Муразов Я.Г. , Стуков А.Н., Змитриченко Ю.Г., Точильников Г.В. Методологические аспекты доклинической оценки противоопухолевой активности на примере оригинального цитостатика у крыс Wistar с трансплантируемой карциносаркомой Walker 256. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-01-02
В статье представлены основные количественные показатели, используемые для доклинической оценки фармакологической активности перспективных средств противоопухолевой терапии. В качестве примера приведены результаты изучения терапевтической активности отечественного цитостатического соединения хлонизол на модели трансплантируемого штамма-аллографта (карциносаркома Walker 256) у крыс линии Wistar. После подкожной трансплантации в бедро 0,5 мл 10% взвеси опухолевых клеток в 0,9% растворе натрия хлорида, 25 половозрелых крыс-самцов Wistar были рандомизированы на 2 группы: крысам 1-й (контроль; n=15) внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида; животным 2-й группы (хлонизол; n=10) внутрибрюшинно вводили тестируемое соединение в дозе 15 мг/кг (75% максимально переносимой дозы) в 0,9% растворе натрия хлорида. Введение осуществляли на 6-й день после трансплантации, когда опухоль определялась визуально и пальпаторно у всех животных. Во время эксперимента определяли следующие параметры: торможение роста опухоли (Т%), кинетику роста опухоли, общую выживаемость (ОВ) и индекс роста опухоли (ИРО). Под влиянием хлонизола наблюдалась значительная регрессия опухолей (непарный t-критерий; P <0,0001). К 15-му дню эксперимента Т% составило 99%. Введение хлонизола в дозе 15 мг/кг статистически значимо увеличивало медиану ОВ в сравнении с контролем с 15 дней до 60,5 дней (логранговый критерий; P <0,0001). Хлонизол достоверно снижал риск смерти животных на 84% по сравнению с контрольной группой (отношение рисков – 0,16; 95% доверительный интервал – 0,06–0,40). У 5 из 10 животных, получивших хлонизол, наблюдали полный регресс опухоли. Эти крысы пережили 90 дней без признаков рецидивов, что может рассматриваться как полное излечение. Разница с контролем статистически значима (точный критерий Фишера; P=0,0047). ИРО в группе тестируемого соединения был почти в 10 раз ниже, чем в контрольной группе. Полученные результаты свидетельствуют о высокой противоопухолевой активности хлонизола, что подтверждается его выраженными эффектами в отношении сформировавшейся опухоли. Описанные количественные параметры могут быть использованы для оценки противоопухолевой активности не только цитостатиков, но и иных средств лекарственной терапии злокачественных новообразований (таргетной, иммунотерапии).
Во всем мире онкологические заболевания остаются одной из главных причин ранней инвалидизации и смертности населения, в том числе трудоспособного возраста. В 2020 г. в мире выявлено 19,3 млн случаев рака и 10 млн случаев смерти от злокачественных новообразований [1]. Несмотря на активное внедрение в клиническую практику средств таргетной и иммунотерапии, химиотерапия остается важной опцией лекарственного лечения онкологических пациентов [2]. Типичный план разработки химиотерапевтического агента включает в себя ряд последовательных шагов, каждый из которых связан с затратами, которые обычно увеличиваются по мере разработки изучаемого соединения. Наиболее важная роль в этом направлении отводится доклиническим токсикологическим и фармакологическим исследованиям, которые проводятся до первого применения препарата у человека [3, 4]. Именно на доклиническом этапе решается вопрос, будет ли тестируемый объект передан в клинические испытания или снят с дальнейшей разработки. Это в конечном итоге скажется на экономических затратах разработчика в целом.
По разным причинам для изучения противоопухолевой активности в экспериментах in vivo наибольшее распространение получили модели опухолей у грызунов. Использование этих животных для оценки противоопухолевой активности подвергается критике из-за наличия случаев, когда соединение продемонстрировало эффективность у грызунов, но впоследствии было неэффективным у человека. Тем не менее существует >100 одобренных для клинического применения соединений, которые продемонстрировали эффективность на моделях опухолей у грызунов [5]. В рутинной доклинической практике для оценки эффективности химиотерапевтических агентов наиболее часто используются перевиваемые мышам и крысам опухолевые штаммы различного гистогенеза (сингенные и линейно-неспецифические) и ксенографты человека (PDX-модели (patient-derived xenograft) и клеточные линии). Для решения специальных задач могут быть использованы модели индуцированного канцерогенеза (химический, радиационный) или трансгенные животные [6]. Сингенные и линейно-неспецифические штаммы опухолей грызунов используются для оценки спектра противоопухолевой активности с определением оптимальной схемы лечения и отработки оптимальных фармакологических параметров (доз, режимов). Ксенографты человека используются для доказательства эффективности тестируемого соединения при тех или иных опухолях у человека, трансплантируемых иммунодефицитным мышам. Изучение влияния исследуемого агента на метастатический потенциал проводится с использованием моделей метастазирующих опухолей.
