число перемещений рыбы в верхнюю часть аквариума достоверно увеличивалось более чем в 2 раза, начиная с 3-й минуты опыта при использовании феназепама в дозе 1 мг/л. Заключение. Установлена высокая чувствительность тест-стресса новизны для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio. Доказана перспективность использования Danio rerio в качестве животных моделей в поведенческой фармакологии, причем этот метод не уступает (а даже по ряду позиций превосходит) исследованиям на грызунах.

Введение

Исследования поведения Danio rerio (zebrafish) применяются главным образом в нейробиологии [15, 22], нейроэтологии [4, 16, 17] и нейрофармакологии [6, 14, 19]. Активное плавание, адаптация к новой обстановке, короткий репродуктивный период, высокая плодовитость и низкая себестоимость указывают на возможность использовать Danio rerio в качестве животных моделей для лабораторных исследований [25]. Тест стресса новизны используется для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio. При этом животные демонстрируют стабильные поведенческие ответы под действием стресса новизны [3, 6, 17]. Данный поведенческий тест основывается на инстинкте поиска защиты от незнакомой обстановки погружением на дно, фризингом (обездвиживанием, или «примерзанием») и снижением двигательного (и исследовательского) поведения. После адаптации (акклиматизации) к новой обстановке двигательная активность увеличивается, уменьшается фризинг и увеличивается число переходов в верхнюю половину аквариума [20, 22, 28]. Подобное поведение традиционно анализируется в тесте «открытое поле» в исследованиях тревожности у грызунов [1, 2, 8, 10, 27]. А.В. Калуев и соавт. [9] применили показатели тревожности и адаптировали их непосредственно для Danio rerio. Рыбка помещается сначала в мерный стакан с растворенным фармакологическим веществом (или водой), а затем в небольшой просмотровый аквариум, где региструются двигательная активность, фризинг, число переходов в верхнюю половину аквариума и время в последней. В частности, было исследовано поведение Danio rerio после применения анксиолитиков и анксиогенов [26, 28], что коррелировало с уровнем кортизола в крови [12]. Поведенческие эффекты у Danio rerio показаны также после применения этанола [13], никотина [17], морфина [7], фенамина [23]), бензодиазепинов [3] и кокаина [19]. Влияние стресса новизны у Danio rerio можно тестировать и в ряде дополнительных тестов, таких как свет-темнота [21, 23], Т-образный лабиринт [24], открытое поле [18]. Таким образом, можно более подробно проанализировать поведение животных. Кроме того, существует ряд тестов и для неполовозрелых животных [4, 11]. В последние годы для регистрации поведения Danio rerio применяют компьютерный анализ видеотрека, что также позволяет более детально, с высокой точностью изучить эффекты фармакологических веществ [6, 12, 13]. 

Цель настоящей работы – оценка возможности использования Danio rerio для анализа дозозависимых эффектов феназепама. В исследованиях уровня тревожности и влияния стресса новизны на поведенческие ответы у Danio rerio ранее показано действие диазепама и хлордиазепоксида [3, 10], наиболее известных транк-вилизаторов, которые применяются в клинике многих стран. При этом отечественный препарат феназепам, обладающий более мощным анксиолитическим действием, ранее не был исследован у Danio rerio. Поэтому настоящее исследование было посвящено анализу действия анксиолитика феназепама у Danio rerio.

Методы исследования

Выбор животных. В работе использованы 104 молодые половозрелые рыбы Danio rerio (zebrafish) в возрасте 6–8 мес (жизненный цикл до 5 лет) фирмы «Аква Питер», выращенные в Институте экспериментальной медицины (ИЭМ). Danio rerio – дикий тип (wild type). Для тестирования использовали интактных животных после 2-недельного периода адаптации к помещению в аквариум водоизмещением 40 л по 20–30 рыб в каждом. Температуру воды 25–27°С поддерживали постоянно. Животных содержали в стандартных условиях светового режима 8.00–20.00 ч при температуре помещения 22±2°С, кормили 2 раза в день стандартным кормом tetramin tropical flakes. 

