Мирошников М.В., Макарова М.Н. Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 4: мыши . Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-03-08
В статье представлены результаты изучения и анализа референсных интервалов биохимических показателей крови мышей – одной из ключевых тест-систем, используемых на доклиническом этапе исследования лекарственных веществ. Данные получены в центре АО «НПО «Дом Фармации» в период с января 2018 г. по декабрь 2019 г. в ходе мониторинга здоровья животных. В проанализированном массиве находились данные от 100 самцов и 100 самок (небеременные и нерожавшие). В период адаптации и последующих экспериментов животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26оС, относительная влажность 40–75%, 12-часовой световой день. Кормление мышей проводили в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с применением принятых в испытательном центре аналитических методов. В сыворотке крови мышей определяли следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Данные, представленные в статье, указывают на необходимость периодического пересмотра референсных интервалов у лабораторных животных, используемых в экспериментах. Кроме того, результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают необходимость создания в каждом специализированном испытательном центре внутрилабораторных референсных интервалов не только для мышей, но и для каждого вида животных, применяемых в доклинических экспериментах, для более точной и детальной оценки клинического состояния исследуемых животных. Полученные референсные интервалы рассматриваемых показателей согласуются с аналогичными показателями из источников литературы, что косвенно свидетельствует об их надежности.
Этап доклинических исследований, направленный на оценку безопасности и изучение эффективности нового химического вещества [1, 2], является одним из наиболее важных при создании лекарственных средств. В связи с этим перспективность дальнейшего изучения свойств соединения будет зависеть от результатов, полученных на данном этапе исследования. В настоящее время остаются нерешенными важные вопросы, возникающие при проведении доклинической стадии изучения и требующие решения [3]. Одним из необходимых и определяющих этапов является подтверждение правильности использования методик измерения и интерпретации клинических лабораторных тестов, применяемых для изучения эффективности потенциального лекарственного агента на биоматериале от животных, а также периодическое обновление референсных интервалов биохимических показателей крови, мочи и т.д. Таким образом, выполнение данной процедуры – обязательный этап, отражающий качество работы клинической лаборатории и правильной интерпретации полученных результатов исследования [4].
Наиболее часто используемой тест-системой в доклинических исследованиях являются мыши [5]. Есть несколько моментов, связанных с этим аспектом: экономическая целесообразность – стоимость мышей относительно многих других лабораторных животных не требует больших денежных затрат, кроме того, их легко содержать. Они хорошо изучены, поэтому это сравнительно простая и понятная модель; эволюционно мышь близка к человеку, и ее эмбриональное развитие повторяет многие аспекты человеческого развития с точки зрения формирования структуры тела и активации генов [6]. Еще одним фактором является продолжительность жизни мыши – этот момент важен при оценке некоторых факторов, связанных с жизненным циклом в случае различных гериатрических исследований, с изменениями биохимических и иных показателей крови, мочи и др. Именно поэтому беспородных мышей и их биологический материал в настоящее время продолжают использовать в самых разнообразных исследованиях особенно в области токсикологии и фармакологии, направленных на изучение широкого диапазона свойств и активностей, таких как противоопухолевая [7], противодиабетическая [8], анксиолитическая [9], антидепрессивная [10] и др.
Важность и необходимость применения мышей в качестве тест-системы в доклинических исследованиях указывает на важность правильной интерпретации биохимических показателей крови животных, участвующих в эксперименте, которые указывают на нормальную работу внутренних органов и систем [6]. Для определения наличия либо отсутствия какого-либо патологического процесса (изменения биохимических показателей) у лабораторных животных необходимо иметь представление о вариабельности изучаемых показателей в данной популяции животных, т.е. о значениях референсных интервалов [11].
Цель работы – установить референсные интервалы у мышей – одной из самых востребованных тест-систем [6] для оценки основных биохимических показателей, используемых в доклинических исследованиях, и сделать анализ частоты статистических выбросов для этих показателей.
Данные получены в АО НПО «Дом Фармации» в период с января 2018 г. по декабрь 2019 г. в ходе мониторинга здоровья животных. Использованы животные интактных групп, возраст самцов и самок аутбредных мышей составлял 2–3 мес, масса тела – 25,3±3,8 г. В проанализированном массиве находились данные от 100 самцов и 100 самок (небеременные и нерожавшие). В период адаптации и последующих экспериментов животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26оС, относительная влажность 40–75%, 12-часовой световой день. Кормление мышей проводили в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с использованием общепринятых аналитических методов. В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (BioSystems, Испания) определяли следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин (ХС), триглицериды (ТГ), общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин (ОБ). Концентрацию ОБ определяли с помощью набора реактивов (Вектор-Бест, Россия), для определения уровня остальных аналитов использовали биохимические наборы (BioSystems, Испания). Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета программ Statistica10.0 (StatSoft, Россия), статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки, вид распределения определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола проводили с применением U-критерия Манна –Уитни.
Показатели, полученные в ходе мониторинга здоровья животных, были подвергнуты статистической обработке. Из общего массива данных были исключены статистические выбросы (СВ) для устранения аномальных значений, которые определяли отдельно для каждого рассмотренного показателя и пола по методу Тьюки. Были исключены данные, лежащие за пределами интервала Q3 и Q1 (1-го и 3-го квартилей). Межквартильный интервал IQR определяли как Q3–Q1. Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом [2]:
\[Q1–1,5•IQR~~и~~Q3+1,5•IQR \]
Данные о доле статистических выбросов по каждому показателю и выходящих за пределы референсных интервалов (РИ) представлены в табл. 1. Наиболее частые СВ при анализе сыворотки крови мышей отмечали в отношении ОБ (4,9%) и АСТ (1,9%) у самок, а также ХС (1,9%) у самцов.
