Muc2-дефицитные мыши как модель хронического воспаления

Введение

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — широко распространенная группа хронических заболеваний [1], встречаемость которых достигает 369 случаев на 100 000 населения [2]. На сегодняшний день непосредственные и отдаленные причины возникновения ВЗК активно исследуются, существующие подходы к терапии нельзя признать удовлетворительными. Так, применение антибиотиков, аминосалицилатов, кортикостероидов и иммуносупрессантов нельзя считать достаточно эффективным методом лечения, поскольку данные препараты снижают лишь симптомы ВЗК. Именно поэтому так важен поиск новых методов лечения, продолжающийся и по сей день [3, 4].

Исследование новых терапевтических подходов, действующих на фундаментальные механизмы развития ВЗК, основным из которых является воспаление, предполагает расширение арсенала исследовательских моделей, воспроизводящих ключевые симптомы. При выборе животной модели для исследования ВЗК трансгенные модели имеют преимущество, поскольку воспроизводят картину патологии, развивающейся в течение всей жизни, с учетом возможных компенсаторных механизмов.

Цель работы — изучить и объединить имеющиеся данные об уникальной модели ВЗК, мышах с нокаутом гена муцина (Muc2-⁠/⁠-⁠), созданной в Нидерландах, а также обосновать эффективность использования Muc2-⁠/⁠-⁠ мышей в качестве модели хронического воспаления.

Поиск литературы осуществляли в базах PubMed и Goggle Scholar.

Патогенез воспалительных заболеваний кишечника

ВЗК — это хронические иммуновоспалительные заболевания [1]. Самые распространенные случаи ВЗК — это болезнь Крона и язвенный колит. В большинстве своем ВЗК развивается у человека в возрасте до 30 лет. ВЗК проявляются возникновением хронического воспаления на протяжении всего кишечного тракта [5]. Для ВЗК также характерны периоды длительной ремиссии с рецидивами и многочисленные внекишечные осложнения [1]. Однако точная этиология ВЗК до сих пор обсуждается [5].

Болезнь Крона отличается от язвенного колита локализацией воспаления: язвенный колит в основном поражает отделы толстого кишечника, в то время как при болезни Крона поражается в основном тонкий кишечник. У пациентов с язвенным колитом часто наблюдается ректальное кровотечение, чего почти не наблюдается у пациентов с болезнью Крона, но у последних часто возникают осложнения в виде свищей [5, 6].

Ключевым симптомом развития язвенного колита является диффузное хроническое воспаление слизистой оболочки, распространяющееся проксимально от прямой кишки. Причиной воспаления служит нарушение слизистого слоя, вызванное истощением муцина 2 — основного секреторного муцина бокаловидных клеток толстого кишечника [7, 8].

Показано, что нарушение слизистого слоя приводит к контакту кишечной флоры с эпителиальными тканями толстой кишки [9], в результате чего активируется локальная иммунная система [10, 11]. Проникновению бактерий в слой эпителия кишечника способствует также нарушение регуляции плотных контактов эпителия, что становится причиной распространения воспалительного процесса не только на слизистую оболочку, но и на подлежащие слои вплоть до мышечного [12–14]. В результате активации врожденного иммунитета [15] происходит привлечение Т-⁠хелперов, нейтрофилов и макрофагов в места воспаления [16]. При этом макрофаги не только секретируют широкий спектр цитокинов, запуская воспалительный процесс, но также и принимают участие в регуляции восстановления поврежденной ткани [14].

При запуске воспалительных процессов макрофаги моноцитарного происхождения первыми из иммунных клеток проникают в ткани кишечника [17]. При этом происходит поляризация макрофагов по провоспалительному типу [18], и они секретируют провоспалительные цитокины [14]. Так, макрофаги продуцируют CD14, TREM-⁠1 и человеческий миелоидный IgA Fc-⁠рецептор CD89, активированный NF-⁠κB [18], TNF, IL-⁠6, IL-⁠8, IL-⁠23, IL-⁠1β и IFNγ и хемокины (CCL2) [19].

При исследовании роли макрофагов кишечника в патогенезе ВЗК было показано, что у мышей с дефицитом IL-⁠10 макрофаги в ответ на контакт с комменсальной флорой способствуют развитию опосредованного Т-⁠хелперами хронического колита за счет продукции IL-⁠12 и IL-⁠23 [18].