Тест стресса новизны. Для экспериментов оценки новизны применяли стандартный просмотровый аквариум, который используется для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio [6]. Он имел водоизмещение 1,5 л, трапециевидную форму, высоту 15 см и ширину 7 см. Длина аквариума в основании составляла 22 см, а в верхней части – 28 см. Такая конструкция аквариума позволяет минимизировать латеральные движения рыбки и свободно наблюдать за вертикальными и горизонтальными движениями. Поскольку данный поведенческий тест тест основывается главным образом на инстинкте поиска защиты от незнакомой обстановки погружением на дно [12, 16], аквариум был разделен чертой на 2 равные части – верхнюю и нижнюю. Рыбка помещалась сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или водой) на 5 мин, затем – в предстартовый аквариум с водой (10×10×10 см3) на 5 мин и далее – в просмотровый аквариум на 6 мин, где регистровали двигательную активность во время опыта (длина трека рыбки), число переходов в верхнюю и нижнюю половины аквариума и время нахождения в них последовательно за каждую минуту опыта. Автоматически регистрировали число и время паттернов «фризинг» (обездвиживание, или «примерзание») за опыт, которые обычно наблюдаются при стрессе новизны и отражают уровень тревожности животного. Поведение регистрировали автоматически с помощью системы Noldus EthoVision XT7, которая позволяет просмотреть видеотреки рыбки. Система снимает показания как в цифровом выражении, так и визуально, а также контролирует видеотрек. Весь период наблюдения непрерывно регистрировался, при помощи программы шла запись траектории движения (см. рисунок). 

Фармакологические вещества. Для фармакологического анализа использовали субстанцию феназепама ОАО «Новосибхимфарм» (Россия). Феназепам растворяли в воде для аквариумов и применяли в 3 дозах: 1) 0,1 мг на 1000 мл воды; 2) 0,5 мг на 1000 мл воды 3) 1 мг на 1000 мл воды.

Статистическая обработка полученных данные. Применяли пакеты Stаstistica  v.6 и Origin v.7.5. Нормальность распределений оценивали при помощи критерия Колмогорова–Смирнова, значимость различий между группами – при помощи
t-критерия Стьюдента либо U-критерия Манна–Уитни. Данные представлены в виде «среднее арифметическое ± среднеквадратичное отклонение».

Результаты исследований

В процессе проведения экспериментов были установлены типичные поведенческие реакции на новизну (т.е. на помещение животного в просмотровый аквариум). Как правило, рыба находилась в это время в нижней части просмотрового аквариума и совершала небольшие перемещения вдоль него (см. рисунок). Средняя длина пути рыбы, который автоматически регистрировался по продолжительности трека, составляла 1205,0±91,8 см (табл. 1). При этом часто наблюдали фризинг («примерзание», время полной неподвижности). Число и время паттерна «фризинг» автоматически регистрировались и составляли за опыт соответственно 68,2±5,7 и 36,5±4,5 с. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума составляло 351,0±36,4 с. Динамика времени пребывания рыбы в нижней части аквариума регистрировалась автоматически и существенно не изменялась (табл. 2). Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума за опыт составляло 1,2±0,8. Динамика числа перемещений рыбы в верхнюю часть аквариума также регистрировалась автоматически и существенно не изменялась (табл. 3).

На фоне введения феназепама были выявлены типичные для анксиолитика поведенческие реакции на новизну при помещении животного в просмотровый аквариум. Как правило, рыбы находились в это время не только в нижней части просмотрового аквариума, но часто заплывали и в верхнюю его часть (см. рисунок). На фоне феназепама средняя длина пути рыбы существенно не изменялась в диапазоне использованных доз по сравнению с контролем. При этом так же, как и в контроле, наблюдался фризинг. Число и время паттерна «фризинг» достоверно снижались по сравнению с контрольной группой животных (р<0,05) и проявляли дозозависимый эффект. Среднее время пребывания рыбы в нижней части аквариума также достоверно снижалось по сравнению с контрольной группой животных (р<0,05) и составляло при введении 0,1; 0,5 и 1 мг/л соответственно 297,0±37,6; 207,6±52,2 и 142,8±44,1, проявляя неизменно дозозависимый эффект (см. табл. 1). Время пребывания рыбы в нижнем отсеке снижалось, начиная с 3-й минуты опыта при использовании феназепама в дозе 0,5 мг/л по сравнению с 1-й минуты тестирования (р<0,05). Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума за опыт достоверно увеличивалось по сравнению с контролем (р<0,01) и составляло при введении 0,1; 0,5 и 1 мг/л соответственно 3,1±1,1, 18,6±4,3 и 57,0±11,2. Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума достоверно увеличивалось, начиная с 3-й минуты опыта при использовании феназепама в дозе 1 мг/л (см. табл. 3). Время пребывания рыбы в нижней части просмотрового аквариума достоверно увеличивалось начиная с 3-й минуты опыта при использовании феназепама в дозе 0,5 мг/л по сравнению с 1-й минутой тестирования.

