Методические подходы к оценке паралитического синдрома токсического генеза в экспериментах на грызунах

Н.С. Ильинский, заместитель начальника отдела ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ. ORCID: 0000-0001-7406-753X
М.А. Тюнин, начальник отдела ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ, к.м.н., ORCID: 0000-0002-6974-5583
М.О. Матросова, младший научный сотрудник ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ. ORCID: 0000-0002-1395-823X

ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Министерства обороны Российской Федерации
195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, д. 4

Резюме

Требования фармакологической безопасности предписывают необходимость выполнения экспериментальной оценки потенциальных нейротоксичных эффектов разрабатываемых лекарственных средств. При этом сохранена необходимость экспериментального моделирования заболеваний периферической нервной системы для изучения их патогенеза и разработки новых подходов к терапии. В настоящее время внедрен в практику широкий перечень клинико-функциональных тестов, позволяющих выявить многие виды неврологического дефицита. Однако сохраняются некоторые терминологические и методологические разночтения между клинической и экспериментальной практикой. Все это обусловливает высокую актуальность исследований по совершенствованию методов оценки нейротоксических эффектов ксенобиотиков в экспериментах на лабораторных грызунах.

Цель – сравнить информативность исследования физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи шкалы отведения пальцев с другими рекомендованными методиками оценки периферического пареза.

Проведено комплексное клинико-инструментальное исследование по динамической оценке неврологического статуса самцов беспородных крыс на модели токсического тетрапареза, вызванного подкожным введением ЛД16 тетродотоксина. Введение тетродотоксина способно стабильно и с высокой повторяемостью вызывать у подопытных животных своеобразный синдром моторного дефицита (периферический парез) за счет неврального и мышечного компонентов. Внешние проявления интоксикации у крыс оценивали с помощью теста подтягивания на перекладине, «Ротарод» и шкалы отведения пальцев. С целью верификации нарушений процессов неврального проведения и нервно-мышечной передачи животным выполняли электронейромиографию и декремент-тест.

Результаты исследования продемонстрировали, что общепринятый в настоящее время методический аппарат экспериментальной оценки неврологического статуса способен выявить нарушения двигательных функций у крыс при достаточной их выраженности, когда по данным нейрофизиологического исследования уже наличествуют грубые изменения основных параметров. В ходе сравнения скорости возникновения и выраженности внешних признаков интоксикации установлено, что оценка физиологического двигательного рефлекса при помощи шкалы отведения пальцев обладает достаточно высокой информативностью и простотой тестирования, делая возможным выявление ранних признаков периферического пареза токсического генеза.

Введение

Вопросы стандартизации и повышения качества исследований безопасности химических соединений, особенно в отношении нейротоксичности, в экспериментах на животных представляют актуальную задачу, в том числе по причине методических разночтений. На сегодняшний день сохранена проблема неоднозначных подходов к терминологии, способам оценки и трактовке результатов исследований параличей (парезов) токсического генеза, при этом их скрининговая доклиническая оценка на грызунах представляет собой необходимый минимум, что подтверждено наличием многочисленных вариаций батарей клинико-функциональных тестов (КФТ) [1]. В соответствии с принятой в неврологии терминологией [2] расстройство двигательной функции в виде полного отсутствия произвольных движений вследствие нарушения иннервации соответствующих мышц называют параличом. При частичном нарушении двигательной функции говорят о парезе. Для периферических параличей (парезов) характерно сочетание следующих признаков: снижение объема активных движений и/или мышечной силы; снижение мышечного тонуса, физиологических рефлексов, замыкающихся на этих мышцах; атрофия или гипотрофия паретичных мышц; фасцикуляции (или фибрилляции) пораженных мышц [2]. Следовательно, для одновременной оценки всех вышеописанных симптомов необходимо применять комплекс соответствующих диагностических приемов. Методический аппарат по исследованию мышечной силы у мелких лабораторных животных наиболее разнообразен и популярен среди иностранных и отечественных ученых. Широко применяют методики подтягивания на горизонтальной перекладине, удерживания на решетке, измерение силы захвата с использованием специализированных приборов [1]. Несколько несоответствующими цели, однако, общепринятыми и традиционными способами оценки состояния мышечного тонуса (или миорелаксантного эффекта) в экспериментах являются методы вращающегося стержня («Ротарод»), бега на третбане, ипсилатеральный сгибательный рефлекс. Наиболее близкая к клинической практике методика пальпаторного исследования тонуса мышц живота у крыс выглядит излишне субъективной и трудно ранжируемой [2].

Вместе с тем в отечественной литературе представлено недостаточно методик исследования состояния двигательных рефлексов у грызунов как признаков периферического пареза. В связи с этим проведено сравнительное динамическое исследование информативности различных способов оценки двигательных функций крыс в эксперименте на модели острого тяжелого отравления блокатором натриевых каналов. Выбор тетродотоксина (ТТ) в качестве модельного токсиканта обусловлен особенностями его механизма действия, определяемыми наличием точек приложения на протяжении аксонов смешанных периферических нервов и на сарколемме поперечнополосатых миоцитов, что позволяет в течение короткого времени стабильно и с высокой повторяемостью вызывать у подопытных животных своеобразный синдром моторного дефицита (периферический парез) за счет неврального и мышечного компонентов.

