Ассоциированные с полом различия реакций нейровоспаления в коре больших полушарий при манифестации болезни Альцгеймера в эксперименте

Введение

Нейровоспаление является одной из основных защитных реакций центральной нервной системы (ЦНС) и напрямую связано с патогенезом нейродегенеративных заболеваний [1]. Существует разделение процесса нейровоспаления на два типа в зависимости от длительности его течения: нейропротекторный и нейродегенеративный. Нейропротекторное нейровоспаление — это когда последствия от травмы носят кратковременный характер и длятся в течение короткого периода времени без тяжелых последствий со стороны нервной системы. При хроническом течении воспалительного процесса с постоянным воздействием на ЦНС нейровоспаление приобретает нейродегенеративный характер [2]. Согласно данным, представленным R. Dhapola и соавт. и К. Shi и соавт. [3, 4], одним из основных нейродегенеративных заболеваний считается болезнь Альцгеймера (БА), от которой страдает около 55 млн человек во всем мире. При этом одним из ведущих патофизиологических процессов в развитии БА является нейровоспаление, приводящее к активации ряда факторов, которые будут способствовать развитию дегенерации в коре больших полушарий головного мозга [5]. Среди данных факторов выделяют процесс активации глиальных клеток, который приводит к высвобождению ряда провоспалительных молекул: фактор некроза опухоли-⁠α (ФНО-⁠α), интерлейкины (ИЛ) 1β и 6 [6]. Также выделяют взаимосвязь этих процессов (посредством активации NOD-⁠подобных рецепторов — NDLR) с образованием нейрофибриллярных клубков тау-⁠белка и внеклеточным отложением бета-⁠амилоида (Aβ) — главных особенностей течения БА [7, 8]. Так, NDLR-⁠зависимое повышение уровня ИЛ-⁠1β будет катализировать процесс образования других цитокинов, таких как ИЛ-⁠6, которые в последствии будут активировать CDK5, индуцируя гиперфосфорилирование тау и формирование нейрофибриллярных включений [9, 10].

В связи с высокой патогенетической значимостью реакций нейровоспаления изучению данного процесса посвящено обширное количество клинических исследований. Например, А. Ng и соавт. [11] в метаанализе, обобщающем 34 клинических исследования, продемонстрировали, что имеется значимая связь между развитием нейровоспаления при БА и депрессией. В ходе доклинических исследований БА нейровоспаление и ключевые молекулы, которые опосредуют инициацию и поддержание данного процесса, рассматриваются как одни из наиболее перспективных фармакотерапевтических мишеней [12].

В то же время изучению влияния пола экспериментальных животных на течение нейровоспалительной реакции и БА в общем отводится намного меньшая роль. По данным R. Zakaria и соавт. [13], в подавляющем большинстве случаев, в ходе доклинических исследований при моделировании БА используются крысы-⁠самцы, хотя указывается, что на крысах-⁠самках возможно воспроизведение патогенетического фенотипа заболевания, наиболее близкого к таковому в клинической практике. Однако стоит отметить, что в некоторых исследованиях установлены половые различия отдельных звеньев патогенеза БА. Например, Р. Babaei и соавт. [14] показали, что реакции окислительного стресса в ткани головного мозга у крыс с БА протекают интенсивнее у самок, о чем свидетельствовал пониженный по отношению к крысам-⁠самцам уровень восстановленного глутатиона.

R. Biasibetti и соавт. [15] продемонстрировали, что при моделировании БА путем введения стрептозотицина в гиппокамп животных имеются существенные половые отличия в формировании холинергических нарушений, энергодефицита и окислительного стресса. Таким образом, отдельные патогенетические механизмы развития БА изучаются в контексте зависимых от пола изменений, но в то же время нейровоспалению уделяется не такое пристальное внимание, что актуализирует оценку данного патофизиологического механизма течения БА с позиции пол-⁠ассоциированных отличий.

Цель исследования — проведение исследования, направленное на выявление возможных половых различий реакций нейровоспаления в коре больших полушарий у крыс с болезнью Альцгеймера.

