Оценка использования коррекции интервала QT (QTc) и референтные интервалы ЭКГ у интактных и наркотизированных хорьков

Введение

Исследования фармакологической безопасности являются обязательной частью программы доклинической оценки лекарственных препаратов, данные которых направлены на оценку потенциальных нежелательных фармакодинамических эффектов исследуемых веществ. С целью изучения влияния препарата на жизненно важные функции организма человека проводится основная батарея тестов, которая включает оценку воздействия на сердечно-⁠сосудистую систему (ССС), дыхательную и центральную нервную системы¹.

Как правило, оценка влияния ксенобиотиков на ССС включает исследования in vitro на клеточной тест-⁠системе, экспрессирующей HERG K+ каналы, и in vivo, в рамках которых оценивают артериальное давление (АД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и параметры электрокардиограммы (ЭКГ) у лабораторных животных².

Стратегия доклинических исследований фармакологической безопасности в отношении ССС, направленная на оценку способности исследуемого вещества задерживать реполяризацию желудочков, достаточно подробно описана в руководстве ICH S7B. Ключевым маркером в данной оценке служит интервал QT (время от начала комплекса QRS до окончания зубца Т). Это связано с тем, что при задержке реполяризации желудочков и удлинении интервала QT существует повышенный риск развития желудочковой тахиаритмии, включая желудочковую тахикардию типа «пируэт» (torsades de pointes), особенно в сочетании с другими факторами риска (например, гипокалиемией, структурным заболеванием сердца, брадикардией)³.

Удлинение интервала QT не является высокоспецифичным маркером, тем не менее считается, что препараты, которые не вызывают даже незначительного удлинения интервала QT, вероятней всего, не будут вызывать желудочковую тахикардию вовсе, либо этот эффект будет наблюдаться крайне редко при клиническом применении [1]. Соответственно, на сегодняшний день ввиду отсутствия других более информативных подходов оценка влияния лекарственных кандидатов на продолжительность QT и другие параметры ЭКГ является неотъемлемой частью исследований по изучению фармакологической безопасности.

Оценка функционального состояния ССС может проводиться у животных в сознании или под наркозом^4,5. В руководящих документах нет однозначных указаний на то, какой подход является оптимальным, так как каждый из них имеет свои недостатки. Так, регистрация параметров у бодрствующих животных может приводить к искажению данных из-⁠за психоэмоционального возбуждения у тест-⁠систем и выброса гормонов надпочечников. Применение анестезии, в свою очередь, потенциаль­но может оказать влияние на гемодинамику или удлинять интервал QT [2].

Рекомендуемые виды лабораторных животных для электрофизиологических исследований in vivo — собаки, обезьяны, свиньи, кролики, хорьки и морские свинки^6,7.

Хорьки представляют собой удобную модель для изучения фармакологической безопасности в отношении ССС. Из-⁠за сходства многих анатомических, метаболических и физиологических особенностей с человеком использование хорьков возможно в качестве альтернативы собакам и приматам в токсикологических исследованиях [3], в которых хорьки могут быть выбраны в качестве второго вида животных (негрызуны). В сравнении с традиционными крупными видами лабораторных животных (собаки и свиньи), хорьки являются более предпочтительными для длительных исследований хронической токсичности из-⁠за своих небольших размеров, что значительно уменьшает расход исследуемых объектов, а также ввиду простого и экономичного содержания. Несмотря на ряд преимуществ хорьков как тест-⁠систем, доступно мало материалов с историческими данными касательно их использования, что может быть связано с ограниченной доступностью хорьков в некоторых странах как лабораторных животных [4].

Физиологически, как правило, интервал QT укорачивается при увеличении ЧСС и удлиняется при уменьшении⁸. Данное обстоятельство может затруднить оценку потенциального влияния тестируемого вещества на реполяризацию желудочков и интервал QT при различной ЧСС у животных⁹.

