Изготовление электрокортикографического датчика и методика его имплантации крысам для долговременного мониторинга мозговой активности

Введение

Ключевым этапом скрининга эффективности и безопасности новых нейротропных соединений признаны доклинические испытания с применением регламентированного количества видов лабораторных животных. С каждым годом возрастает количество научных работ, сообщающих о высоком трансляционном потенциале нейробиологического инструмента, опирающегося на получение электрического сигнала с коры головного мозга посредством эпидуральной электрокортикографии (ЭКоГ). С этой позиции приемлемой тест-⁠системой для экстраполяции данных на человека считают крыс и предполагают, что использование ЭКоГ позволит повысить информативность результатов экспериментов, нацеленных на изучение эффективности и токсичности новых нейротропных соединений [1, 2]. Цели регистрации ЭКоГ у крыс весьма различны. Это и изучение нормальной физиологии мозга, сенсорных систем, проводящих путей, и фармако-⁠ЭКоГ, и моделирование физических и химических воздействий, а также поиск средств коррекции возникающей вследствие этого патологии, и изучение концепций психиатрических заболеваний, пограничных состояний, неврозов и др. [3, 4]. Поэтому использование накопленных научных знаний о нормальной физиологии мозга и электрофизиологических коррелятах патологических состояний позволит провести адекватную стандартизацию подхода и в будущем, согласно принципу 3R, сократить количество испытаний на лабораторных животных без потери надежности результатов.

Однако есть ряд сложностей в создании экспериментальных ЭКоГ-⁠моделей. Последние возникают по причине ограниченной доступности изготавливаемых промышленностью ЭКоГ-⁠датчиков, особенно для отечественных исследователей, а также вследствие значительной трудоемкости их имплантации в череп животных [4]. Вместе с тем хроническое использование имплантированных в череп электродов сопряжено с дополнительной травматизацией и, как следствие, с формированием искажающего сигнал глиального рубца, со скрытой ликвореей и гнойно-⁠септическими осложнениями [5, 6].

Цель исследования — обоснование возможности эпидуральной имплантации в череп крыс ЭКоГ-⁠датчика, позволяющего продолжительное время регистрировать биоэлектрическую активность коры головного мозга при свободном передвижении.

Задачи исследования

1. Провести разработку и апробацию последовательности ручного изготовления и эпидуральной имплантации в череп крыс ЭКоГ-⁠датчика, оценить качество биоэлектрического сигнала мозга в норме и при системном введении фармакологических зондов, обладающих известными маркерами воздействия на центральную нервную систему.
2. Оценить риски инвазивного воздействия и безопасность для лабораторных крыс эпидуральной имплантации ЭКоГ-⁠датчика, провести оценку благополучия лабораторных животных в хроническом эксперименте.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполняли на 40 нелинейных самцах крыс массой 200–250 г, полученных из «Питомника лабораторных животных Рапполово» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). Животных выдерживали в карантине в течение 14 сут в группах по 6 особей. В послеоперационный период животных размещали индивидуально в прозрачные клетки из органического стекла с отверстиями в боковых стенках для нивелирования развития стресса на фоне изоляции. Больных и ослабленных особей в исследование не включали. Общие условия содержания включали: 8-⁠часовой режим освещенности, температурный диапазон 20–22 °С, влажность воздуха не более 75% в соответствии с кратностью воздухообмена, доступ к воде и пище — ad libitum, однако за 1 сут до вживления соблюдали пищевую депривацию. Проведение исследования одобрено независимым этическим комитетом при ФГБВОУ ВО «Военно-⁠медицинская академия им. С. М. Кирова» Министерства обороны России (протокол от 17 октября 2023 г. № 283).

ЭКоГ-⁠датчик формировали из 6 регистрирующих и 1 заземляющего электродов. Изготовление регистрирующих электродов осуществляли путем последовательного соединения тупоконечных винтов из нержавеющей стали диаметром 1 мм и высотой 4 мм с медным проводом марки МГТФ диаметром 0,03 мм и длиной 20 мм (Чувашкабель, Россия) с вилками разъема—гнезда на 8 каналов и шагом контактов 2,54 мм PBS-⁠8 (Коннфли, Китай). Заземляющий электрод состоял из вилки и провода. Соединение осуществляли посредством пайки оловянно-⁠свинцовым припоем (3:2) после обработки активным флюсом в виде фосфорной кислоты. Далее электроды вилками коммутировали с разъемом—гнездом PBS-⁠8 (рис. 1).

