Экспресс-модификация теста «цилиндр» для оценки поведения молодых и старых самок мышей линии CBRB и BALB/C

Введение

Доля пожилых людей в человеческой популяции увеличивается, что ставит вопрос об активном долголетии и повышении качества жизни в старости. Это делает актуальными геронтологические исследования, в частности поиск адекватных мышиных моделей старения, в том числе с различными возраст-ассоциированными нейродегенеративными заболеваниями. Очевидно, что ни одна отдельно взятая мышиная модель не сможет адекватно воспроизвести все многообразие процесса старения. Поэтому, по мнению авторов, целесообразно использовать подходы сформулированной ранее индивидуализированной 3С-парадигмы проведения биомедицинских исследований [1]. Логично использовать комплекс мышиных моделей (сет, первая «С» 3С-парадигмы), описывающих типичные и специфические аспекты старения и различных возраст-ассоциированных заболеваний. Исследование включает несколько этапов, или стадий (стадии, вторая «С»), выполненных как кросс-секционным, так и лонгитюдным методом. В рамках новой парадигмы каждое животное рассматривается как пациент, на основании индивидуальных данных формируют стратифицированные выборки (стратификация, третья «С») вместо общепринятых рандомизированных. Поведенческие тесты не только характеризуют состояние центральной нервной системы, но и в большинстве своем являются неинвазивными, поэтому наиболее перспективным представляется их использование с целью накопления индивидуальных характеристик для реализации 3С-парадигмы в геронтологическом исследовании.

Тест «цилиндр» хорошо известен и входит во многие батареи поведенческих тестов [2]. Первоначально он был разработан в отделе физиологии Техасского университета в 2000 г. для выявления моторной асимметрии передних конечностей у крыс в индуцированной односторонним введением 6-гидроксидофамина (6-OHDA) модели болезни Паркинсона [3]; модель актуальна по сей день, том числе и на мышах [4]. В этом варианте теста животное помещали в прозрачный цилиндр и фиксировали прикосновения левой и правой передней лапы к стенке цилиндра во время стоек с опорой. Спонтанность поведения позволяла оценить и некоторые другие особенности поведения животного в цилиндре: в известных модификациях теста оценивали подволакивание лап [5], продолжительность груминга и длительность перемещений внутри цилиндра [6].

Показано, что у самок мышей оригинальной инбредной линии CBRB в возрасте 80 нед и старше постепенно спонтанно развивается ряд симптомов паркинсонизма, включая брадикинезию и тремор [7], тогда как мыши стандартной инбредной линии BALB/cJ характеризуются относительно высокой активностью, низким уровнем социальной адаптации и высоким – стереотипного поведения, что позволяет их использовать как одну из моделей заболеваний аутистического спектра [8]. Как известно, существует определенная связь между проявлением паркинсонизма и аутизма [9], и для пациентов с болезнью Паркинсона характерна симптоматика, сходная с проявлениями заболеваний аутистического спектра (тревожность, стереотипия и др.) [10]. Поэтому представляется интересным сравнить не только уровень моторики, но также проявления тревожности и стереотипии у мышей оригинальной линии CBRB с признаками паркинсонизма в старости и особенности спонтанного поведения животных стандартной линии BALB/c.

Цель работы – использование новой экспресс-модификации теста «цилиндр» (cylinder test) для оценки особенностей спонтанного поведения самок мышей в течение 30 с и выявления возрастных изменений поведения самок мышей линий CBRB и BALB/c.

Материал и методы

Работа выполнена на молодых и старых самках мышей линий CBRB-Rb(8.17)1Iem (CBRB) с гомозиготной транслокацией робертсоновского типа (центрическое слияние 8-й и 17-й хромосом) на генетической основе мышей линии CBA/CaLаc и стандартной линии BALB/cJCitMoise (BALB/c) из коллекции Е.В. Моисеевой в Институте биоорганической химии (ИБХ РАН, Москва). Исследования одобрены биоэтической комиссией ФГБУН ИБХ РАН (№ 291) и выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS №123), Директивой Европейского парламента и совета Европейского Союза 2010/63/ЕС о защите животных, используемых для научных целей.

