Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Токаев Т.К., Синицын М.В., Бикбаев А.С., Григорьев Т.Е., Загоскин Ю.Д., Штыхно А.О. Новые биосинтетические имплантаты для хирургического лечения туберкулеза легких. Лабораторные животные для научных исследований. 2023; 2. https://doi.org/10.57034/2618723X-2023-02-04
Проводилось экспериментальное испытание биосовместимых биодеградируемых высокопористых плевральных имплантатов для хирургического лечения деструктивного туберкулеза легких. Лабораторным животным имплантировали высокопористый биорезорбируемый материал на основе полилактида и поликапролактона. Изучали морфологическую картину имплантатов и местных тканей после интраплевральной имплантации через 7, 21, 54, 66 и 78 нед, животных выводили из эксперимента путем передозировки средств для наркоза. В качестве экспериментальных животных использовали половозрелых самок кроликов породы шиншилла, возраст к началу исследования 1–1,5 года, масса тела 3500–4300 г. При изучении морфологической картины имплантатов в течение длительного эксперимента наблюдали хорошую биосовместимость, что проявлялось отсутствием некроза в имплантатах и окружающих тканях. В имплантатах с течением времени формируется капсула, начиная с 7-й недели, протекают процессы васкуляризации, которые происходят в начале в поверхностных отделах с развития мелких сосудов капиллярного типа, в последующем наблюдается врастание сосудов в толщу имплантатов и формирование, помимо капилляров, тонкостенных сосудов синусоидного типа, а также и более крупных сосудов (артерий и вен). В прилежащих мягких тканях (легкое, плевра, мягкие ткани грудной стенки) в 1-м и 2-м имплантационном периодах реактивные изменения минимальные, проявляются в виде очагового фиброза мышечных волокон, очаговой мононуклеарной инфильтрации в фиброзной ткани в 1-м имплантационном периоде (7 нед), а также в виде слабовыраженной клеточной инфильтрации в отдельных полях зрения в прилежащих мягких тканях во 2-м периоде. При дальнейшем исследовании в 3, 4 и 5-м трансплантационных периодах перифокальных изменений не отмечено. Изучены морфологические изменения в имплантате и прилежащих тканях грудной стенки. Доказано, что высокопористый плевральный имплантат на основе полилактида и поликапролактона имеет хорошую биосовместимость и биобезопасность, является перспективным материалом для общей торакальной хирургии и хирургического лечения деструктивного распространенного туберкулеза легких.
В хирургии туберкулеза легких до сих пор не решена проблема коррекции объема плевральной полости или заполнения остаточных полостей больших объемов, возникающих в результате хирургических вмешательств, таких как комбинированные резекции легкого или экстраплевральный пневмолиз. Хирургические методы коррекции объема плевральной полости (различные виды торако-, торакомио-, диафрагмо-, оментопластика), применяемые до настоящего времени, травматичны, зачастую сопровождаются деформацией грудной клетки и выраженным послеоперационным болевым синдромом, что существенно снижает качество жизни пациента [1–4].
Используемые имплантируемые материалы природного происхождения (коллаген, коллагеновые губки, структурированный коллаген, фибриноген, желатин, гиалуроновая кислота и др.) характеризуются быстрыми сроками резорбции, недостаточными для проявления коллапсохирургического эффекта [5–10]. Биостабильные материалы синтетического происхождения (пенополиуретан, стеклопластик, полиметилметакрилат, полистирол, силикон и др.) вызывают различные осложнения воспалительного характера как в ранние, так и в отдаленные сроки наблюдения.
В настоящее время лучшими из существующих имплантируемых изделий для экстраплевральной имплантации являются грудные силиконовые имплантаты, хотя они и имеют определенные недостатки, характерные для биостабильных материалов, и не предназначены для плевральной имплантации [11–15].
Несмотря на удовлетворительные непосредственные результаты имплантации биостабильных имплантатов в интра- или экстраплевральную полость, большинство осложнений наблюдается в отдаленные сроки — через 10 лет и более [16–18].
Оптимальным вариантом решения этой проблемы является разработка так называемой биологической пломбы, то есть использование таких пломбировочных материалов, через которые могла бы в процессе биорезорбции прорастать собственная рыхлая соединительная ткань и за счет этого обеспечивать временный или длительный обратимый или необратимый коллапсохирургический эффект. Однако до настоящего времени не разработано таких объемных пломбировочных изделий, которые бы имели все необходимые физико-механические и биологические свойства.