Кабель для коммутации датчика и электроэнцефалографа делали из штыревого разъема PLL1.27-⁠7, проводов диаметром 1 мм и длиной 350 мм и разъема «touchproof» диаметром 1,5 мм DIN 42 802-⁠ST (Коннфли, Китай).

Вживление датчика в череп крыс производили посредством хирургической трефинации. Операцию выполняли в четыре этапа: доступ, трефинация отверстий, имплантация электродов и закрытие раны (рис. 2, 3).

Для проведения хирургических манипуляций животных внутрибрюшинно наркотизировали комбинированным препаратом, содержащим тилетамин и золазепам (Золетил 100, Вальдефарм, Франция) в дозе 0,8 мл/⁠кг. Осуществляли бритье операционного поля. Фиксировали голову на стереотаксической установке с бормашиной и прикладным программным обеспечением (ПО) для персонального компьютера (Нейростар, США), поместив аурикулярные планки в ушной канал и закрепив верхнюю челюсть с помощью переднего зажима. Закрепленную голову помещали в одну плоскость с линейкой переднезадних координат и в перпендикулярную к верхненижней линейке. Для обогрева животных во время операции использовали коврик—термостат оригинальной конструкции, установленный на 37±0,5 °C. Для исключения подсыхания глаз их покрывали гелем с декспантенолом 5% (Корнерегель, д-⁠р Герхард Манн ХФП, Германия).

После подготовки операционного поля в условиях асептики и антисептики (раствор йода спиртовой 5%—сухо—изопропиловый спирт 70%—сухо) и местной инфильтрационной анальгезии 0,5–1% раствором лидокаина (Биосинтез, Россия) выполняли сагиттальный каудокраниальный доступ. Длина разреза кожи составляла 2,5 см от места перехода затылочной кости в шейный отдел позвоночника до линии, проведенной между глазами. Накладывали ранорасширитель. Удаляли мышечно-⁠фасциальный слой, надкостницу в области лобных, теменных и затылочных костей. Гемостаз кровоточащих участков тканей и поверхности черепа на этапе доступа и далее осуществляли посредством применения одного из приемов: прижатие, прошивание лигатурой или наложение коллагеновой гемостатической губки (Белкозин, Россия). Остатки надкостницы удаляли марлевой салфеткой, смоченной 3% пероксидом водорода (Белмедпрепараты, Россия) (см. рис. 2).

Трефинацию черепа осуществляли шаровидной фрезой диаметром 0,9 мм. Для предупреждения чрезмерного нагревания сверление осуществляли интервально. Координаты расположения регистрирующих электродов определяли посредством стереотаксического атласа мозга крысы [7]. Положение сверла стереотаксиса калибровали по брегме—точке пересечения венечного и сагиттального швов. Имплантацию лобных электродов FP₁ и FP₂ выполняли над проекцией зоны М1 первичной двигательной коры по координатам: AP=+1,7 мм (вперед/⁠назад от брегмы), ML=±2,0 мм (влево/⁠вправо от сагиттального шва), DV=1,0 мм (глубина погружения), теменных С₃ и С₄ — над первичной соматосенсорной корой: AP=–4,1 мм; ML=±2,8 мм; DV=1,0 мм; затылочных О₁ и О₂ — над мозжечком: АP=–11,5 мм, ML=±2,0 мм, DV=1,0 мм. Регистрирующие и заземляющий электроды коммутировали к разъему. Далее заземляющий электрод заводили подкожно в область шеи на 1,5–2 см каудально (см. рис. 3).

Конструкцию фиксировали к черепу посредством двухкомпонентного пломбировочного зубоврачебного материала (Белокор, ВладМиВа, Россия). Для получения пластификата порошок и жидкость смешивали в соотношении 2:1 в течение 30 с, наносили стоматологическим шпателем, давали застыть 5 мин. Кожу ушивали нерассасывающимся шовным материалом рострально и каудально так, чтобы она аккуратно и без зазора примыкала к цементу. Накладывали асептическую марлевую повязку, которую заливали цианакрилатным клеем (Эфель 157, Эффективный Элемент, Россия).