Цель исследования – сравнить информативность исследования физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи шкалы отведения пальцев (ШОП) с другими рекомендованными методиками оценки периферического пареза.

Материал и методы

Эксперименты выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики и директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

Исследование проведено на 40 самцах беспородных крыс (питомник ФГУП «ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская обл., Россия). Животных содержали в стандартных условиях окружающей среды (фоторежим 12 ч свет/12 ч темнота, температура воздуха 22±3°С, влажность 55±10%). В качестве корма использовали «Корм для содержания лабораторных животных» ЛБК-120, приготовленный в соответствии с ГОСТом Р 50258-92. Воду в стандартных поилках со стальными крышками-носиками давали ad libitum. В качестве подстила использовали древесные опилки из лиственных пород деревьев. После завершения эксперимента животных подвергали эвтаназии в СО2-камере.

Периферический   парез   токсической   природы   моделировали   путем   подкожного   введения   раствора  ТТ (CAS  4368-28-9, Sigma Aldrich, Германия) в дозе ЛД16 (8,5 мкг/кг). В качестве растворителя использовали цитратный буфер (рН 4,5). Исследования выполняли в двух равных группах животных. Весь объем обследования животных проводили с периодичностью в 2 мин в течение первых 30 мин после введения ТТ.

Первую группу (n=20) оценивали с помощью КФТ (ШОП, «Ротарод», ООО «Нейроботикс», Россия), подтягивание на горизонтальной перекладине). Оценку по ШОП выполняли в соответствии с методикой R.S. Broide и соавт. [3] в собственной модификации. Оценивали выраженность рефлекторного разведения пальцев стоп при поднятии крысы за хвост на высоту 20 см над поверхностью и имитации падения. В норме крыса готовится к приземлению и широко расставляет грудные и тазовые конечности, разводя при этом пальцы. Здоровое животное способно удерживать такое положение достаточно длительно (>10 с), что соответствовало 0 баллов ШОП. На фоне токсического пареза выраженность данного рефлекса снижалась: первоначально крыса расставляла пальцы на несколько секунд, затем 1 или 2 пальца стопы оказывались прижатыми друг к другу – 1 балл, 3 пальца – 2 балла, 4 пальца – 3 балла, все 5 пальцев или полное отсутствие попытки разведения пальцев – 4 балла. Методику «Ротарод» (ООО «Нейроботикс», Россия) выполняли, измеряя время (с), в течение которого крыса способна передвигаться по вращающемуся со скоростью 5 об/мин стержню (в норме >120 с) [1]. Тест подтягивания на горизонтальной перекладине («перекладина») оценивали по способности крыс подтянуться из положения виса на передних конечностях и зацепиться нижней конечностью за перекладину в течение 20 с. Тест считался не выполненным (отрицательным), если животному требовалось больше времени или оно вовсе не удерживалось на перекладине [1].

С целью объективизации нарушений нервно-мышечного проведения и передачи второй группе крыс (n=20) выполняли электронейромиографию (ЭНМГ) икроножной мышцы (n. tibialis) правой тазовой конечности по методике, описанной ранее [4]. При одиночной стимуляции оценивали следующие параметры М-ответа: амплитуда, длительность, площадь, дистальная латентность. При ритмической стимуляции фиксировали характер и степень выраженности декремента площади М-ответов. Сравнение показателей проводили с данными, полученными заблаговременно до индукции отравления (фоновые значения). ЭНМГ-феномены количественно характеризовали степень снижения амплитуды последнего М-ответа относительно первого. При выявлении инкремента выполняли анализ по площади негативного пика для исключения псевдофасилитации. Колебания площади М-ответов в пределах 10% принимали за норму.

Связанные выборки сравнивали с помощью непараметрического критерия знаковых рангов Уилкоксона; бинарные данные определяли, используя точный критерий Фишера. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного интервала. Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft, США) в операционной среде Windows 7. За номинальный уровень статистической значимости принимали значение р< 0,05.

Результаты

Первые признаки отравления регистрировали у крыс в среднем через 14 (8–20) мин после подкожного введения ТТ. Они  выражались  в  усилении  активно-поискового  поведения  за  счет  ориентировочно-исследовательских компонентов (учащение  горизонтальных  перемещений,  принюхивание),  резко  сменявшихся  эпизодами  адинамии.  Затем (через 15–30 мин)  отмечали  снижение  спонтанной  двигательной  активности,  гипертонус хвоста,  признаки  нарастающего паралитического  синдрома. Обращали на себя внимание нарушения со стороны дыхательной системы: первоначально наблюдали увеличение частоты дыхания, затем (через 30–45 мин) – снижение глубины и частоты дыхания, участие вспомогательной мускулатуры, вынужденные позы. В течение первых 1,5–2 ч у всех животных отмечали задержку уринации и дефекации. Гибель 10 % (2/20) крыс регистрировали в течение 60–75 мин после аппликации ТТ.