Поскольку интервал QT зависит от ЧСС, его необходимо корректировать. Формула корректировки QTc (скорректированный QT) определяет интервал QT при ЧСС 60 в минуту. Это позволяет проводить сравнение значений интервала QT за определенный промежуток времени при различной ЧСС¹⁰. Было предложено несколько подходов к нормализации QT в зависимости от ЧСС (QTc), при этом вопрос о применимости различных формул остается предметом дискуссий. Существует ряд математических возможностей для описания QT/⁠RR, но часто используются только довольно простые подходы к коррекции ЧСС, например, формулы Базетта (Bazett) и Фридерика (Fridericia).

В настоящий момент не ясно, в какой мере данные формулы, а также другие однокоэффициентные модели могут описать функциональную связь QT и RR хорьков, так как в доступной литературе не обнаружено упоминаний о подборе формул для расчета QTc у этого вида животных. Также отсутствуют рекомендации по подбору оптимального режима наркотизации для регистрации ЭКГ, содержащие информацию о потенциальном влиянии препаратов на параметры ЭКГ и АД.

Все вышесказанное указывает на необходимость подбора поправочных формул для оценки интервала QT, а также описания влияния используемых препаратов для наркотизации на параметры ЭКГ и АД. С этой целью проанализировали данные ЭКГ и АД, полученные при исследовании интактных хорьков и хорьков, наркотизированных золетилом и ксилазином в монорежиме. Помимо этого, рассчитали референтные интервалы по основным показателям, а также использовали и сравнили различные подходы коррекции QT применительно к имеющимся данным.

Цель исследования — определить оптимальный подход к коррекции интервала QT и установить референтные интервалы параметров ЭКГ и АД у интактных и наркотизированных хорьков.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1) определить влияние наркотизации (золетил или ксилазин в монорежиме) на параметры АД и ЭКГ у хорьков;
2) оценить использование различных формул для коррекции интервала QT у интактных хорьков и на фоне наркотизации;
3) установить референтные интервалы параметров АД и ЭКГ у интактных и наркотизированных хорьков.

Материал и методы

В анализ были включены данные ЭКГ 344 половозрелых хорьков и АД 218 половозрелых хорьков, полученные в период 2020–2022 гг. Ретроспективные результаты животных, наркотизированных золетилом (45 самцов и 44 самки) или ксилазином (69 самцов и 72 самки), были получены в рамках токсикологических исследований. Для оценки влияния препаратов анестезии на показатели ЭКГ и АД дополнительно были проведены исследования ЭКГ (81 самец и 33 самки) и АД (28 самцов и 30 самок) у интактных бодрствующих хорьков.

Всех животных содержали в стандартных условиях вивария: температура воздуха 15–24 °С, 12-⁠часовой световой день. Хорьки находились в клетках, не более 2 животных в каждой. Площадь пола на одно животное соответствовала регламентирующим стандартам, доступ к воде не ограничивали на протяжении всего срока эксперимента. Животных лишали корма на ночь перед экспериментальными манипуляциями, оставляя свободный доступ к воде. Животные получали стандартную диету. Все научно-⁠исследовательские работы были рассмотрены на заседаниях биоэтической комиссии АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», одобрены для проведения и выполнены в соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

Регистрацию параметров АД и ЭКГ осуществляли в дневные часы (с 10:00 до 15:00). Непосредственно перед фиксацией показателей животных наркотизировали, используя препарат Ксила (1–2 мг/⁠кг, Interchemie Werken «de Adelaar» BV, Нидерланды) или Золетил (12 мг/⁠кг, «Virbac S.A.», Франция) в монорежиме. Препараты вводили внутримышечно, через 3–5 мин после наступления устойчивой наркотизации начинали регистрировать АД и ЭКГ. Интактных животных в наркоз не вводили, непосредственно перед фиксацией показателей им давали возможность адаптироваться в течение 5 мин в помещении для оценки функциональных показателей, далее их удерживали за холку в положении на боку. Хорьки в целом переносили манипуляцию спокойно, позволяя получить запись удовлетворительного качества, что характеризует эту тест-⁠систему как удобную для снятия электрофизиологических параметров.

