Апробация метода биоимпедансометрии как инструмента прижизненной динамической оценки состава тела лабораторных животных

Н.В. Демакова, младший научный сотрудник Центра экспериментальной фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0002-2145-9289
М.В. Краснова,  младший научный сотрудник Центра экспериментальной фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0001-8138-6408
Г.А. Плиско, младший научный сотрудник Центра экспериментальной фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0003-0869-3430
Е.Д. Семивеличенко, младший научный сотрудник Центра экспериментальной фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0002-8464-7711
Д.Ю. Ивкин, доцент, канд. биол. наук, начальник Центра экспериментальной фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0001-9273-6864
С.В. Оковитый, профессор, доктор мед. наук, заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии СПХФУ, ORCID: 0000-0003-4294-5531

Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет,
Российская Федерация, 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф.Попова, д. 14 

Е-mail: demakova.natalya@pharminnotech.com

Резюме

В доклинической практике используются такие методы оценки состава тела лабораторных животных, как компьютерная томография, количественный магнитный резонанс, двуэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия, гравиметрический метод, метод биоимпедансометрической (БИМ) спектроскопии. Эти методы имеют ряд достоинств и недостатков. Наиболее спорным с точки зрения эффективности является гравиметрический метод, требующий посмертного вскрытия животного с выделением всего пула жировой ткани. Когда необходимо измерить массовую долю жира в нескольких точках исследования, требуется кратное количеству точек увеличение числа подопытных животных, что входит в противоречие c биоэтическим принципом Reduction.

Цель настоящей статьи – оценить возможности метода БИМ в доклинических исследованиях, в том числе требующих выполнения экспериментов с использованием моделей алиментарных нарушений. Проведено экспериментальное моделирование алиментарного ожирения у лабораторных животных (крысы самцы породы Brown Norway) с дальнейшей сравнительной оценкой с помощью БИМ следующих показателей: общее содержание воды в организме, объем внутри- и внеклеточной жидкости, масса тела без жира, масса жира (в том числе через массовую долю), индекс массы тела. Параллельно указана общая масса животных, полученная путем их взвешивания. В эксперименте использован биоимпедансометр ImpediVet BIS1 (США), имеющий 4 электрода, оснащенных иглами для введения в область носа, между ушей, в основание хвоста и копчиковой зоны. БИМ-измерения проводили на наркотизированных животных. Результаты собственного эксперимента, а также данные источников литературы позволяют рекомендовать метод БИМ как воспроизводимый, он хорошо зарекомендовал себя в испытаниях на грызунах. Хочется отметить, что возможности и метода, и прибора позволяют проводить измерения на крупных лабораторных животных, таких как собаки, свиньи, обезьяны, лошади и крупный рогатый скот. Метод малоинвазивен, что отвечает биоэтическим принципам 3R, в том числе в части, касающейся принципа Refinement (усовершенствование технологии работы с лабораторными животными).

Введение

Ожирение – патологическое состояние хронического характера, характеризующееся избыточными жировыми отложениями в подкожной клетчатке, органах и тканях и прогрессирующее при естественном течении. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, в 2016 г. более 1,9 млрд взрослых старше 18 лет имели избыточную массу тела, из них более 650 млн страдали ожирением. В России, по данным на конец 2016 г., зарегистрированы 23,5 млн лиц с ожирением [1]. Именно поэтому данная патология и ассоциированные с ней метаболические нарушения являются актуальной проблемой медицины на сегодняшний день.

При исследовании алиментарного ожирения необходимо точное измерение композиционного состава тела. Несмотря на то, что количественный магнитный резонанс и двуэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия были признаны эффективными для определения композиционного состава тела, проведение их требуют крупногабаритного и дорогостоящего оборудования [2]. Метод биоимпедансометрической (БИМ) спектроскопии позволяет измерить общее количество воды в организме, массу тела без жира и массу жира, при этом имеет небольшую стоимость относительно других методов анализа, достаточно прост и не требует инвазивного вмешательства. Данный метод основан на пропускании переменного электрического тока с разной частотой сквозь тело для определения импеданса (сопротивление участков тела переменному току), который прямо пропорционален длине и обратно – поперечному сечению тела, а также напрямую связан с компонентным (композиционным) составом тела, через которое проходит ток.