В статье представлены результаты изучения перспективного цитостатического агента (хлонизола), синтезированного в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, на модели трансплантируемой карциносаркомы Walker-256 у крыс Wistar. Описаны методологические аспекты оценки противоопухолевой активности.
Характеристика тестируемого объекта. Хлонизол (2-[3-(2-хлорэтил)-3-нитрозоуреидо]-1,3-пропандиол) относится к классу нитрозоалкилмочевин (НАМ) (рис. 1). Молекулярные механизмы действия НАМ связаны с алкилированием и карбомоилированием макромолекул продуктами биодеградации соединений. По уровню цитогенетической активности хлонизол превосходит все другие исследованные ранее препараты класса НАМ [7, 8].
Карциносаркома Walker-256 – один из наиболее часто используемых трансплантируемых штаммов в доклинических исследованиях. Впервые описана G. Walker в 1928 г. Карциносаркома Walker-256 возникла в результате спонтанного канцерогенеза в молочной железе у беременной крысы-альбиноса. Опухоль полностью регрессировала в период лактации, но выросла снова после отлучения потомства от груди [9]. После перевивки опухоль демонстрирует агрессивное биологическое поведение – способна к локальной инвазии и метастазированию, в т.ч. в кости [10]. С целью индукции солидной опухоли трансплантация штамма выполнялась под кожу боковой поверхности бедра в виде 10% опухолевой взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида. Объем введения взвеси – 0,5 мл.
Животные. Эксперимент был проведен на 25 половозрелых аутбредных крысах-самцах Wistar, полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл., Россия) с медианой начальной массы тела 320 г (min/max 305–381 г). Размер выборки был рассчитан на основании анализа выживаемости животных в предыдущем разведочном исследовании. Было достаточно по 10 животных в группе, чтобы отклонить нулевую гипотезу, о том, что выживаемость в контрольной группе и группе хлонизола одинакова с мощностью (1-β)=80% и α=0,05 [11]. Увеличение в группе контроля числа животных до 15 обусловлено дизайном всей программы фармакологических исследований хлонизола. Уход и все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС о защите животных, используемых для научных целей. Протокол был одобрен локальным этическим комитетом. Животные содержались в конвенциональном виварии в стандартных условиях: температура воздуха 20–24°C, относительная влажность 50–60%, 12-часовой цикл светлого/темного времени суток. Крысы получали полнорационный брикетированный комбикорм производства компании «Лабораторкорм» (Москва, Россия) и водопроводную питьевую воду ad libitum.
Дизайн эксперимента. На 6-й день после трансплантации опухоли животные были рандомизированы на две группы: крысам 1-й (контроль; n=15) внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида; животным 2-й группы (хлонизол; n=10) внутрибрюшинно вводили тестируемое соединение в дозе 15 мг/кг (75% максимально переносимой дозы) в 0,9% растворе натрия хлорида. Введение препаратов на 6-й день после трансплантации опухоли было необходимо для оценки эффектов хлонизола на сформировавшуюся опухоль.
Оцениваемые параметры. Наблюдение за животными-реципиентами осуществляли в течение всего периода жизни. При оценке противоопухолевого эффекта хлонизола использовались следующие критерии:
1. Объем опухоли и кинетика роста. Объем опухоли в каждой временнóй точке определяли по формуле:
\[V = \frac{A\cdot B^{2} \cdot \pi }{6} = \frac{A\cdot B^{2}}{2}\]
где А – наибольший диаметр опухоли, В – перпендикулярный ему диаметр.
2. Торможение роста опухоли (Т%) оценивали по формуле:
\[T\% = \frac{V_{k} - V_{э}}{V_{k}} \cdot 100 \]
где VK – средний объем опухоли у крыс контрольной группы, VЭ – средний объем опухоли у крыс экспериментальной группы, получавших хлонизол; Т% – процент торможения роста опухоли.