АД систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) у животных измеряли неинвазивным методом при помощи прибора для измерения артериального давления у лабораторных животных [ветеринарный монитор давления Zoomed BPM-⁠2 (ООО «Зоомед», Санкт-⁠Петербург, Россия)]. Манжету для измерения давления располагали на грудной конечности. Проводили 3 последовательных измерения с интервалом между ними не менее 2 мин, анализировали среднее значение.

После измерения АД фиксировали параметры ЭКГ с помощью компьютерного электрокардиографа для ветеринарии «Поли-⁠спектр-⁠8/⁠E» (ООО «Нейрософт», Россия). ЭКГ записывали в течение 1 мин и анализировали во II отведении, оценивали следующие показатели: ЧСС, а также продолжительность RR, P, PQ, QRS, QT (в мс) и амплитуду зубцов R, Р, Q, S, T (в мВ). Для анализа ЭКГ использовали программу Поли-⁠Спектр-⁠Анализ (Нейрософт, Россия).

Для подбора оптимального метода расчета, скорректированного QT, использовали 4 формулы (табл. 1), далее интервалы QTc и RR наносили на график рассеивания с QTc (либо с нескорректированным QT) по оси Y и интервалом RR по оси X. Было построено 5 графиков рассеивания (4 — по QTc и 1 — по нескорректированному QT). Наклон регрессионной прямой QTc, близкий к нулю, указывает на согласованность в расчете значений QTc в полученном диапазоне ЧСС [5].

Для всех данных применена описательная статистика: результаты проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро—Уилка.

Данные, соответствующие закону нормального распределения, рассчитывали как среднее значение (M) и стандартную ошибку среднего (SEM), а также минимальное (MIN) и максимальное значение (MAX), которые вместе со значением n (количество наблюдений) были представлены в таблицах. Для расчета референтных интервалов проводился расчет промежутка 2,5–97,5‰ вне зависимости от типа распределения данных. При оценке данных с признаками нормального распределения при сравнении самцов и самок применяли t-⁠критерий Стьюдента (t-⁠test). Сравнение результатов, полученных при разных режимах наркотизации, проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ (One-⁠way ANOVA) с последующим межгрупповым сравнением (post hoc analysis) при помощи критерия Тьюки (Tukey’s test).

При нанесении на график рассеивания QT/⁠QTc и RR рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (R), коэффициент детерминации (R²) и уровень значимости уравнения регрессии (F-⁠критерий Фишера). Эти данные представлены на рисунках с соответствующими графиками рассеивания.

Различия определяли при уровне значимости р≤0,05. Статистическую обработку результатов и построение диаграмм рассеивания (Scatter plot) осуществляли в программе Statistica 10.

Результаты и обсуждение

Оценка влияния наркотизации на параметры АД и ЭКГ

Результаты оценки АД у интактных и наркотизированных хорьков показаны в табл. 2. Данные представлены без разделения по полу, поскольку отличий по показателям АД во всех группах между самцами и самками не выявлено (t-⁠критерий Стьюдента; p>0,05). На рис. 1 графически показан разброс индивидуальных значений. По результатам проведенного анализа показано умеренное снижение ДАД у животных, наркотизированных золетилом, в сравнении с интактными животными.

На рис. 2, 3 представлены типичные ленты ЭКГ на фоне наркотизации золетилом и ксилазином в монорежиме.

ЭКГ интактных хорьков и хорьков, наркотизированных золетилом, характеризовались синусовым ритмом без выраженной синусовой аритмии. У животных были хорошо различимы основные комплексы, ЧСС на фоне золетила 276 в минуту, а у интактных животных эти значения были на уровне 242 в минуту (см. рис. 2).

ЭКГ хорьков, наркотизированных ксилазином, несколько отличалась от таковой животных, описанных выше (см. рис. 3). У многих хорьков на фоне наркоза отмечалась синусовая аритмия со снижением среднего значения ЧСС до 138 в минуту. Проявления синусовой аритмии хоть и могут встречаться у отдельных животных в норме, но в целом не характерны для хорьков [6], что говорит о потенциальном проаритмогенном действии ксилазина.

Для оценки выраженности проаритмогенного эффекта в анализ включали минимальную (RR_мин) и максимальную длительность интервала RR (RR_макс), разность между RR_мин и RR_макс (ΔRR_мин и RR_макс), а также среднее значение длительности интервала RR за время регистрации.