Клеточный профиль иммунного ответа у пациентов с ВЗК имеет специфические особенности. У больных ВЗК наблюдается значительное снижение количества CD103⁺-⁠дендритных клеток [9], отвечающих за регуляцию иммунного ответа [20], в то время как количество CD14⁺-⁠макрофагов, участвующих в распознавании бактерий [17], наоборот, возрастало [9]. Такие изменения в составе иммунных клеток отражают аутоиммунную реакцию на собственную микрофлору. Воспаление, возникающее в кишечнике, сопровождается увеличением синтеза антибактериальных молекул и изменением регуляции активности иммунных клеток [21]. Наряду с этим возрастает продукция провоспалительных цитокинов, в том числе TNF-⁠α [22], IL-⁠1 β, IL-⁠6, IL-⁠12, IL-⁠23 и хемокинов [23].

Значение интерлейкинов для патогенеза ВЗК может быть проиллюстрировано на примере IL-⁠23. Известно, что ряд мутаций в гене рецептора IL-⁠23 (IL23R) способствует развитию ВЗК. В то же время увеличение продукции IL-⁠23 способствует пролиферации Т-⁠клеток кишечника, накоплению Т-⁠хелперов-⁠17 [24, 25], участвующих в аутоиммунных реакциях [26], а также снижает дифференцировку Foxp3⁺ Т-⁠клеток, способствующих снижению иммунного ответа, и как следствие — секрецию IL-⁠10 [24, 25]. Снижение экспрессии гена IL-⁠10 [27] или его рецепторов в свою очередь ассоциировано с развитием колита [25]. Многоцентровое исследование антитела-⁠антагониста к рецептору IL-⁠6 показало клиническое улучшение у пациентов с ВЗК, подтвердив значение этого сигнального пути как терапевтической мишени [28].

Кроме того, известно, что ряд полиморфизмов в генах секреторных молекул дендритных клеток увеличивает вероятность развития ВЗК. К таким генам относится ген цитокина семейства TNF Tl1α, повышенная экспрессия которого наблюдалась у пациентов [25].

Наличие у пациентов ВЗК повышает риск онкологических осложнений, так как хроническое воспаление способствует развитию опухоли путем активации пролиферации и противоапоптозных механизмов предраковых клеток, а также прогрессированию опухоли и метастазов при ее возникновении. Хемокины не только регулируют миграцию инвазивных клеток к кровеносным сосудам, но некоторые, такие как CXCR4, CCR4, CCR7, CCR9 и CCR10, также контролируют миграцию метастатических клеток в отдаленные органы. Провоспалительные цитокины, такие как IL-⁠6 и IL-⁠11, контролируют экспрессию фактора семейства Tff3, что также может способствовать метастазированию [28].

Таким образом, именно макрофагальное звено иммунного ответа является ключевым регулятором развития патогенеза ВЗК и остроты воспаления. Определяющими процессами при этом выступают поляризация макрофагов по провоспалительному типу и паракринная регуляция с помощью синтеза провоспалительных цитокинов. Поскольку ВЗК характеризуются активной пролиферацией кишечного эпителия в онкогенных условиях, образование опухолей является одним из тяжелых осложнений.

Причины возникновения ВЗК и подходы к терапии

Причины развития ВЗК многочисленны. Известно, что внешняя среда может способствовать развитию ВЗК. К негативным факторам внешней среды относят диету, географическое положение, социальный стресс, а также наркотики и курение [29, 30]. Не менее важен вклад в патогенез ВЗК дисфункции врожденных и адаптивных иммунных путей, в том числе в результате генетических нарушений [29]. Установлено, что наиболее значимым фактором для развития ВЗК является генетическая предрасположенность и наследственность. В настоящее время показано, что генетическая предрасположенность может влиять на барьерную функцию кишечника и работу иммунной системы [7]. Выявлено более 200 мутаций, коррелирующих с возникновением ВЗК [31].

Формированию ВЗК может способствовать нарушение бактериального состава кишечной флоры у пациентов [32], что приводит к изменению соотношения бактериальной микрофлоры кишечника. Это является крайне важным аспектом для развития воспаления [25]. У пациентов с болезнью Крона наблюдалось снижение количества ряда симбиотических бактерий, таких как Firmicutes и Bacteroidetes [25, 33, 34]. В случае ВЗК, вызванных дефицитом слизистого слоя, отсутствие муцина 2, а вместе с ним и терминальной молекулы муцина 2 фукозы, может способствовать устойчивости патогенов в кишечнике человека [35].