У мелких лабораторных животных с помощью БИМ можно определить долю вне- и внутриклеточной жидкости, массу тела без жира и массу жира при использовании диапазона частот (4–1000 кГц) в зависимости от массы тела животного и коэффициентов сопротивления, определенных для животных каждого вида [3]. Вычисленная фракция воды позволяет оценить композиционный состав тела. Низкочастотный ток проходит через внеклеточную жидкость, в то время как реактивное сопротивление клеточной мембраны не позволяет току низкой частоты проходить через нее, высокочастотный ток проникает через клеточные мембраны, а также через внеклеточную жидкость и клетки (мембраны и внутриклеточную жидкость). Подсчет массы жира и безжировой массы основан на разнице водного состава мышечной массы и жировой ткани [4].

Цель работы – оценить возможности метода БИМ в доклинических исследованиях, в том числе требующих проведения экспериментов с использованием моделей алиментарных нарушений.

Материал и методы

В качестве тест-системы использованы крысы-самцы линии Brown Norway с начальной массой 217 ± 6 г (M ± SED), возраст 3 мес. Животных содержали по 5 особей в прозрачных поликарбонатных клетках для грызунов с подстилом в виде натурального гранулята стержневой части початков кукурузы Рехофикс (ООО «Реттенмайер Рус», Россия). Замену подстила проводили 1 раз в неделю. Клетки располагались в стеллажах, к которым подключено вентиляционно-приточное устройство Био.В.С. Vent II (Bioscape (EHRET), Германия). Клетки меняли 1 раз в неделю. Питьевую воду подавали ad libitum в стандартных питьевых бутылочках с полной заменой воды 2 раза в неделю. Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 20–26°C и относительной влажности 30–70%. В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения и осуществлялась по крайней мере 10-кратная смена объема воздуха комнаты в час.

Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, применяемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и протоколом биоэтической комиссии СПХФУ №Rat-AO(BI)-2020 от 10.02.2020. 

Для моделирования алиментарного ожирения была использована гиперкалорийная высокожировая диета с избытком легкоусвояемых углеводов, которая воссоздавалась путем добавления к стандартному корму (63%) топленого свиного жира (19%), сахарозы (10%) и изолированного соевого белка (8%) [5]. Такая диета способствует развитию у животных стеатоза печени, дисгликемии, дислипидемии, инсулинорезистентности и ожирения. Крысы были рандомизированы на 2 экспериментальные группы: 1-я группа – контрольная, получавшая стандартный гранулированный корм «Полнорационный экструдированный комбикорм ПК-120 для лабораторных животных (крыс, мышей)», производство ООО «Лабораторкорм» (Россия) ad libitum в кормовое углубление клетки (n=10); 2-я группа – крысы, получавшие гиперкалорийный корм ad libitum (n=17).

Через 3 мес использования гиперкалорийной диеты было проанализировано изменение массы тела животных с помощью весов лабораторных электронных II класса точности CE-4202C (Sartorius, Германия) и с использованием БИМ с помощью спектроскопического импедансометра (ImpediVet BIS1, США), принадлежащего центру коллективного пользования Санкт-Петербургского химико-фармацевтического университета, определены общее содержание воды в организме (TBW, %), объем внутри- и межклеточной жидкости (ECF, %; ICF, %), масса тела без жира (FFM, %), масса жира (FM, %) и индекс массы тела (BMI). Прибор имеет 4 электрода, оснащенных иглами для введения в область носа, между ушей, в основание хвоста и копчиковой зоны. Животные были наркотизированы сочетанием золетила (25 мг/кг) с ксилазином (10 мг/кг) и помещены на нагреваемую платформу для поддержания температуры тела. Выполняли 3 последовательных измерения с интервалом в 3 с при заданных параметрах: пропорция тела (отношение длины к обхвату) 1,0, плотность тела 1,05 г/см3, константа гидратации 0,732, коэффициенты сопротивления ρi = 325; ρe = 752. Данные параметры являются константами, приуроченными к виду лабораторного животного, и используются прибором по умолчанию.

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета программы GraphPad Prism 8 с применением непараметрического статистического критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

В результате исследования установлено, что прирост массы тела в течение 3 мес на обычном корме составил 26,73%, на гиперкалорийном – 56,68%. Таким образом, крысы, получавшие гиперкалорийную диету, весили на 23,64% больше, чем животные на стандартном корме (рис. 1A). При этом содержание жировой ткани в организме животных обеих групп отличалось более чем в 2 раза: 15,98 ± 3,25 г у крыс на стандартном корме и 35,32 ± 1,75 г (р=0,0003) у крыс на высокожировой диете соответственно (рис. 2).

