Опыт моделирования кишечного введения лекарственных препаратов в системе in vivo (краткое сообщение)

Н.В. Александровская, начальник отдела, кандидат биологических наук;
Л.А. Токарева, научный сотрудник,
А.А. Круглова, научный сотрудник

ФГУП «Научный центр «Сигнал»,

115487, Россия, Москва, ул. Нагатинская, д. 16А, стр. 5

Е-mail: natali-aleks@mail.ru

Резюме

При создании новых, современных форм лекарственных препаратов, при разработке носителей лекарственных соединений или при разработке систем целевой доставки лекарственных средств (ЛС) при любом типе введения очень важно понимать процессы, происходящие в различных средах биологического организма, а также изучить влияние физико-химических свойств окружающих сред на новый лекарственный препарат, на сохранность разрабатываемой системы доставки,  на ее способность доставить ЛС к заданной цели и защитить его от деградации. Это в конечном итоге влияет и на биологическую активность доставляемого соединения и на эффективность лечения. При разработке новых лекарственных препаратов для обеспечения целевого энтерального высвобождения важны наблюдение за целевой доставкой фармацевтических субстанций в заданные отделы желудочно-кишечного тракта и установка факта успешной доставки ЛС к цели. Для решения проблемы целевой энтеральной доставки биологически активных веществ в настоящее время созданы и продолжают создаваться различные типы защитных оболочек фармакологической субстанции, системы контроля растворения и распада лекарственной формы, новые системы, способствующие преодолению естественных барьеров организма на пути к целевому органу. При создании новых форм лекарственных препаратов энтерального применения строго обязательны исследования по оценке эффективности создаваемой защиты. Однако существующие способы биоразлагаемости и устойчивости не дают полного и достоверного ответа о том, какие процессы и какие изменения происходят с новым лекарственным препаратом.

Цель работы – разработка способа изучения энтеральных ЛС в системе in vivo при трансабдоминальном хирургическом введении в кишечник лабораторных животных.

Был разработан и опробован метод хирургического трансабдоминального введения лекарственных препаратов для исследования их стабильности и эффективности с высокой выживаемостью экспериментальных животных.

Согласно, анализу результатов, предложенный методический подход воспроизводит аспекты энтерального применения новых лекарственных форм и приемлем для оценки их фармакологической эффективности.

Введение

Контроль биологической активности вновь создаваемых форм лекарственных средств (ЛС) является основной проблемой при их разработке и испытаниях. Не всегда есть возможность учесть все факторы, влияющие на эффективность новых ЛС, особенно для приема внутрь. В настоящее время контроль эффективности и качества разработки готовых лекарственных форм проводят на специальном оборудовании – тестерах различных фирм и различных модификаций, в которых варьируется рН среды и температура. Однако при использовании данного оборудования не удается узнать, как себя будет вести новая форма в реальных условиях живого организма.

Цель работы – разработка способа изучения энтеральных лекарственных средств в системе in vivo при введении их непосредственно в кишечник лабораторных животных.

Материал и методы

Эксперимент проводился на белых беспородных самцах мышей массой 27,0–32,0 г, полученных из питомника Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России, филиал «Андреевка», и прошедших 14-дневный карантин. Содержание и обращение с экспериментальными животными соответствовали требованиям приказа Минздрава России №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и директиве Директиве2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было выполнено с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики.

Животные содержались в группах по 10 особей в клетках IVC Allentown (США) на подстиле Rehofix MK 2000 («Й.Реттенмайер» Германия), при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму ПК-120_152 Премиум (ООО «Лабораторкорм», Россия).

Операция проводилась под общим ингаляционным наркозом с применением системы для проведения анестезии Combi-vet (Швейцария). В качестве анестетика использовался Форан (Aesica Queenborough Limited, Великобритания) в смеси с медицинским кислородом. При этом 2,5% смесь при скорости подачи 2 л/мин и экспозиции 10 мин – в период введения в наркоз и 1,5% смесь при скорости подачи 0,5 л/мин – в процессе операционного вмешательства, через маску. Глубина наркоза контролировалась сжатием пинцетом пальца на лапке. Для снятия тонуса гладкой мускулатуры кишечника можно применять внутримышечное введение папаверина гидрохлорида в дозе 1 мг/кг. Во избежание последствий анестезиологической гипотермии операция проводилась на подогреваемом хирургическом столике Combi-vet (Швейцария).

Этапы проведения оперативного вмешательства:

1) удаление шерстяного покрова в планируемых местах разреза (в области живота) триммером для животных Exacta/Isis (Германия) (рис. 1);

 <strong>Рис. 1.</strong> Удаление шерстного покрова
Рис. 1. Удаление шерстного покрова

2) обработка места разреза 70% раствором спирта;

3) введение мыши в общий наркоз;

4) фиксация животного на подогреваемом хирургическом столике в положении на спине (рис. 2);

 <strong>Рис. 2.</strong>  Введение в общий наркоз и фиксация животного
Рис. 2.  Введение в общий наркоз и фиксация животного

5) обеспечение минимального операционного доступа: при отступлении на 0,5 см от мечевидного отростка по белой линии живота разрез всех слоев кожи, подкожной клетчатки и брюшной стенки длиной 1,0–1,5 см (рис. 3);

 <strong>Рис. 3. </strong>Операционный разрез
Рис. 3. Операционный разрез

6) разведение краев раны пинцетом с обеспечением доступа к тонкому отделу кишечника (рис. 4);

 <strong>Рис. 4.</strong> Высвобождение петли кишечника
Рис. 4. Высвобождение петли кишечника