Перспектива разработки необходимых материалов связана с применением технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Цель исследования — экспериментальное испытание биосовместимых биодеградируемых высокопористых плевральных имплантатов для хирургического лечения деструктивного туберкулеза легких.
В качестве имплантата применяли губчатые материалы на основе смеси полилактида (PLA марки «Nature Works» №4032D, США, со средневесовой молекулярной массой 200 кДа и индексом полидисперсности 2) и поликапролактона (PCL марки «SigmaAldrich» №440744, США, со среднечисловой молекулярной массой 80 кДа и индексом полидисперсности 2). В качестве экспериментальных животных использовали 5 половозрелых самок кроликов породы шиншилла, возраст к началу исследования 1–1,5 года, масса тела 3500–4300 г. Животных получали из питомника ООО «Кролинфо» (Россия), экспериментальную часть исследования проводили непосредственно в питомнике. В период адаптации и эксперимента кролики содержались по 1 особи в металлических клетках с пластиковым поддоном (pазмер клетки 73×73×52 см, площадь пола клетки 4200 см2 и более, высота 45 см и более для кроликов массой от 3 до 5 кг). Условия содержания животных соответствовали требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных1. Клетки были оборудованы кормушками из нержавеющей стали, пластиковыми поилками и держателями этикеток. Подстил не использовался. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 17–23 °C и относительной влажности 30–70%. В помещениях содержания животных поддерживался 12‑часовой цикл освещения. Исследование на лабораторных животных проводили в строгом соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики2, а также стандарта ГОСТа Р ИСО 10993‑2‑20093.
Для исследования имплантатов и местных реакций тканей in vivo, в максимально приближенных к клиническим условиям применения, использовали метод интраплевральной имплантации. Имплантируемые образцы представляли собой пористые материалы в виде диска размером 18×10 мм, который вводили интраплеврально животным. Плевральную имплантацию выполняли методом фиксации диска к внутренней поверхности грудной клетки, а именно к париетальной плевре, нерассасывающейся нитью — граница раздела имплантат/париетальная плевра. Сроки эксплантации — оценку состояния имплантата и местных реакций тканей осуществляли за 5 имплантационных периодов: 7, 21, 54, 66 и 78 нед; животных выводили из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза. На каждую точку эксплантации использовали по одному животному. Фрагменты ткани (имплантат с прилежащей частью легкого и грудной стенки) фиксировали в 10% забуференном формалине, проводку осуществляли в спиртах восходящей концентрации. Готовили парафиновые блоки, изготавливали срезы толщиной 2 мкм. Окраску проводили гематоксилином Майера и эозином, по Ван-Гизону, а также использовали дополнительную окраску по Браше.
Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом AXIO Imager A1 (ZEISS, Германия) с микрофотосъемкой на цифровую камеру CanonPowerShot A640. Сканированные изображения препаратов получали на цифровом сканере «NikonSuperCoolscan 8000 ED» (масштабная линия на сканах 1 мм). Кроме того, морфологическую картину имплантатов, ложа и окружающих тканей оценивали согласно ГОСТу ISO 10993‑6‑20114.
Помимо рутинного микроскопического исследования, проведены гистохимические исследования — окраску по Ван-Гизону использовали для выявления фиброзных структур в имплантатах (в том числе формирование и состояние фиброзной капсулы имплантатов), прилежащих тканях, то есть оценивали процессы организации. Коллагеновые волокна окрашивались в красный цвет, мышечная ткань, элементы кожи (за исключением, фиброзированных участков дермы) — в зеленовато-желтый цвет.
Результаты имплантации оценивали по морфологической картине в имплантатах и в местных тканях в различные сроки после интраплевральной имплантации.
В 1‑м имплантационном периоде к 7‑й неделе вокруг имплантатов сформирована тонкая фиброзная капсула, что подтверждено окраской по Ван-Гизону. Имплантаты полностью замещены гигантскими многоядерными клетками инородных тел. В гигантских многоядерных клетках типа инородных тел имеются признаки фагоцитоза материала имплантата в виде бесформенных полупрозрачных, бесцветных или очень слабо базофильных (местами с легким сероватым оттенком) масс (рис. 1).
Субкапсулярно сформированы сосуды капиллярного типа (рис. 2, а), в то время как к 2‑му имплантационному периоду сформированы более крупные сосуды синусоидного типа (рис. 2, б).