 <strong>Рис. 1.</strong> (A) Общая масса тела животных в конечной точке исследования, г, р=0,0159. Примечание. Здесь и далее, СК – стандартный корм, ГК – гиперкалорийный корм. (B) ИМТ животных, г/см<sup>2</sup>, р=0,0039
Рис. 1. (A) Общая масса тела животных в конечной точке исследования, г, р=0,0159. Примечание. Здесь и далее, СК – стандартный корм, ГК – гиперкалорийный корм. (B) ИМТ животных, г/см2, р=0,0039

 <strong>Рис. 2.</strong> Конечные значения процентного содержания жира животных, %, р=0,0159
Рис. 2. Конечные значения процентного содержания жира животных, %, р=0,0159

У животных, получавших стандартный корм, масса тела без жира оказалась в 1,3 раза больше, чем у получавших ги- перкалорийный корм, – 84,02 ± 3,25 и 64,68 ± 4,02% (р=0,0003) соответственно (рис. 3). Также обнаружено более низкое содержание общей воды в теле крыс с ожирением (49,58 ± 1,28%; р=0,0004) в сравнении с животными, получавшими стандарт- ный корм (61,32 ± 2,45%) (рис. 4A). При этом показатель внеклеточной воды у крыс с избыточной массой тела был больше, чем у животных на стан- дартном корме: 49,04 ±0,63 (р=0,0283) и 46,10 ± 0,83 соответственно (см. рис. 4B).

 <strong>Рис. 3.</strong> Масса тела без жира, %, р=0,0003
Рис. 3. Масса тела без жира, %, р=0,0003

Обратная ситуация наблюдалась с показателем внутриклеточной жидкости. У группы животных, получавших стандартный корм, этот показатель был выше (53,90 ± 0,81), чем у крыс на гиперкалорийной диете (50,96 ± 0,71; р=0,0283) (см. рис. 4C).

Индекс массы тела животных, получавших стандартный корм, составил 8,631 ± 0,3404, а у животных на гиперкалорийном корме – 10,08 ± 0,2734 (р=0,0039) (рис. 1B).

С помощью анализа данных БИМ удалось установить отличия в композиционном составе тела крыс, получавших гиперкалорийную диету и стандартный корм. Метод нетрудозатратный, а также воспроизводимый в динамике, что важно для исследователя при моделировании алиментарного ожирения in vivo.

В исследовании I.V. Trushkina и соавт. [6], посвященном оценке структуры тела у пациентов с различной степенью избытка массы тела, выявлено, что развитие ожирения происходило за счет увеличения массы жировых и безжировых тканей в отношении 10:2, сопровождалось снижением относительной массы метаболически активных тканей, формированием относительного обезвоживания с преобладанием внеклеточного типа при высокой степени ожирения. В исследовании установлена прямая значимая связь между избытком массы тела и абсолютной массой жира. Кроме того, возрастала абсолютная масса мышц. Однако при этом существует отрицательная направленность связи между избытком массы и мышечной массой, выраженной в процентах от массы тела. Это свидетельствует о том, что в большей степени нарастание массы тела происходит за счет увеличения массы жира и в меньшей – мышечной массы.

 <strong>Рис. 4.</strong> A – общее содержание воды в организме, %  (р=0,0004); B – содержание внеклеточной жидкости, % (р=0,0283); C – содержание внутриклеточной жидкости в организме, % (р=0,0283)
Рис. 4. A – общее содержание воды в организме, %  (р=0,0004); B – содержание внеклеточной жидкости, % (р=0,0283); C – содержание внутриклеточной жидкости в организме, % (р=0,0283)

Также при ожирении отмечались снижение активной клеточной массы и тенденция к ее снижению при прогрессировании ожирения. Абсолютное количество сухой клеточной массы прогрессивно увеличивалось по мере роста массы тела, в то время как относительная ее масса значимо уменьшалась. По мере прогрессирования ожирения наблюдалось выраженное снижение относительного количества общей воды в организме. Установлено, что в группе контроля и при небольшом избытке массы тела  преобладало обезвоживание внутриклеточного типа, в то время как при увеличении степени ожирения наблюдалось повышение частоты встречаемости внеклеточного типа обезвоживания [6].