Материал и методы

Экспериментальная работа проводилась на половозрелых крысах самцах и самках Вистар массой тела 210–230 г (n=40), полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (д. Рапполово, Ленинградская обл.). Содержание животных соответствовало положениям Директивы ЕС 2010/⁠63¹. Животные находились в помещениях лаборатории живых систем Пятигорского медико-⁠фармацевтического института (ПМФИ) при контролируемых условиях окружающей среды: нормальном атмосферном давлении, температуре воздуха 22–24 °С, влажности воздуха 55–75% и 12-⁠часовом цикле день/⁠ночь с сохранением нормальных для данного вида циркадных ритмов. Доступ животных к воде и полнорационному корму не ограничивали. Все манипуляции, проводимые с экспериментальными животными, соответствовали международным нормам экспериментальной этики [16]. Оперативные процедуры выполнены под хлоралгидратной анестезией (хлоралгидрат 350 мг/⁠кг интраперитонеально). Дизайн исследования был одобрен локальным этическим комитетом ПМФИ (протокол № 8 от 07.07.23). За 14 дней до начала эксперимента животных помещали в карантинном помещении, затем их разделили на 4 группы по 10 особей: 1-⁠я группа — ложнооперированные самцы (ЛО ♂); 2-⁠я группа — ложнооперированные самки (ЛО ♀); 3-⁠я группа — самцы с моделью патологии (НК ♂); 4-⁠я группа — самки с моделью патологии (НК ♀).

Количество животных в группе рассчитывали по формуле:

n=(t0,05×Sd)²/⁠d²,

где: Sd — дисперсия межгрупповых различий; d — средняя разница, когда ожидаемая величина является значимой; t0,05 — дисперсия межгрупповых различий при р=0,05.

Принимая, что n>30, t=2, Sd=3 и d=2, рассчитанное значение n составляет не менее 9 особей в одной группе [17].

Животным 3-⁠й и 4-⁠й групп проводилось моделирование БА путем внутригиппокампальной инъекции (в СА1-⁠часть гиппокампа. Стереотаксические координаты: переднезадняя 3,8 мм, медиально-⁠латеральная 2 мм, дорсально-⁠вентральная 2,6 мм от брегмы) агрегатов Aβ_1–42. Агрегаты получали ex tempore путем растворения фрагментов Aβ_1–42 (Sigma-⁠Aldrich, Германия) в смеси диметилсульфоксид/⁠вода очищенная (1/⁠9) при непрерывном перемешивании. Животных анестезировали хлоралгидратом, фиксировали в стереотаксической установке и отмечали место, необходимое для выполнения трепанации. Далее крыс извлекали из установки, скальпировали и бором проделывали трепанационное отверстие (при периодическом охлаждении 0,9% раствором натрия хлорида) согласно отмеченным ранее координатам. Агрегаты Aβ_1–42 вводили в конечной концентрации 1 ммоль/⁠л в объеме 2 мкл, используя шприц Гамильтона 10 мкл. После проведения процедуры моделирования патологии животных оставляли на 21 день [18]. Ежедневно животных осматривали на предмет наличия отклонений локомоторной активности, сенсорного восприятия, состояния кожных покровов. Смертности в процессе эксперимента отмечено не было. К ложнооперированным группам применялись манипуляции, аналогичные таковым при моделировании БА, за исключением введения агрегатов Aβ_1–42.

На 22-⁠й день проведения исследовательской работы животных подвергали эвтаназии методом декапитации с последующим извлечением головного мозга, который помещали на ледяную баню температурой не выше 4 °С. После выделяли кору больших полушарий путем иссечения скальпелем по средней борозде и непосредственно отделяли нужный биоматериал. Далее путем механического гомогенизирования в холодном буферном растворе, состоящем из 1 мM этиленгликольтетраацетата, 215 мM маннитола, 75 мM глюкозы, 0,1% бычь­его сывороточного альбумина, 20 мM HEPES; рН 7,2 (соотношение масса ткани/⁠объем буферного раствора составляло 1:7), получали гомогенат, который впоследствии центрифугировали при 10 000 g в течение 15 мин. В выделенном супернатанте методом иммуноферментного анализа определяли изменение реакций нейровоспаления путем оценки концентрации основных биомаркеров данного процесса: ИЛ 1, 6, 10, ФНО-⁠α и NDLR. Реактивы для проведения процедуры ИФА являлись видоспецифичными (Cloud Clone corp., КНР). В ходе анализа применяли систему микропланшетного ридера Infinite F50 (Tecan, Австрия).

Все результаты, полученные в ходе экспериментальной работы, обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «StatPlus 7.0» (AnalystSoft Inc., США). Исходные данные были проверены на нормальность распределения согласно критерию Шапиро—Уилка. Для сравнения групп средних применяли параметрические методы ANOVA с посттестом Ньюмена—Кейлса и непараметрические методы статического анализа — тест Крускалла—Уоллиса с постпарным сравнением в тесте Данна. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам анализа установлено, что в группе самок с моделью патологии БА величина уровня NDLR превосходила показатели контрольной группы животных в 44,7 раза (p<0,05). В группах самцов наблюдалась схожая тенденция к повышению уровня NDLR, увеличение концентрации рецепторов в сравнении с контрольной группой составило 10,6 раза (p<0,05), что было в 4 раза (p<0,05) меньше, чем у самок крыс с БА (рис. 1).

