Вариабельность биохимических показателей крови и установление референтных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 10: монгольские песчанки

Введение

Песчанка монгольская — вид грызунов рода малых песчанок. Миролюбивые и устойчивые к недостатку воды грызуны. Зарегистрировано более 100 видов песчаноподобных грызунов, но монгольская песчанка (Meriones unguiculatus) является видом, наиболее часто используемым в биомедицинских исследованиях. Рассматриваемые животные используются в научных целях с 1880-⁠х годов, начиная с изучения туберкулеза; они также сыграли значительную роль в исследованиях шистосомоза в 1950–1960-⁠х годах. Песчанки обладают уникальными характеристиками, которые позволяют использовать их в биомедицинских опытах, таких как исследования дерматитов, процессов старения, тревожно-⁠депрессивных расстройств, а также ряда других патологий [1].

Так, у песчанок отсутствует виллизиев круг — артериальный круг головного мозга, расположенный в основании головного мозга и обеспечивающий компенсацию недостаточности кровоснабжения за счет перетока из других сосудистых бассейнов, что позволяет использовать их в изучении церебральной ишемии или инсульта [2, 3].

Песчанки подходят для научных работ, связанных с паразитарными, бактериальными и вирусными агентами. Так, рассматриваемые животные используются для изучения эхинококкоза, гименолепидоза, свиного и бычьего цепня, гемонхоза, токсокароза, стронгилоидоза. Песчанки применяются для изучения всех аспектов жизненного цикла трематод (шистосомоз) и потенциальных методов лечения. Рассматриваемые животные являются хорошими тест-⁠системами для изучения криптоспоридиоза и лямблиоза [4], хеликобактериоза, поскольку у песчанок развиваются тяжелый гастрит и язва желудка. Монгольская песчанка — оптимальная тест-⁠система in vivo для моделирования листериоза, лептоспироза и боррелиоза [5–7].

Среди вирусных заболеваний, исследуемых на песчанках, можно отметить вирусы гепатита Е [9] и энцефалита [9, 10]. Новорожденные песчанки также могут быть экспериментально инфицированы реовирусом [4].

Рассматриваемые животные считаются перспективной моделью для изучения механизмов и лечения эпилепсии. У животных наблюдаются спонтанные, повторяющиеся генерализованные припадки, начинающиеся примерно в 6-⁠недельном возрасте, часто регистрируются судороги в ответ на внешние раздражители, к примеру, на струю сжатого воздуха, причем возникшие судороги могут иметь разную интенсивность и частоту. Примечательно, что у песчанок в первые недели моделирования патологии судороги могут и не возникнуть, но к 5–6-⁠й неделе процент животных с припадками значительно возрастает. Эпилептические припадки характеризуются клонико-⁠тоническими компонентами. Характер поведенческих припадков соответствует изменениям в записи электроэнцефалограммы. В целом имеющиеся данные литературы [11, 12] указывают, что модель песчанок интересна и может быть полезна для изучения механизмов, лежащих в основе «спонтанных» припадков.

Песчанка — это первая доклиническая модель, используемая для изучения гемохроматоза. При экспериментальном железоиндуцированном моделировании у песчанок гистопатологические поражения сердца и печени схожи с таковыми у человека [4].

Рассматриваемый вид лабораторных животных применяется для изучения обменных процессов, в частности липидов. У песчанок спонтанно возникают и моделируются такие состояния, как ожирение [13], гиперинсулинемия и сахарный диабет [14]. Песчанка была выбрана для создания моделей неалкогольной жировой болезни печени, ожирения и нарушения обмена веществ в печени посредством диеты с высоким содержанием жиров и холестерина [15]. Потребление диеты, богатой простыми жирами и углеводами, приводит к увеличению общей массы тела животного, массы печени и жировой ткани, уровня глюкозы, триглицеридов и концентрации TNF-⁠α в жировой ткани. У песчанок также наблюдается значительное увеличение общего содержания холестерина и триглицеридов в печени, что способствует более высокой интенсивности стеатоза печени. В моделях неалкогольной жировой болезни печени был обнаружен ряд общих черт с заболеванием у человека: избыточное накопление свободных жирных кислот, нарушение липидного обмена в крови, изменения формы и размера клеток печени, а также морфологии печени. Прогрессирование цирроза печени в связи с неалкогольной жировой болезнью у песчанок четко делится на стадии, что позволяет изучать прогрессирование заболевания. Результаты указывают на сильную положительную корреляцию между метаболизмом липидов и циррозом, который соответствует клиническому течению заболевания у человека. Таким образом, модель цирроза неалкогольной жировой болезни печени у песчанок может быть использована для изучения прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени, особенно стадии цирроза [16–18].