7) смачивание ткани брюшины стерильным физиологическим раствором комнатной температуры в просвете операционной раны 100 мкл (NaCl 0,9% раствор рН 5,0–7,5; «ООО Мосфарм», Россия);

8) выделение и фиксация на крючке с затупленным концом («Атик ушной») петли тонкой кишки, иммобилизация к операционной ране;

9) инъекционное введение исследуемого вещества путем прокола стенки кишки инсулиновым шприцом со стерильной внутренней частью 1/2U с впаянной иглой 0,3 мм/30Gх8 мм (BD Micro-Fine «Plus Demi», США) в направлении сверху вниз (по ходу кишечника), при использовании иглы большего диаметра место прокола необходимо обработать клеем, например, «Сульфакрилат» производства АО «Федеральный научно-производственный центр «Алтай»», Россия (рис. 5);

 <strong>Рис. 5.</strong> Введение исследуемого лекарственного средства
Рис. 5. Введение исследуемого лекарственного средства

10) после окончания введения послойное ушивание раны стерильным шовным материалом с хирургическими иглами соответствующего диаметра (для сосудистой или глазной хирургии). На брюшину – непрерывный шов с использованием рассасывающих нитей Лонсорб-М0,7 USP6-0 TH10 и Тисорб 910 М1 USP5-0. Кожный шов – простой узеловой при тщательном соединении краев раны. Допустимо накладывание и непрерывного шва, особенно в местах, доступных зубам грызуна;

11) послеоперационый период; прооперированное животное переносится в клетку с чистым подстилом на период восстановления и в течение 2 ч клетка находится на подогреваемом коврике. Рекомендуется после окончания операции подкожное введение стерильного физиологического раствора в расчете 1–2 мл на 100 г веса животного с целью предотвращения обезвоживания и ускорения выведения токсинов при выходе из наркоза.

Послеоперационный период включает терапию анальгетиками (например, 1% Кетофен – внутримышечно или Мелоксивет – подкожно в дозах, указанных в инструкции), антибиотиком внутримышечно – 2 раза в сутки 20 мг/кг) («Цефтриаксон», ЗАО «Леко», Россия), ежедневную обработку швов и раневой поверхности, ежедневный мониторинг общего состояния для выявления признаков боли и дистресса. В связи с низким порогом чувствительности у мышей и оперативным вмешательством, продолжительностью не более 20 мин негативное влияние боли минимально, поэтому чаще всего терапия анальгетиками не требуется. На 5-е сутки после операции рекомендуется снятие кожных швов.

При проведении исследований с использованием предложенной техники гибели животных не было.

Заключение

Предложенный метод экспериментального введения вещества применим в исследованиях с использованием меченных лекарственных молекул или формы лекарственного препарата для дальнейшего инструментального детектирования специфической метки (флюоресценции, изотопного излучения, люминесценции).

Вклад авторов: Александровская Н.В – существенный вклад в концепцию работы, написание статьи для публикации, утверждение окончательного варианта статьи для публикации, согласие нести ответственность за все аспекты работы; Токарева Л.А. – разработка дизайна метода, проведение экспериментальной работы, участие в написание статьи для публикации; согласие нести ответственность за все аспекты работы; Круглова А.А. – участие в разработке дизайна метода, проведение экспериментальной работы, подготовка фотоматериалов для статьи, согласие нести ответственность за все аспекты работы.

Список литературы

  1. Макарова М.Н., Рыбакова А.В., Гущин Я.А., Шедько В.В., Мужикян А.А., Макаров В.Г. Анатомо-физиологическая характеристика пищеварительного тракта у человека и лабораторных животных. Международный вестник ветеринарии. 2016; 1: 82–104. [Makarova M.N., Rybakova A.V., Gushchin Ya.A., Shed'ko V.V., Muzhikyan A.A., Makarov V.G. Anatomo-fiziologicheskaya kharakteristika pishchevaritel'nogo trakta u cheloveka i laboratornykh zhivotnykh. Mezhdunarodnyi vestnik veterinarii. 2016; 1: 82–104 (in Russ)].
  2. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Маслюков П.М. Анатомия лабораторной мыши. СПб.: Изд-во СПб Гос. университета, 2012. [Nozdrachev A.D., Polyakov E.L. Maslyukov P.M. Anatomiya laboratornoi myshi. SPb.: Izd-vo SPb Gos. universiteta, 2012 (in Russ)].
  3. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы : Лабораторные животные. СПб.: Изд-во «Лань», 2001: 464 с. [Nozdrachev A.D., Polyakov E.L. Anatomiya krysy : Laboratornye zhivotnye. SPb.: Izd-vo «Lan'», 2001: 464 p. (in Russ)].
  4. Руководство по работе с лабораторными животными для сотрудников, занятых проведением доклинических испытаний. Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России), Университетская комиссия по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных. М., 2015: 42 с. [Rukovodstvo po rabote s laboratornymi zhivotnymi dlya sotrudnikov GBOU VPO RNIMU im. N.I. Pirogova Minzdrava Rossii, zanyatykh provedeniem doklinicheskikh ispytanii / Ministerstvo Zdravookhraneniya Rossiiskoi Federatsii, Gosudarstvennoe byudzhetnoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego professional'nogo obrazovaniya «Rossiiskii natsional'nyi issledovatel'skii Meditsinskii universitet imeni N.I. Pirogova» Ministerstva Zdravookhraneniya Rossiiskoi Federatsii (GBOU VPO RNIMU im. N.I. Pirogova Minzdrava Rossii), Universitetskaya komissiya po kontrolyu za soderzhaniem i ispol'zovaniem laboratornykh zhivotnykh. M., 2015: 42 p. (in Russ)].

Вас может заинтересовать