Александровская Н.В., Токарева Л.А., Круглова А.А. Опыт моделирования кишечного введения лекарственных препаратов в системе in vivo (краткое сообщение). Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-01-07
При создании новых, современных форм лекарственных препаратов, при разработке носителей лекарственных соединений или при разработке систем целевой доставки лекарственных средств (ЛС) при любом типе введения очень важно понимать процессы, происходящие в различных средах биологического организма, а также изучить влияние физико-химических свойств окружающих сред на новый лекарственный препарат, на сохранность разрабатываемой системы доставки, на ее способность доставить ЛС к заданной цели и защитить его от деградации. Это в конечном итоге влияет и на биологическую активность доставляемого соединения и на эффективность лечения. При разработке новых лекарственных препаратов для обеспечения целевого энтерального высвобождения важны наблюдение за целевой доставкой фармацевтических субстанций в заданные отделы желудочно-кишечного тракта и установка факта успешной доставки ЛС к цели. Для решения проблемы целевой энтеральной доставки биологически активных веществ в настоящее время созданы и продолжают создаваться различные типы защитных оболочек фармакологической субстанции, системы контроля растворения и распада лекарственной формы, новые системы, способствующие преодолению естественных барьеров организма на пути к целевому органу. При создании новых форм лекарственных препаратов энтерального применения строго обязательны исследования по оценке эффективности создаваемой защиты. Однако существующие способы биоразлагаемости и устойчивости не дают полного и достоверного ответа о том, какие процессы и какие изменения происходят с новым лекарственным препаратом.
Цель работы – разработка способа изучения энтеральных ЛС в системе in vivo при трансабдоминальном хирургическом введении в кишечник лабораторных животных.
Был разработан и опробован метод хирургического трансабдоминального введения лекарственных препаратов для исследования их стабильности и эффективности с высокой выживаемостью экспериментальных животных.
Согласно, анализу результатов, предложенный методический подход воспроизводит аспекты энтерального применения новых лекарственных форм и приемлем для оценки их фармакологической эффективности.
Контроль биологической активности вновь создаваемых форм лекарственных средств (ЛС) является основной проблемой при их разработке и испытаниях. Не всегда есть возможность учесть все факторы, влияющие на эффективность новых ЛС, особенно для приема внутрь. В настоящее время контроль эффективности и качества разработки готовых лекарственных форм проводят на специальном оборудовании – тестерах различных фирм и различных модификаций, в которых варьируется рН среды и температура. Однако при использовании данного оборудования не удается узнать, как себя будет вести новая форма в реальных условиях живого организма.
Цель работы – разработка способа изучения энтеральных лекарственных средств в системе in vivo при введении их непосредственно в кишечник лабораторных животных.
Эксперимент проводился на белых беспородных самцах мышей массой 27,0–32,0 г, полученных из питомника Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России, филиал «Андреевка», и прошедших 14-дневный карантин. Содержание и обращение с экспериментальными животными соответствовали требованиям приказа Минздрава России №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и директиве Директиве2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было выполнено с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики.
Животные содержались в группах по 10 особей в клетках IVC Allentown (США) на подстиле Rehofix MK 2000 («Й.Реттенмайер» Германия), при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму ПК-120_152 Премиум (ООО «Лабораторкорм», Россия).
Операция проводилась под общим ингаляционным наркозом с применением системы для проведения анестезии Combi-vet (Швейцария). В качестве анестетика использовался Форан (Aesica Queenborough Limited, Великобритания) в смеси с медицинским кислородом. При этом 2,5% смесь при скорости подачи 2 л/мин и экспозиции 10 мин – в период введения в наркоз и 1,5% смесь при скорости подачи 0,5 л/мин – в процессе операционного вмешательства, через маску. Глубина наркоза контролировалась сжатием пинцетом пальца на лапке. Для снятия тонуса гладкой мускулатуры кишечника можно применять внутримышечное введение папаверина гидрохлорида в дозе 1 мг/кг. Во избежание последствий анестезиологической гипотермии операция проводилась на подогреваемом хирургическом столике Combi-vet (Швейцария).