Песчанки рассматриваются как потенциальные модели для изучения диабета и его осложнений. Введение стрептозотоцина песчанкам вызывает нарушения обмена веществ — значительно повышается уровень глюкозы, холестерина и триглицеридов в плазме/⁠сыворотке, а также снижается содержание инсулина и гликогена. Регистрируется низкая концентрация липопротеинов высокой плотности, при этом содержание липопротеинов низкой плотности высокое. У песчанок наблюдаются повышенная активность антиоксидантных ферментов и уровень малонового диальдегида в тканях поджелудочной железы, определяется дегенеративное повреждение со снижением процентной площади β-⁠клеток поджелудочной железы [19].

Монгольские песчанки используются в исследованиях по изучению фармакологической активности и безопасности лекарственных средств. В отечественной литературе представлено ограниченное количество данных в отношении нормальных значений биохимических показателей.

Таким образом, цель данной работы — создание базы референтных интервалов биохимических показателей у нормальных здоровых половозрелых монгольских песчанок для дальнейшего использования в испытательном центре при проведении доклинических исследований и мероприятий по мониторингу здоровья данного вида.

Материал и методы

Все манипуляции проведены на базе АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ». Данные, используемые в эксперименте, получены от интактных животных в период с мая по июнь 2022 г. Исследование одобрено биоэтической комиссией. Всего в эксперимент было отобрано 40 животных — 20 самцов и 20 небеременных и нерожавших самок, без учета фазы эстрального цикла. Возраст монгольских песчанок находился в диапазоне 6–8 нед, масса — 50–70 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария — температура воздуха 22–26 °С, относительная влажность 40–75%, 12-⁠часовой световой день. Питание монгольских песчанок проводили в соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU¹. Исследование выполнено с соблюдением принципов надлежащей лабораторной практики. Все биохимические показатели определяли в идентичных общепринятых лабораторных условиях во избежание преаналитических и аналитических ошибок. Забор крови у животных производили путем пункции перикарда. Песчанок подвергали эвтаназии, применяя диоксид углерода (СО₂). Кровь собирали натощак в вакуумные пластиковые пробирки объемом 1 мл с активатором свертывания и гелем (ООО «КОРВЕЙ», Россия). Кровь центрифугировали 15 мин при 3000 оборотах в минуту (об/⁠мин) на центрифуге ОПн-⁠3.04 ДАСТАН (ОАО ТНК «Дастан», Киргизия), затем полученную сыворотку переносили в чистые стерильные кюветы, в которых непосредственно происходило измерение интересующих биохимических показателй на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-⁠25 (BioSystems, Испания). Используя соответствующие наборы (BioSystems, Испания), регистрировали такие показатели, как креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин и глюкоза. Рассчитывали количество глобулинов, а также соотношение альбумин/⁠глобулины. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов (АО «Вектор-⁠Бест-⁠Балтика», Россия). Постаналитические расчеты были проведены с использованием таких программ, как GraphPad Prism 9.0 (США) и Microsoft Excel 2010 (Microsoft, США). Статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки, вид распределения определяли, применяя критерий Шапиро–Уилка, парные сравнения между животными разного пола — U-⁠критерий Манна–Уитни и t-⁠критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

На первом этапе постаналитической работы были исключены так называемые жесткие и мягкие выбросы данных по методу, описанному ранее [20].

Данные о доле статистических выбросов по каждому показателю и выходящих за пределы референтных интервалов представлены в табл. 1.

