Зуева А.А., Кательникова А.Е. , Гущин Я.А. , Макарова М.Н. Апробация метода индукции гипертрофических рубцов у кроликов с разработкой планиметрической шкалы оценки повреждения. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-04-01
В настоящем исследовании проводили моделирование гипертрофических рубцов на внутренней стороне ушной раковины самок кроликов посредством локального удаления слоев кожи и перихондрия с периодом формирования 17 дней. Экспериментальных животных разделили на 2 группы – 1-ю (контрольную), которую составили животные с патологией, не получавшие лечения, и 2-ю, в которой использовали глюкокортикостероидное лекарственное средство Дипроспан® (Shering-Plough Labo N.V., Франция), которое вводили в дозе 0,33 мг/животное в толщу рубцовой ткани. Для оценки формирования патологии и терапевтического действия препарата проведено гистологическое исследование рубцовой ткани и морфометрическое измерение на 27-й и 37-й день исследования, был рассчитан индекс толщины рубцовой ткани (SEI). Для оценки состояния рубцов и эффективности препарата разработана балльная система, адаптированная для животных, при которой рассматривали приподнятость, поверхность, контур, консистенцию и цвет рубца.
В результате исследования у животных 1-й группы наблюдали изменения в кожных покровах, соответствующие данным литературы: рубцы имели эритематозный вид, который к концу исследования стал слабо выраженным, приподнятость и выраженный контур. Общая планиметрическая оценка гипертрофических рубцов данных животных составила 6,5–7 баллов, а в конце исследования снизилась до 4,5 балла. На протяжении исследования регистрировали увеличение SEI, на микроскопическом уровне наблюдали большое количество беспорядочно расположенных коллагеновых волокон, умеренную воспалительную инфильтрацию, значительное число фибробластов.
Данные, полученные в результате применения препарата Дипроспан® в исследуемой дозе, свидетельствуют о полной косметологической коррекции гипертрофических рубцов на ушной раковине кроликов: статистически значимое снижение общего планиметрического балла до 0 и SEI; в толще рубцовой ткани наблюдали сниженное количество фибробластов и коллагеновых волокон, расположенных компактно и линейно. Полученные результаты терапии рубцов являются схожими с клиническим эффектом комплексной стратегии лечения таковых у людей: к концу исследования рубцы у животных имели признаки нормотрофии как при макроскопическом, так и при микроскопическом исследовании.
Повреждение глубоких слоев кожи приводит к образованию патологических рубцов: атрофических (гипотрофических), келоидных и гипертрофических. Такие рубцы имеют неэстетичный вид, оказывают негативное воздействие на социальные аспекты жизни или могут повлиять на психическое здоровье человека. В связи с этим проблема коррекции процесса заживления глубоких ран имеет медико-социальный статус и затрагивает несколько направлений – дерматологию, косметологию, комбустиологию, хирургию, реабилитационную медицину, психологию и др. [1–4].
Формирование гипертрофических рубцов обусловлено неблагоприятными условиями заживления раны [5, 6] в результате продолжительной гиперплазии фибробластов и избыточного образования коллагена, что приводит к нарастанию толщины ткани над поверхностью здоровой без изменения размеров изначальной площади раны [4–6]. Внешний вид гипертрофических рубцов не является эстетически приемлемым, поэтому разработка и методы тестирования новых лекарственных препаратов для коррекции рубцевания или устранения неэстетических дефектов являются актуальной задачей для улучшения качества жизни человека.
Для изучения процесса заживления ран и испытания новых лекарственных препаратов проводят клинические, in vivo и in vitro исследования. По сравнению с клиническими испытаниями исследования in vivo с моделированием патологии на животных обладают большей экономической доступностью. Впервые модель гипертрофических рубцов на внутренней стороне ушной раковины кроликов описана D.E. Morris и соавт. [7] в 1997 г., они заметили, что после 40 дней моделирования кожной язвы у животных на внутренней стороне уха сохранились визуально идентифицируемые, утолщенные шрамы. По данным литературы [8], процесс формирования гипертрофических рубцов у кроликов сходен с таковым у человека.
Цель настоящей работы – апробация модели формирования гипертрофических рубцов с разработкой планиметрической шкалы оценки повреждения на внутренней стороне ушной раковины самок кроликов с использованием кортикостероидного лекарственного средства Дипроспан® (Shering-Plough Labo N.V., Франция) в качестве кандидата в препараты позитивного контроля.