У всех животных регистрировали типичную этапность паралитического синдрома на фоне отравления ТТ: в первую очередь проявлялись постуральные изменения в виде прекращения опоры только на дистальные отделы конечностей («опора на предплечья и голени»). Затем выявляли двустороннее снижение роговичного рефлекса, симметричный птоз, атаксию в виде заваливания в сторону и несколько асинхронного перемещения конечностей. При подъеме крысы за хвост отмечали уменьшение расстояния между разведенными конечностями, а затем и полную невозможность их разведения. Постуральные нарушения усиливались и к 40-й минуте животные были не способны удерживать голову достаточно приподнятой над поверхностью, полностью утрачивали опору на конечности. В ответ на болевые раздражения регистрировали попытки передвижения ползком, вытягивание конечностей в стороны под углом, близким к прямому от сагиттальной плоскости тела.

Интересно, что отсутствие способности удерживать разведенные пальцы в течение 10 с (снижение физиологического рефлекса) регистрировали у 40% уже через 8 мин после затравки, а к 16-й минуте состояние 100% крыс оценивали в 1 балл по ШОП, причем в этот период с помощью других КФТ не было выявлено значимых отклонений у абсолютного большинства животных. Через 20 мин после введения ТТ по данным всех применяемых КФТ было зарегистрировано развитие токсического периферического пареза (см. таблицу), характеристики которого продолжали ухудшаться в течение следующих 10 мин наблюдения.

  Основные результаты динамического клинико-инструментального обследования крыс после подкожного введения тетродотоксина в дозе 8,5 мкг/кг (n=40, Ме |Q1; Q3|)
 <b> </b>Основные результаты динамического клинико-инструментального обследования крыс после подкожного введения тетродотоксина в дозе 8,5 мкг/кг (<em>n</em>=40, Ме |Q1; Q3|)

ЭНМГ-исследование позволило выявить ТТ-индуцированное страдание функций периферической нервной системы в виде статистически значимых изменений основных параметров неврального проведения раньше, чем любой из КФТ. Так, длительность М-ответов увеличилась (р=0,04) уже через 6 мин после введения ТТ, амплитуда уменьшилась (р=0,01) через 10 мин, латентность увеличилась (р=0,03) через 15 мин. Нарастание декремента площади М-ответов как признак снижения надежности нервно-мышечной передачи достигло уровня статистической значимости через 8 мин.

Заключение

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что общепринятый в настоящее время методический аппарат экспериментальной оценки паралитического или миорелаксантного действия ксенобиотиков с помощью КФТ способен выявить нарушения нервно-мышечного проведения и передачи при достаточной их выраженности, когда по данным ЭНМГ уже наличествуют грубые изменения основных параметров. При этом рассмотренная адаптированная методика ШОП позволила обнаружить наиболее ранние признаки периферического пареза, что было хронологически сопоставимо с данными ЭНМГ. Оценка физиологического двигательного рефлекса у крыс при помощи ШОП обладает достаточно высокой информативностью и простотой тестирования, делая возможным выявление ранних признаков периферического пареза на фоне отравления ТТ. С целью дальнейшей валидации искомой методики целесообразно проводить эксперименты с применением нейротоксичных ксенобиотиков других химических групп и механизмов действия, а также изучить зависимость баллов по ШОП с дозами выбранных токсикантов.

Вклад авторов

Н.С. Ильинский – концепция, сбор и анализ данных, написание текста статьи.

М.А. Тюнин – научное консультирование, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

М.О. Матросова – сбор и анализ данных.

 

Сведения о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Список литературы

  1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. – М.: Гриф и К. – 2012. – 944 c. [Rukovodstvo po doclinicheskim issledovaniyam lekarstvennyh sredstv [Preclinical drug research guide]. Moscow: Grif i K, 2012. – 944 p. (In Russ.)].
  2. Одинак М.М., Дыскин Д.Е. Клиническая диагностика в неврологии. – СПб.: СпецЛит. – 2007. – 710 с. [Odinak M.M., Dyskin D.E. Klinicheskaya diagnostika v nevrologii [Clinical diagnostic in neurology]. Saint-Petersburg: SpecLit, 2007:710. (In Russ.)].
  3. Broide R.S., Rubino J., Nicholson G.S. et al. The rat Digit Abduction Score (DAS) assay: a physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis // Toxicon. – 2013. – Vol.71. – P. 18-24.
  4. Тюнин М.А., Ильинский Н.С., Матросова М.О. Диагностические возможности электромиографии при отравлениях фосфорорганическими соединениями // Medline.ru. – 2019. – 20(1). – С.254–260. [Tyunin M.A., Ilinskiy N.S., Matrosova M.O. Diagnosticheskie vozmozhnosti electromiografii pri otravleniyah fosfororganicheskimi soedineniyami [Diagnostic potential of electromyography in organophosphate poisoning]. Medline.ru. 2019. – 20 (1). – P. 254-260. (In Russ.)].

Вас может заинтересовать