Наибольшие статистические выбросы и отклонения среди биохимических показателей крови у самцов зарегистрированы в отношении креатинина — 10%, мочевины и холестерина — 5% (см. табл. 1). У самок наибольшие статистические отклонения зарегистрированы в отношении аланинаминотрансферазы — 10%, а также креатинина и триглицеридов — 5%. По всем остальным регистрируемым биохимическим показателям отклонений не выявлено.

В табл. 2 представлены результаты референтных интервалов биохимических показателей крови монгольских песчанок.

Полученные диапазоны значений у самцов и самок монгольских песчанок сопоставимы между собой по всем рассматриваемым показателям, статистической разницы не выявлено (см. табл. 2).

При сравнении полученных интервалов с референтными значениями, указанными в источниках литературы (табл. 3), показано, что в целом диапазоны рассматриваемых показателей как у самцов, так и самок схожи, но присутствуют и различия.

Так, диапазоны нормальных значений мочевины, общего белка и альбумина оказались уже, чем представленные в публикациях, а щелочной фосфатазы, холестерина, триглицеридов, наоборот, шире. Референтные интервалы аспартатаминотрансферазы и общего билирубина имели более низкий диапазон значений, чем рассмотренные значения в источниках литературы. Данные различия могут быть связаны с преаналитическими и аналитическими особенностями проведения анализа, породы животных и условий их содержания. Именно поэтому лучшим решением для всех доклинических центров является установление своих собственных референтных интервалов у лабораторных животных. В этом случае риск неверной интерпретации полученных данных в ходе доклинического эксперимента сводится к минимуму. Рассчитанные значения уровня креатинина, аланинаминотрансферазы и глюкозы у монгольских песчанок соответствуют аналогичным данным литературы.

Сопоставляя полученные референтные интервалы биохимических показателей крови у песчанок с таковыми человека (см. табл. 3), можно сделать вывод, что интервал значений креатинина у здоровых монгольских песчанок лежит в более низком диапазоне в сравнении с нормами, характерными для человека, при этом нормальные показатели мочевины и глюкозы рассматриваемого вида животных, наоборот, — в более высоком диапазоне. Референтный интервал аспартатаминотрансферазы монгольских песчанок значительно шире, чем аналогичный диапазон у человека. Нижние границы нормы аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы у песчанок соответствуют верхним границам нормы человека, интервалы данных показателей у рассмат­риваемых животных лежат в более высоких диапазонах значений относительно значений, характерных для человека. Верхняя граница нормального диапазона общего белка и альбумина соответствует нижней границе аналогичных показателей человека. Диапазоны нормы холестерина и общего билирубина у здоровых песчанок меньше таковых человека. Референтные интервалы уровня триглицеридов у песчанок и человека схожи между собой.

Референтные интервалы биохимических показателей крови являются важной составляющей в доклинических исследованиях и позволяют наблюдать в динамике за изменениями, происходящими с лабораторными животными в ходе биомедицинского эксперимента [29]. Данные нормы могут указать на поражение определенных органов или систем организма, тем самым исследователь может получить важную информацию о безопасности изучаемого вещества или судить об оценке моделируемого патологического состояния на лабораторном животном.