Этапы проведения оперативного вмешательства:
1) удаление шерстяного покрова в планируемых местах разреза (в области живота) триммером для животных Exacta/Isis (Германия) (рис. 1);
2) обработка места разреза 70% раствором спирта;
3) введение мыши в общий наркоз;
4) фиксация животного на подогреваемом хирургическом столике в положении на спине (рис. 2);
5) обеспечение минимального операционного доступа: при отступлении на 0,5 см от мечевидного отростка по белой линии живота разрез всех слоев кожи, подкожной клетчатки и брюшной стенки длиной 1,0–1,5 см (рис. 3);
6) разведение краев раны пинцетом с обеспечением доступа к тонкому отделу кишечника (рис. 4);
7) смачивание ткани брюшины стерильным физиологическим раствором комнатной температуры в просвете операционной раны 100 мкл (NaCl 0,9% раствор рН 5,0–7,5; «ООО Мосфарм», Россия);
8) выделение и фиксация на крючке с затупленным концом («Атик ушной») петли тонкой кишки, иммобилизация к операционной ране;
9) инъекционное введение исследуемого вещества путем прокола стенки кишки инсулиновым шприцом со стерильной внутренней частью 1/2U с впаянной иглой 0,3 мм/30Gх8 мм (BD Micro-Fine «Plus Demi», США) в направлении сверху вниз (по ходу кишечника), при использовании иглы большего диаметра место прокола необходимо обработать клеем, например, «Сульфакрилат» производства АО «Федеральный научно-производственный центр «Алтай»», Россия (рис. 5);
10) после окончания введения послойное ушивание раны стерильным шовным материалом с хирургическими иглами соответствующего диаметра (для сосудистой или глазной хирургии). На брюшину – непрерывный шов с использованием рассасывающих нитей Лонсорб-М0,7 USP6-0 TH10 и Тисорб 910 М1 USP5-0. Кожный шов – простой узеловой при тщательном соединении краев раны. Допустимо накладывание и непрерывного шва, особенно в местах, доступных зубам грызуна;
11) послеоперационый период; прооперированное животное переносится в клетку с чистым подстилом на период восстановления и в течение 2 ч клетка находится на подогреваемом коврике. Рекомендуется после окончания операции подкожное введение стерильного физиологического раствора в расчете 1–2 мл на 100 г веса животного с целью предотвращения обезвоживания и ускорения выведения токсинов при выходе из наркоза.
Послеоперационный период включает терапию анальгетиками (например, 1% Кетофен – внутримышечно или Мелоксивет – подкожно в дозах, указанных в инструкции), антибиотиком внутримышечно – 2 раза в сутки 20 мг/кг) («Цефтриаксон», ЗАО «Леко», Россия), ежедневную обработку швов и раневой поверхности, ежедневный мониторинг общего состояния для выявления признаков боли и дистресса. В связи с низким порогом чувствительности у мышей и оперативным вмешательством, продолжительностью не более 20 мин негативное влияние боли минимально, поэтому чаще всего терапия анальгетиками не требуется. На 5-е сутки после операции рекомендуется снятие кожных швов.
При проведении исследований с использованием предложенной техники гибели животных не было.
Предложенный метод экспериментального введения вещества применим в исследованиях с использованием меченных лекарственных молекул или формы лекарственного препарата для дальнейшего инструментального детектирования специфической метки (флюоресценции, изотопного излучения, люминесценции).
Вклад авторов: Александровская Н.В – существенный вклад в концепцию работы, написание статьи для публикации, утверждение окончательного варианта статьи для публикации, согласие нести ответственность за все аспекты работы; Токарева Л.А. – разработка дизайна метода, проведение экспериментальной работы, участие в написание статьи для публикации; согласие нести ответственность за все аспекты работы; Круглова А.А. – участие в разработке дизайна метода, проведение экспериментальной работы, подготовка фотоматериалов для статьи, согласие нести ответственность за все аспекты работы.