После окончания операции животным с целью восполнения дефицита жидкости, обезболивания и профилактики инфекций внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,9% натрия хлорид, Мосфарм, Россия) в объеме 20 мл/⁠кг, 5% кетопрофен (Ветпром АД, Болгария) в дозе 10 мг/⁠особь, 4% гентамицин (Мосагроген, Россия) в дозе 10 мг/⁠особь соответственно.

Запись и регистрацию биоэлектрического сигнала с отведений осуществляли c полосой пропускания 0,5–35 Гц и частотой квантования 500 Гц с помощью 8-⁠канального компьютерного энцефалографа с модулем Нейрон-⁠Спектр-⁠1 с ПО Нейрон-⁠Спектр.NET (Нейрософт, Россия). Из полученного сигнала формировали биполярные продольные отведения Fр₁–C₃, Fр₂–C₄, C₃–O₁, C₄–O₂, Fр₁–O₁, Fр₂–O₁ (монтаж Double Bananna) и межполушарные поперечные отведения Fр₁–Fр₂, C₃–C₄ и O₁–O₂. Полученный спонтанный сигнал оценивали визуально-⁠логически. Также определяли спектральную амплитуду и мощность ритмов дельта (0,5–4,0 Гц), тета (4–8 Гц), альфа (8–14 Гц) и бета (низкочастотные 14–20 Гц и высокочастотные 20–35 Гц), коэффициент модуляции, индекс ритма или феномена, то есть относительную длительность за эпоху анализа.

В ходе исследования использовали эталонные фармакологические зонды (ФЗ), провоцирующие эпилептиформную активность [стрихнин, коразол, цианид натрия (Сигма Олдридж, Германия)], седативно-⁠гипнотические средства [тилетамин + золазепам, ксилазин (Ксила, Интерхеми, Нидерланды), дексмедетомедин (Дексдор, Орион, Финляндия), диизопропилфенол (Пропофол, Фрезениус, Германия)] в эффективных дозах, по данным литературы [5, 8]. В качестве носителя и для разведения препаратов использовали физиологический раствор. Рабочие растворы вводили внутривенно в хвостовую вену.

Запись осуществляли при свободном перемещении животных, предварительный перевод в экспериментальную комнату осуществляли за 1 ч для привыкания к новым условиям. Длительность записи составляла 1,5 ч: 15 мин фоновой активности и 75 мин после инъекции ФЗ. Для дальнейшего анализа стадировали записи и отбирали эпохи по 60 с без артефактов. В ходе исследований при оценке выраженности судорог использовали шкалу Рацин [9], о степени депримации судили по критериям шкалы индекса тяжести неврологических нарушений [10].

Для выявления послеоперационных осложнений за крысами наблюдали в течение 90 сут после имплантации. Ежедневно оценивали общее состояние, водно-⁠пищевое поведение и неврологическую функцию. На 30, 60 и 90-⁠е сутки у крыс, не получавших ФЗ, выполняли этологическое и патоморфологическое исследование головного мозга.

Этологическую оценку сохранности ориентировочно-⁠исследовательского рефлекса тестировали однократно в установке «открытое поле» (НПК «Открытая наука», Россия) с прикладным ПО (EthoVision XT, Noldus, Нидерланды). У оперированных и интактных крыс оценивали среднюю скорость перемещения, пройденную дистанцию, длительность замираний, количество стоек на задних лапках и заглядываний в норки. Число наблюдений (n) в каждой экспериментальной точке составляло 4.

Забор головного мозга (n=3 в каждой точке) производили после внутрисердечного введения 5–7 мл забуференного формалина в условиях внутрибрюшинной наркотизации тилетамином и золазепамом в дозе 2 мл/⁠кг. Выделяли участки прилегания электродов к коре полушарий и мозжечка. Далее участки мозга фиксировали в забуференном формалине, обезвоживали, заливали в парафин и изготавливали срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопию проводили с помощью светооптического микроскопа Микмед-⁠6 (Аналит-⁠Нева, Россия) при малом и большом увеличении [11].

Статистический анализ результатов осуществляли, используя ПО Statistica 10.0. Сравнение мер центральной тенденции в виде Me — медианы, [Q₂₅; Q₇₅] — нижнего и верхнего квартиля выполняли посредством непараметрического критерия Ньюмена—Кейлса для множественных попарных сравнений. Вывод о статистической значимости различий принимали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Апробацию работоспособности датчика и оценку валидности получаемых данных проводили на бодрствующих крысах в различные сроки после имплантации путем съема сигнала в состоянии покоя и после введения веществ судорожного и депримирующего действия с эталонной активностью.