Морфология сердечных комплексов всех исследованных групп визуально не отличалась, в подавляющем большинстве случаев у животных отмечались выраженные положительные зубцы P, R и T, слабовыраженный или нулевой Q и отрицательный зубец S (см. рис. 2, 3).

Оценка интервала QT требует строгой стандартизации методологии для получения надежных и воспроизводимых результатов. Одной из проблем для такой стандартизации является то, что размер и форма зубца Т сильно варьируют у разных хорьков (рис. 4).

Это нужно учитывать при измерении интервала QT. Однако в отличие от собак, в доступной литературе не обнаружено исчерпывающих руководств, которые описывают способ измерения интервала QT.

В рамках данной работы был использован хорошо зарекомендовавший себя подход с измерением интервала от самого начала QRS до самого позднего конца зубца T (его определяли путем экстраполяции прямой линии терминальной части зубца T до точки, где он пересекает базовую линию) (рис. 5). В случае двухфазного зубца T, который в норме встречается у хорьков, его также измеряли до конца [6]. Для простоты измерения проводилась касательная к самой крутой части конца зубца Т (см. рис. 5)¹¹.

В табл. 3–5 представлены результаты оценки параметров ЭКГ у животных. Анализ данных по продолжительности части комплексов показал, что у самцов и самок присутствуют межполовые различия, в связи с чем эти данные анализировали раздельно (см. табл. 3 и 4).

При межполовом сравнении интактных животных были выявлены значимые различия (t-⁠критерий Стьюдента; p<0,05) по показателям, характеризующим сердечный ритм (ЧСС, RR, RR_мин) и продолжительность комплексов (P, PQ, QRS). В свою очередь, при межполовом сравнении животных, получивших золетил, были выявлены значимые различия по показателям, определяющим сердечный ритм (ЧСС, RR, RR_мин и RR_макс) и продолжительность комплексов (PQ и QT).

В интактной группе и группе, получившей золетил, отмечалось увеличение ЧСС у самок относительно самцов, что закономерно вызывало укорочение комплексов RR. Примечательно, что у животных на фоне наркотизации ксилазином данные межполовые различия сглаживались (см. табл. 3). Интересной находкой является тенденция к укорочению зубца P и комплексов QRS и PQ у самок по сравнению с самцами (все группы). Укорочение зубца P и комплексов QRS и PQ у интактных самок, PQ у самок, наркотизированных золетилом, и зубца P у самок, наркотизированных ксилазином, достигало статистической значимости. Данные межполовые различия следует учитывать при интерпретации результатов исследований.

При межгрупповом сравнении по показателям, характеризующим сердечный ритм, были отмечены различия по всем исследованным параметрам: RR, RR_мин, RR_макс, ΔRR_мин и RR_макс и ЧСС (One-⁠way ANOVA; p<0,05). При последующем сравнении с применением критерия Тьюки отмечалось урежение ритма в группе, получившей ксилазин (относительно интактной группы и золетила), а также закономерное увеличение на этом фоне всех интервалов RR (средний, минимальный и максимальный).

Отдельного внимания заслуживает то, что группа, наркотизированная ксилазином, демонстрировала достаточно большую разность между минимальным и максимальным RR (в среднем 273–290 мс), это достоверно больше, чем в интактной группе и группе, получившей золетил (критерий Тьюки; p<0,05).

В источниках литературы [7] есть упоминания о том, что ксилазин в некотором проценте случаев вызывает синусовую брадиаритмию у собак, однако не обнаружено упоминаний об этом феномене у хорьков. Данный факт подтверждает гипотезу, что ксилазин дает проаритмогенный эффект, влияющий на сердечную функцию хорьков, и делает его нежелательным препаратом для наркотизации животных в рамках процедур по оценке параметров сердечно-⁠сосудистой функции.

При межгрупповом сравнении животных по продолжительности основных сердечных комплексов отмечались отличия по всем исследованным показателям: P, PQ, QRS, QT, кроме интервала P у самцов (см. табл. 4, One-⁠way ANOVA; p<0,05).