По результатам проведенного исследования наблюдалось увеличение массы жира животных, получавших гиперкалорийную диету, и как следствие увеличивалась масса тела животных. Таким образом, как и в случае с пациентами с избыточной массой тела, выявлена прямая связь между избытком массы тела и абсолютной массой жира. В исследовании K. Rutter и соавт. [7] при изучении композиционного состава тела крыс линии Wistar с помощью БИМ был получен аналогичный результат. Масса тела и ежедневный прирост массы тела животных, получавших гиперкалорийную диету, были значительно больше – 719,9±36,4 и 3,23±0,39 в день, чем у тех, кто получал стандартный корм, – 604,6 ± 12,6  и  2,1 ±0,26 в день соответственно (р<0,01). Разница в массе была обусловлена большим накоплением жира животными на высокожировой диете. При сравнении биоимпедансометрического анализа, выполненного с помощью спектроскопического импедансометра ImpediVet™ BIS на крысах-самцах линии Осборн–Мендель, с химическим анализом тканей после эвтаназии животного установлено, что  данные методы достаточно сопоставимы. Однако возможно занижение FFM (−50,69 г, −15,5%; p<0,001), а также завышение FM (+65,75 г, +63,5%; p<0,001) [6].

У животных на гиперкалорийной диете снижалась безжировая масса тела. Подобная тенденция наблюдалась и у пациентов с избыточной массой тела: значимо уменьшались относительное количество сухой клеточной массы, а также показатель мышечной массы относительно общей массы тела [6].

В проведенном эксперименте у животных, получавших гиперкалорийный корм, снижалость общее количество воды в организме. Аналогично у пациентов с избыточной массой тела происходило выраженное снижение показателя общей воды в организме по мере прогрессирования ожирения. Мы наблюдали выраженное снижение показателя ICF(%) и повышение ECF(%) у крыс с избыточной массой тела, т.е. склонность к внутриклеточному типу обезвоживания. В то время как у пациентов развитие того или иного типа обезвоживания зависело от выраженности заболевания. Однако в исследовании K. Rutter и соавт. [7] существенных различий в содержании общей воды в организме и внеклеточной жидкости у животных двух разных групп не отмечалось. Показатель внутриклеточной жидкости не был определен. В исследовании D. Smith и соавт. [8]  при сравнении БИА с химическим анализом тканей после эвтаназии животного установлено,  что возможно занижение значений TBW (−31,07 г, −13,3%; p<0,001).

При исследовании влияния высокожировой и высокосахарозной диет на композиционный состав тела крыс методом БИА и антропометрии L.R. Angéloco и соавт. [9] определили, что измерение окружности живота и ИМТ достоверно коррелирует с составом тела. Анализ композиционного состава тела проводился с использованием тетраполярного биоэлектрического импедансного анализатора Byodinamics BIA 310E. С помощью прибора определяли общее сопротивление тела (WBR) и реактивное сопротивление (WBXc). На основании полученного показателя сопротивления тела проводили расчет общей воды в организме по формуле WTBW = 15,47 + 97,44 L2/ WBR, где L – длина тела от ноздрей до основания хвоста (см) и WBR – общее сопротивление организма (Ω). ИМТ определяли путем деления показателя массы тела животного (г) на показатель длины тела в квадрате (см). Однако  в данном исследовании корелляции между содержанием жира, определенного химическим анализом после эвтаназии, и общим сопротивлением тела не обнаружено. Кроме того, наблюдалась отрицательная корелляция данного показателя  (p<0,05) с реактивным сопротивлением (r= –0,51) [9].

Стоит отметить, что импедансометрия с помощью спектроскопического импедансометра ImpediVet BIS1 в отличие от биоэлектрического импедансного анализатора Byodinamics BIA 310E позволяет измерить не только TBW, BMI, FFM, FM, но и ECW, ICW.   

Заключение

Развитие ожирения характеризуется увеличением массы тела и жира, ИМТ, снижением безжировой массы относительно общей массы тела, развитием обезвоживания по внутри- или внеклеточному типу.