Главной целью, преследуемой при лечении ВЗК, является улучшение качества жизни пациентов посредством переключения заболевания с активной формы на ремиссию и ее поддержание [36]. В настоящее время применяется ряд препаратов для купирования симптомов ВЗК. К ним относятся кортикостероиды, 5-⁠аминосалициловая кислота, иммуномодуляторы и антибиотики. В некоторых случаях при лечении ВЗК используют сорбирующие средства и антибиотики, что помогает нормализации пищеварительных процессов [37]. Также в настоящее время идет поиск наиболее эффективных молекул, в том числе факторов роста, способствующих регенерации слизистого слоя в кишечнике [38]. Однако все эти подходы не излечивают пациентов, а лишь купируют симптомы заболеваний [5], обеспечивая в лучшем случае долговременную ремиссию. К тому же в некоторых случаях указанная терапия выступает как стимул для развития ряда тяжелых осложнений [39]. Многочисленные данные свидетельствуют о резистентности части пациентов к терапии или снижении эффективности лечения со временем [40], поэтому так важен поиск новых методов лечения.

Роль муцина 2 в патогенезе ВЗК

Выше мы упоминали о нарушении целостности слизистого слоя кишечника как ключевом событии развития хронического воспаления. Основными компонентами слизистого слоя толстого кишечника являются муцины, в первую очередь муцин 2 [41]. Белок муцина 2 обладает тандемными, нерегулярными повторяющимися последовательностями, а также богат треониновыми и сериновыми участками, необходимыми для о-⁠гликозилирования [42]. Сайты о-⁠гликозилирования могут служить местом адгезии для бактерий, а также служат источником энергии для симбиотических бактерий [43].

Муцин 2 синтезируется бокаловидными клетками, в которых он подвергается процессингу и хранится в секреторных гранулах до момента секреции, после чего распределяется по кишечному тракту [14, 41]. Однако это распределение неоднородно: в толстом кишечнике имеются два разных по плотности слоя слизи [44], в то время как в тонком кишечнике есть только один рыхлый слой [14]. Внутренний слой толстого кишечника, наиболее твердый и плотный, обладает высокой концентрацией муцина 2. Внутренний слой имеет маленькие поры, что блокирует попадание бактерий в этот слой [43]. Внешний слой рыхлый, является средой обитания комменсальных бактерий [44]

Таким образом, слизистый слой кишечника имеет два слоя: защитный внутренний, в норме непроницаемый для симбиотических бактерий и патогенов, и внешний, предоставляющий им среду обитания [21, 45]. Внутренний слой слизи обеспечивает первую линию защиты при развитии ВЗК 9 (рис. 1) [46].

Терминальная молекула муцина 2 — моносахарид фукозы, участвующий во взаимодействиях с белками [47]. Фукоза является источником пищи для бактерий кишечника, а также может подавлять вирулентность патогенов в кишечнике хозяина [35]. В последнее время фукозе придается важное значение как потенциальному агенту, снижающему агрессивное действие микробного сообщества кишечника при ВЗК [48, 49]. Была показана связь гликозилирования муцина 2 и ВЗК: у пациентов терминальные участки молекулы представлены более короткими гликанами [50].

Таким образом, муцин 2 — основной структурный компонент кишечной слизи, необходимый для выполнения ею защитной функции [51]. Участие муцина 2 в формировании эффективного физического барьера и препятствие адгезии патогенных микроорганизмов крайне необходимы для защиты кишечного эпителия [52].

Потеря муцина 2 приводит к истощению слизистого слоя, что в свою очередь вызывает развитие воспалительных процессов, характерных для ВЗК [53].

Нокаутные по муцину 2 мыши как модель ВЗК

Многообразие причин, приводящих к ВЗК, и сложность терапии этих заболеваний вызывают потребность в различных моделях для разработки лекарств. Наряду с моделями индуцированного ВЗК, к которым относятся модель, индуцируемая декстрансульфатом натрия (DSS) [54], модели, индуцируемые 2,4,6-⁠тринитробензолсульфокислотой (TNBS) и динитробензолсульфокислотой (DNBS) [55], а также модели с переносом популяции Т-⁠клеток иммуносупрессированным мышам [54], используются трансгенные мыши с нокаутом IL-⁠10-⁠/⁠-⁠ [56] или с нокаутом IL-⁠23-⁠/⁠-⁠ [20] и др. [55].

Одной из используемых моделей воспалительных заболеваний кишечника является модель мышей с нокаутом по гену муцина 2 (Muc2-⁠/⁠-⁠), у которых спонтанно развивается язвенный колит [9].