В толще имплантата выявлена слабовыраженная мелкоочаговая лимфоидная инфильтрация (рис. 3).
Во 2‑м имплантационном периоде (21 нед) гигантские клетки инородных тел расположены в толще имплантата несколько более плотно по сравнению с 1‑м имплантационным периодом. Это обусловлено некоторым уменьшением количества материала имплантата между гигантскими многоядерными клетками типа инородных тел. При этом фагоцитоз материала имплантатов сохраняется, в цитоплазме гигантских клеток инородных тел определяются частицы материала имплантата. Мелкоочаговая мононуклеарная инфильтрация лимфоидного характера, выраженная больше, чем в 1‑м имплантационном периоде, это проявляется большим количеством инфильтратов. На рис. 4 представлены скопления плазматических клеток в толще имплантата (рис. 4, а, б). Помимо капилляров, отмечаются сосуды синусоидного типа.
К 3‑му имплантационному периоду (54 нед) гигантские клетки инородных тел в имплантате расположены более плотно по сравнению с 1‑м и 2‑м имплантационными периодами (7 и 21 нед). Количество материала имплантата уменьшено по сравнению с 1‑м и 2‑м имплантационными периодами (7 и 21 нед соответственно) (рис. 5).
В 4‑м имплантационном периоде (66 нед) гигантские клетки инородных тел расположены несколько более плотно, чем в 3‑м, между гигантскими клетками инородных тел практически отсутствует материал имплантата (рис. 6). Между гигантскими клетками инородных тел располагаются одноядерные макрофаги.
В 5‑м имплантационном периоде (78 нед) плотность расположения гигантских клеток инородных тел более выражена, чем в 3‑м и 4‑м имплантационном периодах. Между гигантскими клетками инородных тел располагаются одноядерные макрофаги (рис. 7, а). Фиброз слабо выражен, мелкоочаговый или проявляется в виде тонких рыхлых отдельно расположенных коллагеновых волокон, что подтверждено окраской на соединительную ткань (рис. 7, б, в). В толще имплантатов сосуды капиллярного, синусоидного типа и единичные более крупные сосуды, артерии и вены.
Таким образом, морфологическая картина в имплантатах при интраплевральной имплантации показывает, что в течение эксперимента в имплантатах формируется капсула, происходит уменьшение количества материала имплантатов, особенно между гигантскими клетками инородных тел. Фагоцитоз материала имплантата гигантскими клетками инородных тел сохраняется, но с течением эксперимента также становится менее выраженным.
Васкуляризация имплантатов начинается с субкапсулярных поверхностных отделов с развитием мелких сосудов капиллярного типа, последующим врастанием сосудов в толщу имплантатов, формированием, помимо капилляров, более крупных тонкостенных сосудов синусоидного типа, а также и более крупных сосудов (артерий и вен).
Выраженность лимфоидной инфильтрации имплантатов незначительно колеблется при различных сроках имплантации, наблюдается небольшая плазмоцитарная реакция, интенсивность которой изменяется при различных сроках имплантации без четкой зависимости от срока имплантации.
Явления фиброза постепенно нарастают с увеличением срока имплантации и уже к 7-й неделе отмечается субтотальный фиброз образцов.
В прилежащем к имплантату участке париетальной плевры очаговая мононуклеарная инфильтрация с преобладанием клеток с эксцентрически расположенным ядром, которые более соответствуют плазматическим клеткам. Мышечная и жировая ткань без изменений (рис. 8, а).
В прилежащих мягких тканях очаговый фиброз, очаговая мононуклеарная инфильтрация в фиброзной ткани (макрофагально-плазмоцитарная). Слабовыраженный диффузный фиброз жировой клетчатки. Участок плевры с умеренно выраженной диффузной мононуклеарной инфильтрацией и преобладанием плазматических клеток (рис. 8, б).
Прилежащий к имплантату микроучасток фиброзной ткани с умеренно выраженной инфильтрацией, в инфильтрате мелкое скопление клеток с эксцентрически расположенным ядром (плазматические клетки). Фрагмент легкого с венозным полнокровием, небольшими дистелектазами, мелкоочаговой слабовыраженной лимфоидной инфильтрацией, признаков фиброзирования не найдено, что подтверждено окраской по Ван-Гизону. Сосуды и бронхи обычного строения, в стенке бронха очаговая фолликулоподобная инфильтрация. Плевра тонкая, интактная (рис. 9, а).