В качестве позитивного контроля выбран препарат Дипроспан® (МНН: бетаметазон, производство Shering-Plough Labo N.V., Франция, серия S021261). Препарат Дипроспан® является синтетическим глюкокортикостероидом, оказывает противовоспалительное, противоаллергическое и иммунодепрессивное действие, а также оказывает выраженное влияние на различные виды обмена веществ. Тормозит соединительнотканные реакции в ходе воспалительного процесса и снижает возможность образования рубцовой ткани [9]. Препарат применяют при лечении келоидных рубцов. В связи с тем, что гипертрофические и келоидные рубцы имеют схожие механизмы образования, Дипроспан® выбран в качестве кандидата позитивного контроля.
Для проведения исследования сформированы 2 группы по 8 самок кроликов породы Белый великан (КФХ «Нера», Россия): 1-я (контрольная), которую составили животные с патологией, не получавшие лечения, и 2-я, в которой использовали глюкокортикостероидное лекарственное средство Дипроспан® (Shering-Plough Labo N.V., Франция) в дозе 0,33 мг/животное на фоне патологии.
Масса тела животных к началу эксперимента составляла 2155–3400 г, возраст — 14–15 нед. Самки не были беременными или рожавшими. Экспериментальных животных содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях [10]. Световой режим составил 12 ч света и 12 ч темноты.
Перед моделированием экспериментальной патологии проводили процедуру анестезии животных с помощью внутривенного введения в краевую вену ушной раковины ветеринарных препаратов Золетил®100 (Virbac, Франция) и Ксила (Interchemie, Нидерланды) в дозах 2,5 и 1 мг/кг соответственно.
После наступления глубокого наркоза животное фиксировали на операционном столе в положении лежа на спине. На внутренней стороне каждой ушной раковины самок кроликов вырезали по 2 круглые несквозные раны с помощью скальпеля и трафарета диаметром 6 мм (всего сформировано 4 раны у каждого кролика), тщательно удаляли эпидермис, дерму и перихондрий (рис. 1).
На протяжении 3 дней животным внутримышечно вводили лекарственный препарат Кеторол® (Д-р Редди’с Лабораторис Лтд., Индия, серия: А8331) в дозе 3 мг/кг 2 раза в день для обеспечения анальгезии в послеоперационный период. На протяжении периода формирования модельной патологии проводили наблюдение за ранами, для предупреждения их инфицирования промывали антисептическим 0,05% водным раствором хлоргексидина биглюконата (ОАО «Самарамедпром», Россия) с последующим наложением стерильных повязок [9–16]. После индукции патологии животные находились в защитных пластиковых воротниках. Через 1 нед после операции у экспериментальных кроликов отмечали признаки стресса – снижение массы тела и угнетение поведения. В связи с этим было принято решение о снятии воротников с сохранением повязок до затягивания ран. После этого у кроликов регистрировали физиологический прирост в массе тела и нормальное поведение. По результатам ежедневных осмотров формирование рубца с полной реэпителизацией раны было зафиксировано на 17-й день эксперимента. Далее с 17-го по 36-й день эксперимента (20 дней) животным 2-й группы (патология + лечение) вводили Дипроспан® в толщу рубца в дозе 0,33 мг/животное, что составляло 13 мкл/рубец. Согласно инструкции по медицинскому применению при лечении гипертрофических рубцов, курс введения препарата Дипроспан® состоит из 3 введений с интервалом в 2 нед между инъекциями [9]. В настоящем исследовании на протяжении 20 дней препарат позитивного контроля вводили 3 раза: на 17, 24 и 31-й день эксперимента.
На протяжении всего эксперимента ежедневно проводили фотографирование рубцов. Разработана балльная шкала для оценки гипертрофического рубца по планиметрическим критериям [8, 11–17], представленным в таблице.
Далее баллы суммировали для получения общего числа. При сумме баллов от 5 до 7 регистрировали такие признаки рубца, как приподнятость, шероховатая поверхность, выраженный контур, плотная поверхность, цвет рубца от светло-розового до розово-красного свидетельствовал о сформированном рубце. Сумма баллов от 3 до 4 – формирование рубца, от 0 до 2 – отсутствие патологии.
Для оценки процесса формирования рубца и заживления на фоне введения препарата Дипроспан® на 27-й и 37-й день эксперимента проводили эвтаназию 4 самок из каждой группы путем передозировки анестетика с последующим обескровливанием полостей сердца в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Советом Европейского Союза от 22.09.10 по охране животных, используемых в научных целях [10]. Для гистологического исследования образцы рубцовых и здоровых тканей ушной раковины фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после чего по общепринятой методике заливали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 3–5 мкм. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводили с использованием светооптического микроскопа Accu-Scope 3000 SERIES (США) при увеличении в 40 и 100 раз. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры TOUPCAM UCMOS05100KPA (Китай) и программного обеспечения ToupView 3.7.7892 (Китай).