Наиболее важной характеристикой данной модели ВЗК является возможность изучать широкий спектр симптомов ВЗК на одной модели. Тем самым складывается наиболее точное представление о патогенезе ВЗК. Более того, симптомы ВЗК у мышей с нокаутом муцина 2 развиваются спонтанно, само заболевание протекает с длительными периодами ремиссии, что также свойственно и для пациентов. Отсутствие необходимости искусственно формировать патологическое состояние позволяет изучать непосредственно причинно-⁠следственные связи, лежащие в основе самого заболевания, а не комбинации симптомов и побочных эффектов индукции ВЗК.

Изучаемые мыши с нокаутом гена муцина 2 впервые были созданы в Нидерландах А. Velcich [57]. Нокаут гена был получен на базе C57BL/⁠6J 129/⁠SvOla линий мышей путем замены геномного фрагмента, охватывающего экзоны 2–4-⁠го гена муцина 2, на фрагмент, содержащий ген, определяющий устойчивость к неомицину, под контролем промотора фосфоглицераткиназы-⁠1 (PGK-⁠Neo). Изначально мыши были созданы для изучения колоректального рака. Начиная с 6-⁠го месяца жизни у них формируются аденокарциномы по всей длине кишечника, к 1 году опухоли образуются у 100% нокаутных мышей [51].

У мышей с нокаутом гена муцина 2 развивается недостаточность слизистого слоя, в результате бактерии входят в контакт непосредственно с эпителиальными клетками кишечника [9, 43]. Показано, что у мышей с нокаутом муцина 2 увеличивается проницаемость кишечника [58], которая приводит к попаданию в кровь бактерий и вызывает интоксикацию [59]. Тесный контакт бактерий с эпителиальной стенкой кишечника способствует развитию хронических воспалительных реакций и гиперплазии эпителия, что в конечном итоге приводит к формированию опухолей [43]. Таким образом, эта линия мышей воспроизводит патогенетическую цепочку, характерную для пациентов с ВЗК [8, 46].

Муцин 2 является основой слизистой оболочки кишечного тракта как у человека, так и у мышей [60]. Отсутствие столь важной молекулы влечет за собой нарушения морфологии тканей преимущественно в дистальных отделах желудочно-⁠кишечного тракта, где содержание муцинов в слизистом слое наибольшее. Это приводит и к функциональным нарушениям. Так, с рождения мышата набирают меньшую массу тела из-⁠за недоедания [61], в период с 8-⁠й по 20-⁠ю неделю у животных начинает спонтанно возникать колит [9], а с 6-⁠го месяца у мышей формируются опухоли [51].

Характерными симптомами ВЗК у мышей с дефицитом муцина 2 являются снижение массы тела, наличие кишечных кровотечений с 8-⁠й недели жизни, а также ректальный пролапс. Начиная с 9-⁠й недели жизни у некоторых мышей наблюдается более жидкий стул [53]. Чтобы точнее оценить симптомы, используют систему Disease activity index (DAI), где с помощью балльной схемы оценивается тяжесть клинических проявлений у мышей [35]. По шкале от 1 до 4 оцениваются наличие или отсутствие, а также выраженность следующих симптомов: потеря массы тела, нарушение стула, ректальное кровотечение [61, 62].

Интересно, что у мышат вплоть до 28-⁠го дня жизни, момента перехода с материнского вскармливания на полноценный рацион, не наблюдается значимых изменений в морфологии кишечника, за исключением отсутствия типичной колоколообразной формы бокаловидных клеток [63]. После перехода на самостоятельное питание начинают выявляться патологические изменения в кишечнике: с 16-⁠недельного возраста у мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ детектировались увеличение длины крипт, а также потеря архитектуры крипт и общей структуры собственной пластинки в проксимальном отделе толстой кишки. В дистальном отделе толстого кишечника уже с 5-⁠й недели наблюдаются гиперплазия крипт, уплощение эпителиальных клеток и инфильтрация иммунных клеток. Начиная с 12–16-⁠й недели жизни в дистальном отделе перестают детектироваться бокаловидные клетки. К 16-⁠й неделе заметно уплощается и искажается структура эпителия, сильно увеличивается длина крипт, а также наблюдается активная инфильтрация воспалительных клеток и эпителиальная эрозия [53, 64].

При гистологическом анализе у животных с нокаутом гена муцина 2 почти не детектируются бокаловидные клетки в срезах двенадцатиперстной кишки, а также на протяжении всех отделов толстой кишки мышей. Однако экспрессия трефоидного фактора (Itf) [63], являющегося маркером дифференцированных бокаловидных клеток [51], увеличивается, что может быть следствием удлинения крипт [63].