Обсуждение полученных результатов. Настоящие исследования показали, что реакция на новизну помещения в просмотровый аквариум у Danio rerio (zebrafish) имеет типичную картину или типичные паттерны поведения. В ответ на незнакомую обстановку просмотрового аквариума рыба реагировала погружением на дно, фризингом (обездвиживанием или «примерзанием») и снижением двигательного поведения. Как правило, рыба большую часть времени находилась в нижней части просмотрового аквариума и совершала небольшие перемещения вдоль него (см. рисунок). При этом часто наблюдали фризинг, число и время которого за опыт было достаточно велико, как и время пребывания рыбы в нижней части аквариума. Динамика времени пребывания рыбы в нижнем отсеке практически не изменялась, так же, как и таковая пребывания рыбы в верхнем отсеке и динамика числа перемещений рыбы в верхний отсек. 

Полученные результаты во многом соответствуют данным литературы, где отмечается, что тестирование стресса новизны применяется в ряде лабораторий для исследования уровня тревожности у Danio rerio, и рыбы показывают, как правило, типичную картину поведенческих паттернов [3, 6, 17]. При этом рыбы плавают в нижней части аквариума и часто замирают (демонстрируя фризинг). Двигательное (и исследовательское) поведение  значительно снижается по сравнению с поведением в домашнем аквариуме [26, 28]. После периода адаптации к просмотровому аквариуму поведение становится во многом подобно таковому в домашнем аквариуме, т.е. двигательная активность увеличивается, уменьшается фризинг и увеличивается число переходов в верхнюю половину аквариума [17, 18, 24]. 

Кроме того, реакция на новизну помещения в просмотровый аквариум у Danio rerio имеет типичную картину паттернов поведения, которая меняется на фоне введения феназепама. Метод регистрации поведения оказался высокочувствительным к анксиолитическому действию исследуемого вещества. При этом рыбы плавали в это время не только в нижней части просмотрового аквариума, но и стали активнее подниматься вверх, а к концу опыта проводили здесь значительную часть времени (см. рисунок). Длина траектории рыбы после введения феназепама существенно не увеличивалась по сравнению с контрольной группой животных (см. табл. 1). Число и время паттерна «фризинг» после введения феназепама достоверно снижались по сравнению с контрольной группой животных, при этом регистрировали дозозависимый эффект, что весьма важно. Время пребывания рыбы в нижней части аквариума после введения феназепама значительно снижалось, особенно при использовании в дозе 0,5 и 1 мг/л. Показатели динамики времени пребывания рыбы в нижнем отсеке также снижались, начиная с 3-й минуты опыта по сравнению с контролем, особенно при использовании феназепама в дозе 0,5 мг/л. Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума после введения феназепама достоверно увеличивалось по сравнению с контролем, особенно при использовании препарата в дозе 1 мг/л. При этом динамика числа перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума также менялась, показатели достоверно увеличивались, начиная с 3-й минуты опыта, особенно при использовании препарата в дозе 0,5 и 1 мг/л. 

Результаты исследования не противоречат данным литературы. Так, тестирование анксиолитиков в ряде лабораторий с целью изучения противотревожного эффекта у Danio rerio показало, что рыбы демонстрируют достаточно типичную картину поведенческих паттернов, аналогичную полученным результатам [3, 6, 17]. При этом паттерны поведения под действием транквилизаторов у Danio rerio сходны с таковыми у грызунов (крысы, мыши) – наиболее частом объекте изучения транквилизаторов.