Морфометрические измерения осуществляли в участке наиболее выраженных изменений. Были измерены толщина дермы и эпидермиса на непораженном участке уха и толщина рубца от хряща в зоне поражения. По полученным данным рассчитывали индекс толщины рубца (Scar eelevation index, или SEI), который представляется как отношение толщины ткани гипертрофического рубца и дермы (до хряща) к толщине нормальной здоровой ткани (до хряща) в соответствии с рис. 2 [8, 11, 13, 15, 16].
Для статистической оценки динамики данных расчета SEI для парного сравнения был использован критерий Стьюдента, для данных планиметрической оценки – критерий Манна–Уитни. Различия были определены при уровне значимости 0,05. Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft, США).
В настоящем исследовании в период формирования рубцов у животных обеих групп наблюдали процесс затягивания раны с последующим нарастанием соединительной ткани, в результате которого сформированный рубец возвышался над неповрежденной кожей. Так, на 17-й день эксперимента в результате планиметрической оценки рубцов экспериментальных животных общая планиметрическая оценка гипертрофических рубцов составила от 6 до 7 баллов. Наблюдали полную реэпителизацию раны (рис. 3, а), эритематозность (от розово-красного до интенсивного красного цвета), приподнятость, шероховатость, плотность рубцов с выраженным контуром. Такая характеристика рубца сохранялась до 27-го дня эксперимента (см. рис. 3, б, в). На данный день SEI кроликов контрольной группы составлял 5,5±0,21 (рис. 4). С 32-го по 37-й день эксперимента рубцы в контрольной группе имели гладкую поверхность, светло-розовый цвет, но также сохранялись выраженность контура рубца, заметная приподнятость и плотность (см. рис. 3, г, д). В конце эксперимента, на 37-й день, общий планиметрический балл был 4,5, SEI статистически значимо не изменился и составил 5,3±0,08. Описанные клинические изменения внешнего вида ран у кроликов подтверждают формирование патологии и соответствуют данным литературы [18, 19].
Терапевтическое действие препарата Дипроспан® регистрировали на 27-й день эксперимента, после 2-го введения в дозе 0,33 мг/животное, в результате которого планиметрические показатели рубцов отличались от контрольной группы (см. рис. 3, е, ж). В результате общая планиметрическая оценка гипертрофических рубцов животных 2-й группы составила от 5,5 до 6,5 балла и статистически значимо не отличалась от таковой в контрольной группе (p>0,05). Рубцы выглядели менее приподнятыми, что подтверждается статистически значимым уменьшением SEI в 1,4 раза в сравнении с таковым в контрольной группе на данный день (см. рис. 4). Рубцы имели выраженный контур, неровную поверхность и цвет от розово-красного до светло-розового (см. рис. 3, з). После 3-й инъекции препарата у животных 2-й группы на 37-й день наблюдали нормотрофию рубцов, которая подтверждалась как в результате планиметрической оценки (0 баллов), так и при измерении SEI: рубцы были плоскими и регистрировалось статистически значимое снижение SEI по сравнению с данными на 27-й день эксперимента в 1,1 раза и контрольной группой на 37-й день в 1,5 раза. Общий балл планиметрической оценки у животных 2-й группы статистический значимо различался от такового у животных контрольной группы на 37-й день эксперимента (p<0,05). Рубцы имели следующие параметры: отсутствие выраженного контура, гладкая поверхность и цвет кожи нормальный или с желтоватым оттенком (см. рис. 3, и, к).
Формирование рубцовой ткани является защитным, многостадийным процессом кожного покрова. Согласно данным литературы [6], нормотрофическая рубцовая ткань у людей имеет упорядоченное расположение умеренно утолщенных волокон коллагена, ориентированных параллельно поверхности эпидермиса. Среди фибробластов доминируют зрелые фракции с умеренной и слабой активностью (чем обусловливается слабый синтез коллагена). По мере «старения» рубцовой ткани наблюдается постепенное замещение коллагенобластов фиброцитами, появление дистрофических клеточных форм.
Гипертрофические и келоидные рубцы относятся к группе фибробластических образований. При заживлении глубоких ран активизация фибробластов, вызванная накоплением продуктов распада и свободных радикалов, происходит в условиях гипоксии, локального воспаления и нарушения микроциркуляции макрофагов, лейкоцитов, эпителиальных клеток, синтезирующих коллагеназу. В результате этого процесса образуются недифференцированные функционально активные клетки с высоким уровнем синтеза коллагена [2, 4, 18, 20], приводящего к увеличению толщины рубцовой ткани. В результате усиленной неоваскуляризации рубец становится эритематозным. По мере «старения» рубца стенки новообразованных сосудов утолщаются, вследствие чего краснота спадает [4, 20, 21].