При исследовании миграции эпителиальных клеток кишечника выяснили, что эпителиальные клетки кишечника мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ мигрировали намного быстрее в просвет кишечника по сравнению с клетками мышей Muc2+/⁠+. Такое наблюдение может быть следствием бактериальной стимуляции эпителия кишечника и действием на клетки провоспалительных цитокинов [51, 53].

Исследования цитокинов выявили значительное увеличение (в 5 раз) количества мРНК воспалительного цитокина TNF-⁠α в толстой кишке мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ по сравнению с контрольными. Кроме того, мыши Muc2-⁠/⁠-⁠ продемонстрировали тенденцию к усилению (в 4 раза) экспрессии гена IL-⁠1β в толстой кишке [53].

При исследовании влияния экзогенной фукозы на состояние мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ обнаружено, что уровень АТФ у перитонеальных макрофагов нокаутных мышей был значительно снижен по сравнению с животными контрольной группы мышей C57Bl6. Это может быть следствием возникновения окислительного стресса у мышей Muc2-⁠/⁠-⁠, что также характерно и для пациентов с ВЗК [64].

Отсутствие нормальной слизистой оболочки у нокаутных по муцину 2 мышей приводит к развитию воспалительного процесса, симптоматика которого схожа с таковой у пациентов с язвенным колитом [9]. Основными цитокинами, увеличение секреции которых наблюдается при ВЗК у пациентов, являются TNF-⁠α, IL-⁠1β и IL-⁠6 [53]. Кроме того, изменяется экспрессия IL-⁠12 и INF-⁠γ [65].

Схожим образом у мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ обнаружено повышение экспрессии TNF-⁠β и IL-⁠1β [52, 66]. У мышей также была увеличена экспрессия интерлейкина-⁠1-⁠альфа (IL-⁠1α) в сравнении с мышами C57BL/⁠6 и экспрессия транскрипционного фактора Т-⁠регуляторных клеток (Foxp3), в то время как уровень экспрессии транскрипционных факторов Т-⁠хелперов-⁠1 (Th1) и Т-⁠хелперов-⁠17 (Th17), Tbx21 и Rorc соответственно не отличался от контрольной группы C57BL/⁠6. Не обнаружено различий и в экспрессии цитокинов (IL-⁠22, IL-⁠17, IL-⁠12p40, IL-⁠12p70), участвующих в Т-⁠хелперном опосредованном ответе [49].

F. Obermeier и соавт. [67] в своей работе на разных моделях ВЗК продемонстрировали роль толл-⁠подобных рецепторов (TLR) при хроническом воспалении, когда их экспрессия значительно увеличена. У мышей Muc2-⁠/⁠-⁠ на фоне перехода на самостоятельное питание начинает формироваться воспаление, в результате перестают экспрессироваться TLR, а также перестраивается экспрессия цитокинов. TLR4-⁠ и TLR9-⁠рецепторы предположительно вносят вклад в ограничение развития колита в период грудного вскармливания. Однако к 28-⁠му дню жизни у мышат начинают формироваться первые признаки воспаления. Происходит увеличение экспрессии генов Cd45, Cd3ε и Foxp3, маркеров Т-⁠клеток в сочетании с повышением экспрессии генов цитокинов IL-⁠12, p35, IL-⁠10, TGF-⁠β1 и TNF-⁠α в дистальном отделе толстого кишечника. У мышат на 28-⁠й день жизни также изменяется морфология кишечника, появляются первые признаки уплощения эпителия и эрозия, в то время как в проксимальном отделе таких изменений не наблюдается [63].

Заключение

Таким образом, мыши, нокаутные по гену муцина 2, хорошо воспроизводят и симптоматику, и патогенетическую картину, наблюдаемую при развитии воспалительного заболевания кишечника у человека. В отличие от индуцируемых моделей у нокаутных мышей наблюдается развитие патологии, повторяющей характеристики патологического процесса у пациентов, — спонтанное возникновение, плавное развитие, длительные ремиссии. Важным является и гарантированное развитие опухолей как следствие воспалительного процесса, то есть ясный финал с хорошо исследованным таймингом. Перечисленные особенности делают эту линию мышей очень удобной моделью для исследования новых терапевтических подходов к лечению воспалительных заболеваний кишечника и хронических воспалительных процессов в целом.