В настоящей работе был проведен фармакологический анализ действия бензодиазепинового транквилизатора феназепама, что ранее не исследовалось. В литературе описаны лишь анксиолитические эффекты диазепама [10] и хлордиазепоксида [3], наиболее известных транквилизаторов, широко применяемых во многих странах. Следует сказать, что в указанных работах не отмечено принципиальных различий в эффектах этих транквилизаторов, более того, сделан вывод о том, что бензодиазепиновые анксиолитики диазепам и хлордиазепоксид не уступают по выраженности противотревожного эффекта агонисту 5HT1A рецепторов буспирону. Единственным отличием в действии бензодиазепиновых препаратов авторы называют пороговую анксиолитическую дозу, на которую Danio rerio реагируют, что не вызывает седативного эффекта, т.е. существенного снижения двигательной активности [3]. В наших опытах выявлена не только основная квалификационная характеристика отечественного транквилизатора феназепама, заключающаяся в снятии стресса новизны без изменения двигательной активности (типичный анксиолитический эффект, зависимый от дозы), но и дополнительные характеристики, к которым относится изменение характера двигательной активности между верхней и нижней частями просмотрового аквариума за счет возрастания его до гиперактивности в верхней части аквариума, где в норме рыбы, как правило, проводят чрезвычайно мало времени. При этом в нижней части аквариума двигательная активность снижалась умеренно, максимально – в 2 раза, после введения феназепама в большой (1 мг/л) дозе, соответствующей 0,0001% раствору препарата. Эти характеристики, безусловно могут быть использованы и при оценке других классов (групп) лекарственных препаратов, что открывает определенные перспективы использования Danio rerio в качестве недорогого, но достаточно информативного теста для целей фармакологии.

Заключение

На основании полученных данных можно сделать выводы:

  1. Тест-стресса новизны является весьма чувствительным для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio. Использования Danio rerio в качестве животной модели в поведенческой фармакологии перспективно и не уступает (а даже по ряду позиций превосходит) исследованиям на грызунах.
  2. Фармакологический анализ анксиолитического действия феназепама у Danio rerio показал, что феназепам дозозависимо снижает (по сравнению с контрольной группой рыб) число и время фризинга, увеличивает число перемещений в верхнюю половину аквариума и время плавания в последней. 