При последующем сравнении с применением критерия Тьюки, по сравнению с интактной группой, выявлялось удлинение P и PQ у самок, а также QRS и QT у самцов и самок на фоне ксилазина (критерий Тьюки; p<0,05). На фоне золетила отмечалось укорочение интервала PQ у самцов и тенденция к укорочению PQ у самок, а также удлинение интервала QT у самцов по сравнению с интактной группой (критерий Тьюки; p<0,05).

Сравнение групп, где использовался золетил и ксилазин, позволило выявить укорочение интервала PQ у самок в группе, получившей золетил, и удлинение интервалов QRS у самцов и QT у самцов и самок в группе, принимавшей ксилазин (критерий Тьюки; p<0,05).

При анализе высоты комплексов межполовых различий не отмечалось, данные представлены без разделения по полу (см. табл. 5; t-⁠критерий Стьюдента; p>0,05). При межгрупповом сравнении животных по высоте основных сердечных комплексов отмечались отличия показателей P, R, S, T (One-⁠way ANOVA; p<0,05). При последующем сравнении с применением критерия Тьюки выявлено, что наркотизация ксилазином приводила к снижению высоты зубцов P и S и увеличению высоты зубцов R и T относительно интактной группы и группы, наркотизированной золетилом.

Оценка использования коррекции интервала QT (QTc) у хорьков

Для оценки характера взаимосвязи между RR и QT для животных всех групп (отдельно для самцов и самок) были построены диаграммы рассеивания интервала QT. Вместе с уравнением регрессии и уровнем значимости они представлены на рис. 6–11.

Во всех случаях наблюдалась положительная связь между средним интервалом RR и интервалом QT (F-⁠критерий; p<0,05). У интактных животных изменение RR на 1 мс увеличивало QT приблизительно на 0,26 мс (см. рис. 6, 7). У животных на фоне золетила изменение RR на 1 мс увеличивало QT приблизительно на 0,3 мс (0,31 для самок и 0,30 для самцов, см. рис. 8, 9). У животных, получивших ксилазин, изменение RR на 1 мс увеличивало QT приблизительно на 0,07 мс (0,073 для самок и 0,066 для самцов, см. рис. 10, 11).

Наличие такой взаимосвязи подтверждает необходимость расчета скорректированных интервалов QTс и отбор формулы, которая минимизировала бы вклад изменения ЧСС (и соответственно интервала RR). Результаты расчета с использованием соответствующих формул (см. табл. 1) представлены в табл. 6.

Анализ всех данных показал, что применение формулы Базетта позволяет получить наименьший наклон регрессионной прямой у интактных животных и животных, наркотизированных золетилом, а для нивелирования вклада RR на фоне ксилазина наименьший наклон позволяет получить формула Ван де Вотера (табл. 7). При этом важно отметить, что данные формулы одинаково хорошо подходили как для самцов, так и для самок. Диаграммы рассеивания QTc, рассчитанные с помощью наиболее оптимальной формулы, представлены рис. 12–17. Подбор наиболее подходящей формулы позволяет убрать связь между RR и QTc, что дополнительно подтверждает эффективность формулы (F-⁠критерий; p>0,05).

Установление референтных интервалов параметров АД и ЭКГ

По результатам измерения показателей АД и ЭКГ, а также расчета скорректированного QTc получено достаточно данных для каждого исследованного параметра при построении референтных интервалов (РИ) [8].

РИ — статистический показатель, двумя пределами ограничивающий центральный 95% диапазон референтных значений. Этот показатель определяют на выборке условно здоровых людей или животных для того, чтобы установить статистические нормы по какому-⁠либо показателю, который характеризует данную популяцию [9].

Согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), в каждом исследовательском центре целесообразно создавать собственные РИ [9].

Существует два основных метода для расчета пределов РИ: параметрический и непараметрический. Плюсы непараметрического метода: он не требователен к распределению данных, что делает его предпочтительным при создании РИ биологических показателей, которые зачастую имеют ненормальное распределение [9].