В ходе процедуры оценки концентрации ИЛ-⁠1β было определено, что в группе самок с БА отмечено повышение содержания данного цитокина в 12,5 раза (p<0,05) в сравнении с группой ложнооперированных крыс-⁠самок. По данным, полученным в процессе определения концентрации ИЛ-⁠1β в группах самцов, была отмечена тенденция к повышению уровня данного цитокина, который существенно превосходил показатели ложнооперированной группы крыс-⁠самцов в 4,8 раза (p<0,05). При этом показатели у крыс-⁠самцов были в 1,4 раза (p<0,05) ниже, чем в группе крыс-⁠самок с БА (рис. 2).

В результате исследования установлено, что уровень ИЛ-⁠6 в группе самок с моделью патологии был выше в 7,5 раза (p<0,05), чем у ложнооперированной группы. Содержание ИЛ-⁠6 в группе самцов с экспериментальной БА было выше, нежели у ложнооперированных животных, в 4,9 раза (p<0,05). В то же время концентрация ИЛ-⁠6 у крыс-⁠самок с БА была в 1,5 раза (p<0,05) выше, чем у крыс-⁠самцов с БА (рис. 3).

Уровень ИЛ-⁠10 (рис. 4) в группах крыс (♀, ♂) с моделью патологии снижался в равной зависимости по отношению к соответствующим показателям ложнооперированных крыс на 63,2% (p<0,05) и на 56,4% (p<0,05).

При проведении сравнительного анализа данных определения концентрации ФНО-⁠α установлено, что в группах животных (♀, ♂) с моделью патологии в равной зависимости повышался уровень данного цитокина, который превышал показатели ложнооперированных животных в 2,8 раза (p<0,05) и в 2,3 раза (p<0,05) соответственно (рис. 5).

На протяжении последних лет идет активное изучение нейровоспаления как потенциального фактора в развитии нейродегенерации. Так, в 2016 г. V. Calsolaro и соавт. [19] провели ряд исследований с применением нейровизуализации и изучением биопсии головного мозга пациентов с БА, в которых показали существенную роль нейровоспаления в течении БА. Помимо этого, особое внимание направлено на исследование мультибелкового комплекса, известного как NDLR-⁠связанная инфламмасома. NDLR активируется как ответ на повышение концентрации агрегатов Aβ, что впоследствии будет приводить к увеличению продукции цитокинов и активации сопряженных с ними патофизиологических механизмов развития БА, например, каспаза-⁠зависимых реакций апоптоза [20, 21]. Исследования показывают, что NDLR-⁠связанная инфламмасома и вызванное ей нейровоспаление приводят к гибели нейронов и снижению когнитивных функций [19]. В то же время NDLR подвержены значительному полиморфизму (зависимому от пола), что делает данный мультибелковый комплекс краеугольным камнем пол-⁠ассоциированных реакций воспаления. Как отмечают S. Green-⁠Fulgham и соавт. [22], при наличии патологического процесса в ЦНС у крыс-⁠самок наблюдается повышенная экспрессия NDLR, что приводит к гиперцитокинемии и неконтролируемой нейровоспалительной реакции. В данном исследовании показано, что при моделировании БА у самок крыс по сравнению с самцами концентрация NDLR была выше в 4 раза (p<0,05), что, вероятно, объясняет повышенные уровни цитокинов в ткани головного мозга у самок крыс по отношению к самцам. Также основываясь на полученных результатах, можно оптимизировать подход к доклинической оценке средств нейропротекторного действия, что позволит увеличить их трансляционный успех. Как отмечают N. Zhang и соавт. [23], успешное применение нейропротекторов в клинической практике весьма ограничено, что не в последнюю очередь связано с выбором релевантной экспериментальной модели на этапе доклинических испытаний. В связи с этим исследованные пол-⁠зависимые отличия реакций нейровоспаления у крыс с болезнью Альцгеймера могут быть использованы при изучении как фундаментальных особенностей течения нейродегенеративных процессов, так и при доклинической оценке новых нейропротекторных соединений.

Заключение

На основании полученных данных можно говорить, что у крыс-⁠самок процесс нейровоспаления в коре больших полушарий в условиях экспериментальной болезни Альцгеймера проходил намного интенсивнее за счет повышенной экспрессии NDLR (в 4 раза; p<0,05) и соответствующего увеличения уровня цитокинов интерлейкина-⁠1β (в 1,4 раза; p<0,05) и интерлейкина-⁠6 (в 1,5 раза; p<0,05). Результаты данного исследования позволят детальнее подходить к выбору пола экспериментальных животных при моделировании нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, что в свою очередь позволит улучшить подходы к доклиническому изучению нейропротекторов.