Метод импедансометрии является информативным и отвечает целям и задачам, преследуемым исследователем при моделировании алиментарного ожирения, кроме того, представляет собой отличную альтернативу другим методам анализа, будучи воспроизводимым в динамике, менее трудозатратным и дорогостоящим. Помимо всего, метод малоинвазивен, что отвечает биоэтическим принципам 3R, в том числе в части, касающейся принципа Refinement (усовершенствование технологии работы с лабораторными животными), требует меньших затрат животных в сравнении с гравиметрическим методом в случае необходимости снятия показателей в динамике, что соответствует реализации принципа Reduction.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Н.В. Демакова – подготовка и участие в выполнении эксперимента, апробация метода биоимпедансометрии, анализ данных, написание статьи, перевод соответствующих частей статьи на английский, приведение в соответствии с требованиями журнала.

М.В. Краснова – участие в выполнении эксперимента, обработка первичных данных.

Г.А. Плиско – участие в выполнении эксперимента, уход за животными, подготовка гиперкалорийного корма.

Е.Д. Семивеличенко – участие в выполнении эксперимента, уход за животными, подготовка гиперкалорийного корма.

Д.Ю. Ивкин – работа с источниками литературы, обобщение материала, написание статьи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

С.В. Оковитый – работа с источниками литературы, обобщение материала, редактирование текста, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

Сведения о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Шестакова М.В., Трошина Е.А., Мазурина Н.В., Шестакова Е.А., Яшков Ю.И., Неймарк А.Е. и соавт. Лечение морбидного ожирения у взрослых. // Ожирение и метаболизм. – 2018. – Т.15. – №. 1. – С.53-70. [Dedov I.I., Mel'nichenko G.A., Shestakova M.V., Troshina E.A., Mazurina N.V., Shestakova E.A., Yashkov Yu.I., Neimark A.E. et al. Lechenie morbidnogo ozhireniya u vzroslykh. // Ozhirenie i metabolism. – 2018. – Vol.15. – №. 1. – P.53-70. (In Russ.)].
  2. Metzinger M.N., Miramontes B., Zhou P., Liu Y., Chapman S., Sun L. Correlation of X-ray computed tomography with quantitative nuclear magnetic resonance methods for pre-clinical measurement of adipose and lean tissues in living mice // Sensors (Basel). – 2014. – Vol. 14. – P. 18526-18542. doi: 10.3390/s141018526.
  3. ImpediVet Rodent Measurement Guide. – URL.: http://impedimed.com/wp content/uploads/2019/06/Rodent_Measurement_Guide_Rev_A.pdf (дата обращения, 01.2021 г.).
  4. Bera T.K. Bioelectrical Impedance Methods for Noninvasive Health Monitoring: A Review // Journal of medical engineering. – 2014. – 381251. https://doi.org/10.1155/2014/381251.
  5. Xu X, Lu L, Dong Q et al. Relationship between non-alcoholic fatty liver disease and periodontal disease and atherosclerosis // Lipids Health Dis. – 2015. – Vol. 3 (14). – P. 158.
  6. Трушкина, И.В., Филиппов, Г.П., Леонтьева, И.В. Оценка структуры тела у пациентов с различной степенью избытка веса // Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. – 2010. – Т.25(3-1). – С.38-44. [Trushkina I. V., Filippov G. P., Leont'eva I. V. Otsenka struktury tela u patsientov s razlichnoi stepen'yu izbytka vesa // Sibirskii zhurnal klinicheskoi i eksperimental'noi meditsin. – 2010. – Vol.25 (3-1). – P.38-44. (In Russ.)].
  7. Rutter, K., Hennoste, L., Ward, L. C., Cornish, B. H., Thomas, B. J. (1998). Bioelectrical impedance analysis for the estimation of body composition in rats // Laboratory animals. – 1998. – Vol.32 (1). – P.65-71. https://doi.org/10.1258/002367798780559356
  8. Smith D., Johnson M, Nagy T. Precision and accuracy of bioimpedance spectroscopy for determination of in vivo body composition in rats // Int J Body Compos Res. – 2009. – Vol. 7(1). – P. 21‐26
  9. Angéloco L.R., Deminice R., Leme I.D., Lataro, R.C., Jordão A. Bioelectrical impedance analysis and anthropometry for the determination of body composition in rats: effects of high-fat and high-sucrose diets // Revista De Nutricao-brazilian Journal of Nutrition. – 2012. – Vol. 25. – P.331-339.

Вас может заинтересовать