При визуально-⁠логическом анализе кортикограмм крыс в состоянии бодрствующего покоя наблюдали непрерывный паттерн без пароксизмальных эпизодов депрессии сигнала. В частотной структуре паттерна преобладал низкочастотный бета-⁠ритм, индекс которого достигал 40% и более. Около 20–30% занимали тета-⁠волны, оставшееся время делили между собой альфа-⁠ и дельта-⁠ритмы.

При поисково-⁠исследовательской активности, проявлявшейся эпизодами обнюхивания и вставания на задние лапы, в области электродов C₃ и C₄ начинали доминировать тета-⁠ритмы. Преобладание в теменной зоне тета-⁠ритма при поисковом рефлексе связывают с наиболее близким предлежанием гиппокампа — его основного источника в мозге крыс [4].

Таким образом было показано, что изучаемый ЭКоГ-⁠датчик с выбранным расположением электродов позволяет снимать дифференцированный сигнал с различных областей мозга.

При введении крысам судорожных токсикантов коразола и стрихнина фоновый непрерывный паттерн отражал эпилептиформную и эпилептическую активность с типичным «острым» вариантом изменений. В условиях тонических судорог высокой интенсивности (4–5 баллов по Рацин) наблюдали пики (спайки), одиночные «острые» волны, их сочетания по типу пик—медленная волна, полипик—медленная волна, острая волна—медленная волна, формирующие продолженные разряды. При развитии комы генерализованная активность включала эпизоды пароксизмальной депрессии сигнала амплитудой менее 10 мкВ, индекс которой достигал 50%.

Далее отмечали паттерны по типу вспышка—ослабление и вспышка—подавление—чередование эпох активности и эпизодов депрессии сигнала амплитудой менее 10 и 2 мкВ соответственно. Последние переходили в паттерн разряд — постразрядная депрессия от частых до периодических двух-⁠ и трехфазных осцилляций на фоне глубокой депрессии сигнала до уровня 2–5 мкВ. В случае выживания животных спустя 4–5 ч наблюдали возвращение фонового ритма. Гибель животных определяли по наступлению изоэлектрического молчания (рис. 4).

После введения цианида натрия отмечали иную ЭКоГ-⁠картину. Наблюдали депрессию сигнала практически до изолинии. Спустя 1–2 мин возникала эпилептическая активность на фоне судорог высокой интенсивности. По всей видимости, порядок развития наблюдаемых феноменов был связан с механизмом действия токсиканта, основанном на последовательном развитии сначала энергодефицитной гибернации нейронов, а уже потом генерации судорог на ее фоне.

Введение агонистов α2-⁠адренорецепторов дексмедетомидина и ксилазина инициировало у крыс подъем активности дельта-⁠ритма в виде медленных высокоамплитудных волн преимущественно в области лобных и теменных электродов и снижение индексов бета-⁠ и альфа-⁠ритмов. На этом фоне у животных наблюдали развитие сопора и поверхностной комы.

После инъекций тилетамина с золазепамом наблюдали смену фонового ритма на медленные и высокоамплитудные волны с всплесками низкой амплитуды — так называемый кетаминовый комплекс [8]. При этом амплитуда низкочастотной активности возрастала больше, чем после инъекции α₂-⁠агонистов. По мере приближения пробуждения эти волны замещали более быстрые. Необходимо отметить, что даже при полном отсутствии болевой чувствительности зрачкового, глоточного, роговичного рефлексов у животных не наблюдали снижения амплитуды мозговой активности, что характерно для диссоциативных гипнотиков.

Диизопропилфенол приводил сначала к электрическому «молчанию», за которым следовала высокоамплитудно-⁠медленночастотная активность, переходящая в паттерн, близкий по своим характеристикам фоновому. Уровень мощности мозговой активности коррелировал с глубиной угнетения неврологической функции. При нарастании сигнала наблюдали выраженный лобно-⁠затылочный градиент, свидетельствовавший о валидности сигнала с мозжечковых электродов (рис. 5).