В табл. 1 представлены возрастные группы и количество использованных животных. Старые мыши CBRB демонстрировали признаки паркинсонизма: брадикинезию, разную степень выраженности тремора задних конечностей (дебют – дрожание только стопы одной конечности, конечные стадии – дрожание всех отделов обеих конечностей), постуральную неустойчивость [9]. Мышей содержали в групповых клетках в конвенциональных (non-SPF) условиях при режиме 12 ч свет/12 ч темнота, температуре 22–25^оC, влажности 40–60%, кормили типовыми полноценными гранулированными кормами («Чара», ЗАО «Ассортимент-Агро», Россия), в качестве стандартной подкормки использовали зерновые каши с подсолнечным маслом и витаминами A, E, D, С; воду предоставляли без ограничений. Исследования проводили в промежутке времени между 18:00 и 22:00 ч. Каждая мышь со времени регистрации в племенном журнале имела индивидуальную метку и рассматривалась как ветеринарный пациент.

Адаптация мышей перед тестированием не проводилась. Для выполнения теста мышь помещали на дно прозрачного пластикового цилиндра высотой 120 мм и диаметром 110 мм с 8 равномерно распределенными по окружности отверстиями диаметром 8 мм в боковой стенке на высоте 20 мм от дна для выявления исследовательской активности (см. рисунок, а). В течение 30 с проводили видеозапись (Nikon Coolpix A, Япония) пребывания животного в цилиндре, на основании которой фиксировали вручную 15 видов активного поведения животного:

1) с – сидит, принюхивается, туловище неподвижно;

2) а – акинезия (замирание, туловище неподвижно);

3) л – движение налево;

4) п – движение направо (см. рисунок, б);

5) лп – движение головы влево и вправо при неподвижном туловище;

6) о – осматривается, подъем головы при неподвижном туловище;

7) в – движение тела вперед;

8) н - движение тела назад;

9) г – груминг (см. рисунок, б);

10) з – стойка на задних лапах без опоры на передние лапы;

11) т – стойка с опорой (см. рисунок, б);

12) д – исследование одного из отверстий (см. рисунок, б);

13) х – подъем хвоста;

14) к – акт дефекации;

15) м – акт мочеиспускания.

Кроме того, вычисляли долю (%) каждого вида активности в общем наборе зафиксированных активностей (в среднем 60±5 для каждой мыши). Каждое тестируемое животное помещали в новый цилиндр. После тестирования животные были возвращены в стоковую популяцию.

Соответствие параметров нормальному распределению оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Распределение всех измеряемых видов активности значимо отличалось от нормального, поэтому для оценки достоверности различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Статистический анализ проводили в программе Statistica 12. Изменения считали значимыми, если были выявлены достоверные различия как по общему количеству активностей, так и по доле различных видов активностей в общем наборе параметров.

Результаты и обсуждение

У мышей линии CBRB обнаружены изменения 8 из 15 показателей спонтанной активности в тесте «цилиндр» с возрастом (табл. 2): снижались количество стоек как с опорой на передние лапы, так и без опоры и активность движения вперед (p<0,01). Напротив, количество эпизодов неподвижности, поворотов головы влево-вправо (ЛП) при неподвижном туловище и груминга увеличивалось. Также уменьшалась с возрастом активность движения налево и направо. У мышей BALB/c существенно уменьшались с возрастом только число и доля стоек с опорой, тогда как только количество (но не доля) активностей ЛП достоверно уменьшалось с возрастом (см. табл. 2). Благодаря противоположной направленности возрастных изменений показателя ЛП у мышей CBRB и BALB/c обнаружены существенные отличия по этому виду активности как между молодыми, так и старыми особями этих двух линий (см. табл. 2).