Оценка функции печени у песчанок, как и людей, определяется посредством таких ферментов, как аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза и общий билирубин. Наиболее часто в исследованиях анализируют изменения значений аланинаминотрансферазы. Щелочную фосфатазу целесообразно использовать в характеристике повреждения печени только у взрослых животных, так как у растущих особей она будет всегда выше нормы. Повышение уровня фермента щелочной фосфатазы чаще всего наблюдается при холестазе или вирусном гепатите. Как и у других видов млекопитающих, повышенный уровень общего билирубина указывает на холангит, холангиогепатит или другие состояния, лежащие в основе холестатических состояний. Уровень билирубина в крови повышается также при усиленном распаде гемоглобина. Помимо упомянутых показателей, желчные кислоты также могут служить полезным маркером хронического гепатита у песчанок [30]. Фермент аспартатаминотрансфераза выделяется из поврежденных клеток печени и мышц. В сочетании с повышением уровня других печеночных ферментов, таких как аланинаминотрансфераза, увеличенный уровень аспартатаминотрансферазы указывает на повреждение печени. Значения лактатдегидрогеназы и креатинкиназы повышаются у песчанок при сердечных патологиях. Креатинин, мочевина, общий белок и альбумин используются для оценки функции почек [31]. Также уровень данных показателей может указывать на изменения в возрастном тканевом катаболизме, желудочно-⁠кишечное кровотечение или повышенное содержание белка в пище. Снижение уровня общего белка и альбумина может служить показателем нефропатии с потерей белка у грызунов. Изменения значений мочевины начинаются только после того, как функция почек нарушена на 70%: уменьшение указывает на тяжелое заболевание печени, при котором аммиак не перерабатывается в мочевину. Креатинин является более чувствительным показателем скорости клубочковой фильтрации и функции почек. Песчанки с хронической нефропатией могут демонстрировать клиническую полиурию, полидипсию и потерю массы в результате снижения аппетита. Гипопротеинемия и гипоальбуминемия могут быть результатом потери белка, вызванной кровотечением, наличием паразитов или голоданием. Как правило, гипоальбуминемия возникает в результате снижения потребления белка, его всасывания или дисфункции поджелудочной железы (нарушение переваривания или мальабсорбция), а также снижения синтеза в печени, повышенной потери белка, вызванной желудочно-⁠кишечным заболеванием или заболеванием почек. Гипер­альбуминемия и сопутствующая гиперглобулинемия обычно указывают на обезвоживание. Низкий уровень общего белка свидетельствует об отеках и асците. Гиперглобулинемия говорит о хронической стимуляции иммунной системы. У песчанок значения альбумина и соотношение альбумин/⁠глобулины снижаются в связи с возрастом или беременностью [31, 32]. Показатели уровня глюкозы в крови песчанок очень чувствительны к обращению с животными и технике отбора биообразцов. Стресс повышает уровень глюкозы в крови. Регулярное контактирование, или хэндлинг, уменьшает этот эффект. Голодание снижает уровень глюкозы в крови. Циркадные эффекты влияют на уровень сахара в крови грызунов. Как было сказано ранее, многие грызуны склонны к диабету. Песчанки подвержены ожирению, у них могут развиться пониженная толерантность к глюкозе и сахарный диабет [21, 31]. Сыворотка крови песчанок часто липемична, особенно у старых животных, семена подсолнечника в рационе могут также способствовать этому. Кроме того, сыворотка крови песчанок становится липемичной при стандартном рационе с содержанием жира более 4%. Повышенный уровень холестерина вызывает ожирение печени у грызунов. Метаболизм холестерина у песчанок аналогичен таковому человека, поэтому этот вид используется для изучения влияния пищевого холестерина и жиров на организм. У песчанок, в рационе которых пища с высоким содержанием холестерина, часто образуются камни в желчном пузыре [21, 32].

В табл. 4 представлены рассматриваемые биохимические показатели в контексте их изменения при различных патологических состояниях.

Далее были рассчитаны коэффициенты вариации биохимических показателей крови песчанок. Сравнительные данные приведены в табл. 5.

Схожая вариабельность c человеком отмечена по таким показателям, как креатинин, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды и общий белок. Вариабельность таких биохимических показателей крови песчанок, как мочевина, альбумин, глюкоза и общий билирубин, оказались выше, чем у человека. Вариабельность значений аланинаминотрансферазы песчанок оказалась ниже, чем у человека. Данная информация может быть полезной при интерпретации полученных результатов в доклинических исследованиях и экстраполяции данных между двумя видами.

Заключение

Надлежащее проведение доклинических исследований по оценке фармакологической активности и безопасности лекарственных средств является ключевым этапом при принятии решения о стратегии дальнейшей разработки препарата и планировании его клинических исследований. Показатели, определяющиеся в ходе биометрических исследований, позволяют установить органы-⁠мишени токсического действия препарата, оценить динамику и обратимость эффектов, создать суждение о фармакодинамике, а также чрезвычайно важны при проведении мероприятий по мониторингу здоровья. При интерпретации данных важно учитывать не только контрольные показатели, а также сопоставлять результаты с референтными интервалами. Таким образом, представленные данные вариабельности биохимических показателей крови у песчанок будут способствовать повышению качества интерпретации результатов доклинических исследований и позволят точнее определить соотношение польза/⁠риск.