Отличие гипертрофических рубцов от келоидных заключается в наличии стадии регрессии, сравнительно медленного синтеза коллагена, отсутствии генетической зависимости и обширного периферического роста соединительной ткани [4, 20, 21].
В результате моделирования патологии у животных в контрольной группе на 27-й день эксперимента на микроскопическом уровне наблюдали беспорядочное расположение коротких извитых коллагеновых волокон соединительной ткани, которые сохранялись до конца исследования (рис. 5 и 6). В ткани рубца регистрировали небольшие участки грануляционной ткани с признаками неоваскуляризации (большое количество вновь образованных сосудов капиллярного типа, что обусловливает красновато-розовый цвет рубца), с умеренной воспалительной инфильтрацией и большим количеством фибробластов. В центральной части рубца наблюдали частичное завершение эпидермизации и участки молодой соединительной ткани с сосудами капиллярного типа, эпидермис по краям раны с признаками заживления – количество слоев увеличено, стратификация нарушена, наблюдались пролиферация в базальном слое, большое количество митозов, выраженная сосочковость. Процесс формирования гипертрофического рубца у кроликов занимает сравнительно меньший срок, чем у человека, что подтверждается в работе D.E. Morris и соавт. [7]. На 37-й день эксперимента фиксировали снижение воспалительной инфильтрации и увеличенное число фибробластов. Уменьшение степени эритемы рубца обусловливалось утолщением стенок сосудов. Процессы эпителизации по краю раны были хорошо выражены, строение эпидермиса на большем протяжении регулярное, с правильно расположенными слоями. Описанные изменения ран у кроликов подтверждают формирование патологии и соответствуют данным литературы [13, 14, 16].
Гистологическое исследование рубцов показало, что после 2 введений препарата Дипроспан® (на 27-й день эксперимента) грануляционная ткань рубца была почти полностью замещена молодой соединительной тканью. Во 2-й группе наблюдали замедление процесса неоваскуляризации, поскольку в толще рубцовой ткани регистрировали уменьшение количества новых сосудов по сравнению с таковым в контрольной группе, а также утолщение стенок данных сосудов. В толще рубцовой ткани находили извилистые короткие утолщенные коллагеновые волокна и хорошо выраженную эпидермизацию по краям раны. У многих животных 2-й группы наблюдали полное заживление центральной части экспериментальной патологии (рис. 7 и 8). После 3 введений препарата Дипроспан® в рубцовой ткани на значительных участках наблюдали компактное линейное расположение коллагеновых волокон, уменьшенное количество сосудов с толстыми стенками, слабую воспалительную инфильтрацию и снижение количества фибробластов, что является схожим с гистологическим описанием нормотрофического рубца у людей [6].
Наблюдаемый терапевтический эффект препарата Дипроспан® связан с пролонгированный действием, ингибирующим провоспалительные ферменты, гормоны, простагландины и интерлейкины, что приводило к уменьшению (лизису) толщины рубцовой ткани до уровня здоровой кожи [22].
В результате создания глубокой несквозной раны с помощью хирургического удаления кожного покрова (эпидермиса и дермы) вместе с перихондрием регистрировали образование гипертрофических рубцов у животных в течение 17 дней. Макроскопические и микроскопические признаки гипертрофических рубцов в эксперименте соответствовали данным аналогичных исследований в литературе и клиническим признакам у людей. Применена балльная система в планиметрической оценке, ранее не проводившейся в аналогичных исследованиях. Использование балльной системы позволило применить статистический анализ данных, полученных в результате оценки внешнего вида гипертрофических рубцов кроликов.
Глюкокортикостероидный препарат Дипроспан® в дозе 0,33 мг/животное оказал терапевтическое действие, в результате наблюдали полную косметологическую коррекцию гипертрофических рубцов на ушной раковине кроликов, схожей с клиническим эффектом комплексной стратегии лечения таковых рубцов у людей. Препарат Дипроспан® может быть использован в качестве позитивного контроля в исследованиях с моделированием гипертрофических рубцов у кроликов.
А.А. Зуева – осуществление моделирования экспериментальной патологии, сбор и анализ данных, написание текста статьи.
А.Е. Кательникова – написание текста и/или критический пересмотр его содержания, существенный вклад в дизайн работы.
Я.А. Гущин – патоморфологическое исследование, сбор и анализ данных.
М.Н. Макарова – коррекция текста, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.