Новая экспресс-модификация теста «цилиндр» значительно расширила количество фиксируемых показателей (15 вместо 1–4), некоторые из них, например норковая (исследовательская) активность, мочеиспускание и дефекация, никогда не фиксировали в стандартном тесте. При фиксации около 50–60 активностей за 30 с для каждого животного высчитывали как количество, так и долю данной активности среди всех учтенных показателей. Регистрация нетипичного спонтанного поведения, медианные показатели которого равны нулю, представлялась существенной для оценки состояния животного. Так, дефекация и движение назад во время 30-секундного теста являются относительно редко наблюдаемыми событиями, медианные значения которых всегда или почти всегда равны нулю, но достоверные различия по этим показателям между группами указывают на появление в одной из групп значимой подгруппы, для которой характерен этот тип поведения. Например, акты дефекации во время теста ни разу не наблюдали у молодых самок CBRB, в то время как подгруппа молодых BALB/с с этим паттерном составила 42%. Ситуация с движением назад обратная: молодые BALB/с ни разу не двигались назад, в то время как подгруппа молодых CBRB с движением назад составила 35%. В обоих случаях особенная подгруппа состоит менее чем из 50%, но это достаточно значимо, чтобы охарактеризовать линию. Важной особенностью предлагаемой экспресс-модификации теста «цилиндр» было существенное сокращение (30 с вместо 3 мин) времени наблюдения. Это связано в первую очередь с необходимостью оценить состояние 10–20 мышей разных групп в одно и то же время в рамках вечернего времени суток, чтобы циркадный ритм не внес искажений в результаты. Ранее мы показали, что различия по времени на несколько часов по мере приближения к ночи существенно влияют на поведение линейных мышей как исходно сумеречных животных (данные не показаны). Помимо этого, принципиальный авторский интерес прикован к регистрации первой реакции животного, неожиданно попавшего в неординарную ситуацию [11]. Основанием для этого служат особенности поведения пациентов с паркинсонизмом, а именно с инициацией движения [12].

Заслуживает внимания тот факт, что, несмотря на существенное сокращение срока наблюдения, полученные показатели спонтанного поведения в цилиндре согласуются с данными литературы. C.A. Kelm-Nelson и соавт. [13], изучая Pink1-/- генномодифицированную модель болезни Паркинсона, показали, что количество стоек с опорой у контрольных 3-месячных мышей составляет 58, а у 6-месячных – 31 при наблюдении в течение 3 мин, что соответствовало бы 10 и 5 стойкам за 30 с. Результаты у молодых животных совпадали с полученными данными для самок CBRB (см. табл. 2, активность «т»), тенденция к уменьшению количества стоек с возрастом также согласуется с наблюдениями на обеих линиях. E.N. Allen и J.E. Cavanaugh [14], изучая возрастную потерю моторной координации на самцах мышей C57BL/6, показали, что количество шагов задними лапами в 2-месячном возрасте равно 80 за 3 мин, а в 22-месячном – 40, что соответствует 13 и 6 шагам за 30 с соответственно. Для получения количества шагов на основании наших данных необходимо суммировать показатели 4 видов активности: «п», «л», «в», «н». Результаты сопоставимы с данными литературы: 9 шагов за 30 с у молодых и 5 шагов у старых самок CBRB. Кроме того, авторы работы [14] отметили увеличение времени груминга у старых животных по сравнению с мышами среднего возраста, что согласуется с полученными нами результатами для самок мышей CBRB (см. табл. 2, активность «г»). Интересен факт, что у сублинии BALB/c из коллекции Е.В. Моисеевой (ИБХ РАН, Москва) актов груминга не зарегистрировано. Т.Р. O’Leary и соавт. [15] изучали 7 поведенческих показателей в трех разных тестах на 15 инбредных линиях мышей, включая BALB/c. Так, в тесте «открытое поле» авторами было зафиксировано, что количество поз напряженного внимания у молодых самок линии BALB/c за 5 мин вдвое превышает аналогичный показатель у самок мышей линии C3H, что сопоставимо с соответствующей пропорцией количества подъемов головы у наших двух линий (см. табл. 2, показатель «о»). Количество стоек без опоры у самок BALB/c было в 5 раз меньше, чем у C3H, у которых оно было равно 3 в пересчете на 30 с [15]. Этот результат тоже сопоставим с нашим (см. табл. 2, активность «з»). Таким образом, экспресс-модификация теста «цилиндр» при регистрации не менее 50 активностей за 30 с для каждой мыши дает сопоставимые со стандартными тестами результатами.