Прилежащие к имплантату мягкие ткани (поперечнополосатая мышечная ткань, жировая ткань) без изменений, легкое обычного строения (рис. 9, б), фрагмент костной ткани тоже, в межбалочном пространстве — красный костный мозг.
Прилежащие к имплантату мягкие ткани — поперечнополосатая мышечная ткань (рис. 10, а), жировая клетчатка с нервными волокнами и фиброзная ткань без изменений. Фрагмент легкого с небольшими дистелектазами (рис. 10, б). Мелкоочаговая скудная лимфоидная инфильтрация, при окраске по Браше в инфильтратах и межальвеолярных перегородках единичные плазматические клетки. Сосуды и бронхи обычного строения. Слабовыраженное венозное полнокровие. Плевра тонкая интактная, фиброз не выявлен, что подтверждено соответствующими гистологическими окрасками.
Фрагмент мягких тканей (поперечнополосатая мышечная, жировая клетчатка, фиброзная ткань) обычного строения. В одном фрагменте мышечной ткани небольшой очаговый отек. Фрагменты легкого с дистелектазами, преобладают ателектазы. Сосуды и бронхи обычного строения. Скудная мелкоочаговая лимфоидная инфильтрация. Умеренно выраженное венозное полнокровие. Париетальная плевра интактная (рис. 11, а). Висцеральная плевра тонкая интактная, без фиброза, в том числе в месте прилежания имплантата (окраска по Ван-Гизону) (рис. 11, б). В участке легкого, прилежащего к имплантату, очаговые умеренно выраженные реактивные изменения — в просвете альвеол макрофаги, десквамированный альвеолярный эпителий.
Прилежащие мягкие ткани (поперечнополосатая мышечная ткань, жировая с нервными волокнами, фиброзная ткань) обычного строения, мелкий участок фиброза (окраска по Ван-Гизону), в одном из сосудов признаки слабовыраженного продуктивного васкулита (очаговая мононуклеарная инфильтрация, при окраске по Браше плазматических клеток не найдено) (рис. 12, б). Легкое обычного строения, очень мелкие дистелектазы (рис. 12, а). Мелкоочаговая скудная лимфоидная инфильтрация, фолликулоподобные структуры в стенке мелких бронхов. Периваскулярно слабовыраженный отек. Плевра тонкая интактная.
При морфологическом исследовании реакции местных тканей на интраплевральную имплантацию реактивные изменения местных тканей минимальные.
В 1‑м имплантационном периоде (7 нед) в прилежащих к имплантатам мягких тканях очаговый фиброз мышечных волокон, очаговая мононуклеарная инфильтрация в фиброзной ткани (макрофагально-плазмоцитарная). В прилежащей плевре мелкоочаговая плазматическая реакция.
Во 2‑м имплантационном периоде в прилежащих мягких тканях слабовыраженная клеточная инфильтрация в отдельных полях зрения.
В 3, 4 и 5‑м имплантационных периодах прилежащее к имплантатам легкое, плевра, мягкие ткани (поперечнополосатая мышечная ткань, жировая ткань) без патологических изменений.
Экспериментальное исследование, проведенное на кроликах, показало высокую биосовместимость и биобезопасность высокопористого плеврального имплантата на основе полилактида и поликапролактона. Морфологическая картина в имплантатах при интраплевральной имплантации показывает, что в течение эксперимента в имплантатах протекают процессы фиброзирования, происходит уменьшение количества материала имплантатов особенно между гигантскими клетками инородных тел. Фагоцитоз материала имплантата гигантскими клетками инородных тел сохраняется, но с течением эксперимента также становится менее выраженным. Явления фиброза постепенно нарастают с увеличением срока имплантации, и уже к 7‑й неделе отмечается субтотальный фиброз образцов. Васкуляризация имплантатов начинается с субкапсулярных поверхностных отделов и развития мелких сосудов капиллярного типа, с последующим врастанием сосудов в толщу имплантатов, формированием, помимо капилляров, тонкостенных сосудов синусоидного типа, а также и более крупных сосудов — артерий и вен. В прилежащих мягких тканях минимальные реактивные изменения наблюдаются в 1‑м и 2‑м имплантационном периодах. При дальнейшем исследовании перифокальных изменений не отмечено.
На основании полученных данных высокопористый плевральный имплантат на основе полилактида и поликапролактона является перспективным материалом для хирургического лечения туберкулеза легких.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Все авторы принимали активное участие в обсуждении результатов и написании текста статьи.