Далее, согласно руководству CLSI для показателей АД и ЭКГ, проводили расчет промежутка 2,5–97,5‰, диапазон между которыми служил РИ для этих показателей в условиях нашей лаборатории (табл. 8) [8].

Данные, полученные в других исследовательских центрах по показателям АД и ЭКГ, представлены в таблицах 9 и 10 соответственно.

При сравнении собственных и данных литературы по ЭКГ интактных животных можно заключить, что результаты в целом сопоставимы. Стоит отметить, что показатели, установленные в разных научных центрах, демонстрируют вариабельность (см. табл. 9, 10), указывают на необходимость разработки в каждой лаборатории подхода к интерпретации результатов с использованием собственных данных, полученных при определенных экспериментальных условиях [18].

Заключение

ЭКГ интактных хорьков и хорьков, наркотизированных препаратом Золетил, характеризовались синусовым ритмом без выраженной синусовой аритмии. У животных были хорошо различимы основные комплексы, ЧСС на фоне золетила 276 в минуту, а у интактных животных 242 в минуту. Применение анестезии ксилазином приводило к урежению ЧСС в среднем до 138 в минуту и возникновению признаков синусовой аритмии. Морфология сердечных комплексов всех исследованных групп визуально не отличалась, в подавляющем большинстве случаев у животных отмечались выраженные положительные зубцы P, R и T, слабовыраженный или нулевой Q и отрицательный зубец S.

Оценка показателей, характеризующих сердечный ритм (ЧСС, RR, RR_мин, RR_макс), показала, что без наркотизации либо на фоне золетила у самок хорьков ЧСС значительно выше, чем у самцов. Увеличение ЧСС у самок закономерно приводило к укорочению интервала RR. Применение ксилазина сглаживает характерные межполовые различия и приводит к урежению ЧСС и удлинению всех интервалов RR.

Также особый интерес представляет значимое увеличение средней разности между RR_мин и RR_макс на фоне ксилазина, что говорит о проаритмогенном действии ксилазина. Это указывает на то, что наркотизация ксилазином является нежелательной для хорьков, так как вызывает синусовые брадиаритмии и нарушает регулярность ритма.

Анализ продолжительности P, PQ, QRS, QT (в мс) позволил выявить межполовые различия у интактных и наркотизированных хорьков. Наличие этой разницы необходимо учитывать при планировании экспериментов. Исследование амплитуды зубцов R, Р, Q, S, T (в мВ), напротив, не выявило межполовых различий. При оценке влияния анестезии на параметры ЭКГ показано, что ксилазин оказывает большое влияние как на продолжительность, так и на амплитуду всех исследованных параметров (по сравнению с интактной группой), еще раз подтверждая нежелательность его использования при регистрации ЭКГ.

Результаты проведенного анализа продемонстрировали, что у хорьков без применения анестезии и у хорьков на фоне наркотизации золетилом или ксилазином наблюдается положительная связь между RR и QT, что указывает на целесообразность применения формул для коррекции QT (QTc). Из всех исследованных формул [Базетта (Bazett), Фридерика (Fridericia), Саги (Sagie) и Ван де Вотера (Van de Water)] наиболее эффективными были признаны формула Базетта (у интактных животных и животных, наркотизированных золетилом) и формула Ван де Вотера (у животных, наркотизированных ксилазином). Примечательно, что формула подбора QTc не была специфична для пола животных, она годится только для вида наркотизации.

По результатам проведенного эксперимента установлены референтные интервалы по основным показателям ЭКГ [продолжительность RR, P, PQ, QRS, QT (в мс) и амплитуда зубцов R, Р, Q, S, T (в мВ)], а также АД (САД и ДАД). Это позволит в дальнейшем более эффективно оценивать изменения функциональных значений сердечно-⁠сосудистой системы у хорьков при изучении фармакологической безопасности лекарственных средств.

При подборе подходящих поправочных коэффициентов для коррекции интервала QT и при расчете внутрилабораторных референтных интервалов следует учитывать, что эти параметры должны определяться в каждой исследовательской лаборатории на основании собственных данных, полученных на конкретной породе животных и при определенных экспериментальных условиях с учетом всех факторов, потенциально влияющих на результаты исследования.