Поведение молодых мышей двух разных линий отличается по многим параметрам. Молодые самки CBRB вдвое реже пребывали в неподвижности и вдвое чаще делают стойки с опорой, чем молодые BALB/c. В то же время молодые BALB/c чаще пребывали в нерешительности (активность ЛП) и в позе напряженного внимания (активность «о»). Таким образом, самки CBRB исходно более подвижные. Кроме того, наблюдаются отличия в двух редких паттернах, о которых сказано выше. Неудивительно, что животные этих двух достаточно разных линий в молодом возрасте ведут себя по-разному. Представляет интерес исчезновение характерных для линии особенностей поведения с возрастом и появление новых значимых различий.

Картины возрастных изменений спонтанного поведения мышей двух линий существенно отличались. Объединяло их только общее снижение количества стоек с опорой. Ни количество эпизодов неподвижности, ни количество движений в любую из сторон не претерпевает заметных изменений с возрастом у BALB/c. Поведение мышей CBRB, напротив, заметно меняется: уменьшаются горизонтальная активность и количество стоек, в то время как количество эпизодов неподвижности и груминга возрастает. Состояние неуверенности, когда мышь пребывает в нерешительности, в какую сторону начать движение (движение головой влево-вправо, ЛП), становится характерным для старых самок CBRB, в то время как у старых самок BALB/c оно встречается существенно реже, чем у молодых. Тревожность, отраженная в учащении эпизодов груминга («г»), и невозможность сделать выбор у старых самок с признаками паркинсонизма (увеличение доли активности ЛП) достаточно хорошо моделируют типичное поведение людей, страдающих паркинсонизмом [12]. A. Lieberman [16] обнаружил у 109 пациентов с болезнью Паркинсона связь между тревожностью, которую оценивал по шкале Гамильтона, и степенью выраженности застываний, оцениваемой с помощью специального опросника (FOG-Q). Известно, что застывания (freezing) при ходьбе встречаются преимущественно на развернутых и поздних стадиях болезни Паркинсона [12], что также было характерно именно для старых самок CBRB с симптомами паркинсонизма. В итоге экспресс-модификация теста «цилиндр» позволила подтвердить не только ранее обнаруженные особенности моторики самок авторской линии мышей CBRB [7], но и соответствующие немоторные изменения спонтанного поведения, характерные для пациентов с болезнью Паркинсона, что подтверждает использование мышей линии CBRB как адекватной модели паркинсонизма.

Разработанная модификация теста «цилиндр» дала возможность за 30 с получать адекватную и детальную оценку спонтанного поведения мыши и благодаря этому выявить возрастные изменения поведения. Предложенный набор показателей позволил охарактеризовать и качественно отличить друг от друга две линии мышей, что продемонстрировало скрытые возможности хорошо известного поведенческого теста и расширило область его применения в экспериментальной геронтологии.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Соловьева А.С.– выполнение поведенческих тестов, проведение статистической обработки полученных результатов, сбор, анализ и интерпретация результатов, написание текста статьи.

Аронов Д.А.– разведение мышей и поддержание коллекции, написание текста статьи.

Шубернецкая О.С.– участие в выполнении поведенческих тестов, критические замечания и участие в корректировке текста статьи.

Калинин М.А.– участие в выполнении поведенческих тестов и в поддержании жизнеобеспечения экспериментальных мышей.

Моисеева Е.В.– разработка дизайна экспериментов, анализ и интерпретация результатов, корректировка текста статьи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.