Таким образом, введение ФЗ с эталонной активностью позволило выявить ожидаемую и характерную биоэлектрическую активность. В свою очередь это свидетельствовало о приемлемом уровне чувствительности и специ­фичности сигнала, получаемого с исследуемого ЭКоГ-⁠датчика.

Помимо ценности сигнала с диагностической точки зрения, существенным вопросом эксплуатации ЭКоГ-⁠датчиков считают их безопасность для животных и длительность фиксации электродов [4]. Поэтому при разработке конструкции регистрирующих электродов применяли винты, а не электроды проволочного типа. Винты обеспечивали высокую степень контроля глубины погружения электродов при эпидуральной имплантации. Вместе с тем тупые концы винтов снижали вероятность повреждения твердой мозговой оболочки и пиальных сосудов. Как следствие, при наблюдении за крысами в течение 90 сут не было выявлено случаев послеоперационной летальности, которую связывают с ранними осложнениями: скрытой ликвореей, внутричерепной гематомой и дислокацией мозга, а также отсроченными гнойно-⁠септическими заболеваниями: абсцессом мозга, сепсисом и др. [1, 5].

Также хроническое использование датчика не оказывало негативного влияния на состояние испытуемых крыс и не вызывало патологических двигательных знаков. Это особенно важно, поскольку лобные электроды были имплантированы в зону двигательной коры. Не наблюдали и признаков болевой реакции в виде снижения двигательной активности, агрессивности, тремора, отсутствия груминга, «сгорбленной» позы и нарушений дыхания.

Ориентировочно-⁠исследовательский рефлекс крыс на 30-⁠е и 60-⁠е сутки соответствовал уровню интактной группы, тогда как по прошествии 90 сут животные демонстрировали гиполокомоторные расстройства, что соответствовало статистически значимому снижению показателей моторной и исследовательской функции поведения в тесте «открытое поле» (табл. 1).

При анализе гистологических препаратов прилегающих к винтам корковых областей через 30, 60 и 90 сут после имплантации обнаруживали невыраженные изменения, свидетельствовавшие о сохранности у большинства оперированных животных твердой и паутинной мозговой оболочки. Так, к 30-⁠м суткам у крыс с отсутствием дефекта тканей (2 из 3 особей) обнаруживали отечность и невыраженную клеточную реакцию. В одном случае были выявлены гемосидероз и выраженная миграция клеточных элементов. Далее, на 60-⁠е и 90-⁠е сутки изменения также можно было назвать невыраженными у большинства животных. В эти сроки при наличии дефекта (2 из 6 особей) наблюдали только гигантоклеточную реакцию и петрификацию в отсутствие формирования глиального рубца (рис. 6).

Заключение

Результаты апробации предложенной последовательности изготовления и имплантации ЭКоГ-⁠датчиков на моделях острых экспериментально индуцированных судорог и депримации позволяют считать получаемый с них сигнал валидным. Вместе с тем использование ЭКоГ-⁠датчика в течение 90 сут не вызывало значимого снижения сигнала и переносилось животными удовлетворительно, без неврологических нарушений и выраженной альтерации в области имплантации. Учитывая результаты хронического наблюдения за животными, выраженность ориентировочно-⁠исследовательского рефлекса как маркера психомоторной функции организма, а также патологической морфологии, наиболее рекомендованный период для проведения экспериментальных работ не более 90 сут. При соблюдении техники вживления ЭКоГ-⁠датчика и послеоперационного сопровождения, в том числе обезболивания, позволяет обеспечить выживаемость и улучшить благополучие животных, учитывая тяжесть проводимых процедур (Директива 2010/⁠63/⁠EU)¹.

Предлагаемая последовательность изготовления и имплантации ЭКоГ-⁠датчика достаточно проста, надежна и в то же время хорошо воспроизводима. Поскольку датчик изготавливают вручную, его можно модифицировать и адаптировать к конкретной задаче. Несмотря на удобство проведения стереотаксических операций, необходимо отметить, что имплантация электродов может быть осуществлена и без использования данной техники, например, с применением фиксации черепа на стандартном операционном столике для грызунов и ручной расстановки точек трефинации с помощью циркуль-⁠измерителя. Это позволяет считать ее доступной как для нейрофизиологических лабораторий, так и для большинства токсикологических или многопрофильных доклинических лабораторий, не имеющих стереотаксических установок.