Референсные интервалы для полу-ченных результатов в зависимости от вида их распределения рассчитывали следующим образом:
Хср.±1,96•SD – для нормального распределения;
2,5–97,5 процентили (‰) – для ненормального распределения (табл. 2).
Вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка. Дополнительно проводили сравнение между животными разного пола методами непараметрической статистики для ненормального распределения (U-критерий Манна–Уитни) и методами параметрической статистики для нормально распределенных данных (t-критерий Стьюдента).
В ходе исследования выявлено, что средняя концентрация креатинина в сыворотке крови самцов может достигать более высоких значений, чем у самок (р<0,05). Данное соотношение креатинина также характерно для мужчин и женщин: 62−132, 44−97 мкмоль/л соответственно [13, 14]. Содержание внутриклеточного фермента АЛТ статистически выше в сыворотке самцов мышей (р<0,05). В норме АЛТ у мужчин составляет до 41 Ед/л, у женщин – до 31 Ед/л [13], т.е. наблюдается схожая тенденция между двумя организмами. При анализе уровня ХС установлено значимое повышение показателя в крови самок (р<0,05), хотя у человека этот показатель в норме одинаков как для мужчин, так и для женщин – 3,1–5,2 ммоль/л. Полученный уровень ТГ у самцов-мышей статистически выше, чему у самок (р<0,05). Примечательно, что РИ рассматриваемого показателя коррелирует и с нормами у человека, а повышение ТГ у мужчин относительно женщин также может наблюдаться после 20-летнего возраста – 0,55–3,21 и 0,43–1,21 ммоль/л соответственно [13, 14]. Установлено, что концентрация ОБ в сыворотке самцов значимо выше относительно самок (р<0,05). При использовании параметрической статистики показано, что значение АСТ в крови самок-мышей статистически выше, чем у самцов. У людей наблюдается обратная картина – концентрация данного фермента у мужчин превышает его количество у женщин. При рассмотрении полученных показателей мочевины, ЩФ, общего белка, альбумина и глюкозы статистической разницы не зарегистрировано.
Выявленные данные указывают на схожесть двух биологических систем (мышь и человек) по некоторым биохимическим показателям, что еще раз подтверждает важность и необходимость правильной работы клинической лаборатории в доклинических экспериментах, а также периодического пересмотра референсных интервалов используемых животных.
При анализе данных литературы, направленных на изучение биохимических показателей мышей (табл. 3), и сопоставление их с полученными значениями настоящего исследовании показало, что рассчитанные диапазоны РИ сопоставимы с аналогичными, указанными в литературе, но присутствуют и расхождения. Так, уровень АСТ у самок превышает аналогичный публикационный пример – 46–79 Ед/л [15, 17]. Референсный интервал ЩФ шире представленных значений в литературе – 51–134 Ед/л [15]. Стоит отметить, что данные отличия могут быть обусловлены множеством различных независимых друг от друга факторов – возрастными особенностями, условиями содержания, стрессоустойчивостью отдельно взятого животного, индивидуальными особенностями, сезонностью исследования, аналитическими методами. По результатам сравнения РИ, полученных в исследовании, с показателем источников литературы [6, 11, 15–17] можно сделать вывод о сопоставимости данных, что косвенно свидетельствует об их степени достоверности.
Значения, полученные в ходе исследования, подтверждают необходимость создания в каждом специализированном испытательном центре внутрилабораторных баз данных РИ не только для мышей, но и для каждого вида животных, применяемых в доклинических экспериментах, для более точной и детальной оценки клинического состояния исследуемых животных.
Известно, что в состоянии здоровья полученные результаты исследования нестатичны и непостоянны, испытывают колебания, амплитуда и ритм которых отражают его связь с некоторыми физиологическими процессами, называемыми внутрииндивидуальной биологической вариацией (CVi). В популяции индивидуальные амплитуды вариации могут не совпадать, отражая различия между здоровыми индивидуумами. Поэтому суммарные пределы вариации аналита для данной популяции –межиндивидуальная вариация (CVg) – всегда шире пределов внутрииндивидуальной вариации. Для каждого исследуемого показателя были рассчитаны коэффициенты вариации (CV=SD/Хср.•100%), что в грубом приближении соответствует межиндивидуальной вариабельности (CVg) этих показателей в человеческой популяции. Сравнительные данные по 2 видам приведены в табл. 4.
При анализе полученных данных можно отметить сходную с человеком вариабельность по большинству исследованных показателей. Так, полученные значения межиндивидуальной вариации ЩФ, мочевины, АСТ, АЛТ, ХС и ОБ мышей сопоставимы с таковыми человека. Однако в то же время показатели CVg креатинина, глюкозы, альбумина и общего белка мышей более чем в 2 раза превышают значения для человека, а уровень триглицеридов на треть меньше. Полученная картина может быть связана как с видовыми особенностями, так и с методами измерения, что свидетельствует о целесообразности обязательного установления и планового пересмотра референсных интервалов.
Данные, представленные в статье, указывают на необходимость периодического пересмотра референсных интервалов лабораторных животных, используемых в экспериментах, а также подтверждают важность качественной оценки лабораторной диагностики доклинического этапа исследований. Полученные референсные интервалы рассматриваемых показателей коррелируют и соотносятся с аналогичными показателями из источников литературы, что подтверждает их достоверность. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови мышей и человека демонстрирует наличие видовых различий особенно для показателей, которые необходимо учитывать при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Мирошников М.В. – сбор и систематизация материала, статистическая обработка данных, анализ и интерпретация результатов, написание, редактирование текста.
Макарова М.Н. – идея, согласование окончательной версии статьи.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.