Список литературы

  1. Лебедев А.А., Пшеничная А.Г., Бычков Е.Р., Якушина Н.Д., Шабанов П.Д. Антагонист рецепторов кортиколиберина астрессин снимает тревожно-фобические состояния у крыс, выращенных в социальной изоляции. Обзор по клин. фармакол. и лек. терапии. 2016. Т. 14. № 4: 24–31 [Lebedev A.A., Pshenichnaya A.G., Bychkov E.R., Yakushina N.D., Shabanov P.D. Antagonist receptorov kortikoliberina astressin snimaet trevozhno-fobicheskie sostoyaniya u krys, vyrashchennyh v social’noj izolyacii. Obzory po klinicheskoj farmakologii i lekarstvennoj terapii. 2016; 14 (4): 24–31 (in Rus)].
  2. Шабанов П.Д., Лебедев А.А., Якушина Н.Д., Пшеничная А.Г., Бычков Е.Р. Моделирование обсессивно-компульсивного и аддиктивного игрового поведения у крыс введением фенамина в тесте закапывания шариков. Наркология. 2017. Т. 16; 1 (181): 32–8 [Shabanov P.D., Lebedev A.A., Yakushina N.D., Pshenichnaya A.G., Bychkov E.R. Modelirovanie obsessivno-kompul'sivnogo i addiktivnogo igrovogo povedeniya u krys vvedeniem fenamina v teste zakapyvaniya sharikov. Narkologiya. 2017; 1 (181): 32–8 (in Rus)].
  3. Bencan Z., Sledge D., Levin E.D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a Danio rerio model of anxiety. Pharmacol. Biochem. Behav. 2009; 94 : 75–80. DOI: 10.1016/j.pbb.2009.07.009.
  4. Best J.D., Alderton W.K. Danio rerio: an in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatr Dis Treat. 2008; 4: 567–76.
  5. Best J.D. Non-associative learning in larval Danio rerio. Neuropsychopharmacology. 2008; 33: 1206–15. DOI: 10.1038/sj.npp.1301489
  6. Blaser R., Gerlai R. Behavioral phenotyping in Danio rerio: comparison of three behavioral quantification methods. Behav Res Methods. 2006; 38: 456–69.
  7. Bretaud S. A choice behavior for morphine reveals experience-dependent drug preference and underlying neural substrates in developing larval Danio rerio. Neuroscience. 2007; 146: 1109–16. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2006.12.073
  8. Bronikowski A.M. Open-field behavior of house mice selectively bred for high voluntary wheel-running. Behav Genet. 2001; 31: 309–16.
  9. Cachat J., Stewart A., Grossman L., Kalueff A.V. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult Danio rerio. Nature protocols. 2010; 5 (11): 1786–9. DOI: 10.1038/nprot.
  10. Choleris E, Thomas AW, Kavaliers M, Prato FS. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neurosci Biobehav Rev. 2001; 25: 235–60.
  11. Creton R. Automated analysis of behavior in Danio rerio larvae. Behav Brain Res. 2009; 203: 127–36. DOI:10.1016/j.bbr.2009.04.030
  12. Egan R.J. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in Danio rerio. Behav Brain Res. 2009; 205: 38–44. DOI: 10.1016/j.bbr.
  13. Gerlai R. Event recording and video-tracking: towards the development of high-throughput Danio rerio screens. In Proc. 5th Conf. on Methods in Behav. Res. Eds. J.J. Noldus, F. Grieco, L.W.S. Loijens, P.H. Zimmerman. 2005.
  14. Gerlai R., Lee V., Blaser R. Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult Danio rerio (Danio rerio). Pharmacol Biochem Behav. 2006; 85: 752-761. DOI: 10.1016/j.pbb.2006.11.010
  15. Guo S. Using Danio rerio to assess the impact of drugs on neural development and function. Expert Opin Drug Discov. 2009; 4: 715–26. DOI: 10.1517/17460440902988464
  16. Key B., Devin C.A. Danio rerio as an experimental model: strategies for developmental and molecular neurobiology studies. Methods Cell Sci. 2003; 25: 1–6.
  17. Levin E.D., Chen E. Nicotinic involvement in memory function in Danio rerio. Neurotoxicol Teratol. 2004; 26: 731–5. DOI:10.1016/j.ntt.2004.06.010
  18. Levin E.D., Bencan Z., Cerutti D.T. Anxiolytic effects of nicotine in Danio rerio. Physiol Behav. 2007; 90: 54–8. DOI: 10.1016/j.physbeh.2006.08.026
  19. Lopez-Patino M.A., Cabral H., Zhdanova I.V. Anxiogenic effects of cocaine withdrawal in Danio rerio. Physiol Behav. 2008; 93: 160–71. DOI: 10.1016/j.physbeh.2007.08.013
  20. Maximino C., Marques B.T., Dias C.A., Gouveia A., Morato S. Parametric analyses of anxiety in Danio rerio scototaxis. Behav. Brain Res. 2010; 210: 1–7. DOI: 10.1016/j.bbr.2010.01.031
  21. Maximino C., Marques B. T., Dias C.A., Gouveia A., Morato S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nat Protoc. 2010; 5: 209–16. DOI: 10.1038/nprot.2009.225
  22. Miklosi A., Andrew R.J. The Danio rerio as a model for behavioral studies Danio rerio. – 2006; 3: 227–34. DOI: 10.1089/zeb.2006.3.227
  23. Ninkovic J., Bally-Cuif L. The Danio rerio as a model system for assessing the reinforcing properties of drugs of abuse. Methods. 2006; 39: 262–74. DOI:10.1016/j.ymeth.2005.12.007
  24. Sackerman J. Danio rerio behavior in novel environments: effects of acute exposure to anxiolytic compounds and choice of Danio rerio line. Int J Comp Psychol. 2010; 23: 43–61.
  25. Spence R., Gerlach G., Lawrence C., Smith C. The behaviour and ecology of the Danio rerio, Danio rerio. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2008; 83: 13–34. DOI: 10.1111/j.1469-185X.2007.00030.x
  26. Stewart A. The developing utility of Danio rerio in modeling neurobehavioral disorders. Int J Comp Psychol. 2010; 23: 104–21. DOI: 10.1016/j.pnpbp.2010.11.035
  27. Streng J. Open-field behavior in four inbred mouse strains. Can. J. Psychol. 1971; 25: 62–8.
  28. Wong K. Analyzing habituation responses to novelty in Danio rerio (Danio rerio). Behav. Brain Res. 2009; 208: 457. DOI:10.1016/j.bbr.2009.12.023

Вас может заинтересовать