3. Индекс роста опухоли (ИРО). Является интегральными показателем противоопухолевой активности с учетом не только выраженности противоопухолевого эффекта, но и его устойчивости [12]. ИРО определяли в процентах по формуле:
\[ИРО = \frac{S_{э}}{S_{k}}\cdot 100 \]
где Sэ – площадь под кинетической кривой роста опухоли в группе крыс, получавших терапию,
a SК – площадь под кинетической кривой роста опухоли крыс контрольной группы.
Для измерения площади под кинетической кривой роста опухоли использовали метод трапеций, базирующийся на формуле:
\[S = \sum_{i=1}^{n-1}\frac{V_{i} + V_{i+1}}{2}\cdot t_{i} = \frac{V_{1} + V_{2}}{2}\ \cdot t_{1} + \frac{V_{2} + V_{3}}{2}\ \cdot t_{2} + \cdots \frac{V_{n-1} + V_{n}}{2}\ \cdot t_{n-1} \]
где Vi – объем опухоли в соответствующем измерении под номером i; n – число измерений; время в днях: t1 – между первым и вторым измерениями, t2 – между вторым и третьим измерениями, tn-1 – между предпоследним и последним измерениями.
4. Общую выживаемость (ОВ) определяли как время со дня перевивки опухоли до дня гибели животного. Критерием полного излечения считали продолжительность жизни >90 дней.
Статистический анализ. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета GraphPad Prism версии 8.0 и jamovi версии 1.6.12. Количественные данные представлены в виде среднего (±стандартная ошибка среднего, SEM). Критерий Левина использовали для оценки равенства дисперсий. Непарный t-критерий Стьюдента использовали для сравнения количественных данных. Для сравнения категориальных переменных применяли точный критерий Фишера. Данные по ОВ животных графически представлены в виде кривых Каплана–Мейера. Для сравнения кривых ОВ применяли логранговый критерий. Все критерии были двусторонними. Различия считались статистически значимыми при р <0,05. Отношение рисков (Hazard Ratio, HR) и границы его 95% доверительного интервала (ДИ) рассчитывали с помощью регрессионной модели Кокса.
В данной серии экспериментов изучали активность хлонизола в дозе 15 мг/кг, что составляет 75% от максимально переносимой дозы (МПД). МПД у крыс при однократном введении составила 20 мг/кг [13]. Для оценки влияния хлонизола на развившуюся опухоль лечение начинали на 6 день после трансплантации карциносаркомы Walker-256.
Профиль кинетической кривой демонстрировал выраженную противоопухолевую активность хлонизола в сравнении с контролем (рис. 2).
Под влиянием хлонизола наблюдалась значительная регрессия опухолей (табл. 1), которая у 5 из 10 животных оказалась полной и сохранялась в течение 90 дней наблюдения.
Результаты определения площади под кинетической кривой роста опухоли и ИРО представлены в табл. 2. Установлено, что в группе хлонизола эти показатели значимо были ниже в сравнении с контрольной группой.
Кривые общей выживаемости крыс в эксперименте представлены на рис. 3. Введение хлонизола в дозе 15 мг/кг статистически значимо увеличивало медиану ОВ в сравнении с контролем с 15 дней до 60,5 дней (логранговый критерий; P <0,0001). Хлонизол достоверно снижал риск смерти животных на 84% по сравнению с контрольной группой (HR – 0,16; 95% ДИ – 0,06–0,40). К 24-му дню после перевивки все крысы контрольной группы (n=15) погибли от прогрессирования опухоли, все крысы, получившие хлонизол (n=10), к этому сроку оставались живы. У 5 из 10 животных, получивших хлонизол, опухоли полностью регрессировали. Эти крысы пережили 90 дней без признаков рецидивов, что может рассматриваться как полное излечение. Разница с контролем статистически значима (точный критерий Фишера; р=0,0047).
В представленной работе описаны основные количественные показатели, используемые для оценки эффективности химиотерапевтических агентов на примере оригинальной молекулы и одного перевиваемого штамма-аллографта у крыс. Эти показатели могут быть использованы и для оценки эффективности других перспективных противоопухолевых агентов (таргетных препаратов, средств иммунотерапии). Карциносаркома Walker-256 у крыс обладала высокой чувствительностью к хлонизолу. При позднем начале лечения (на 6 день после трансплантации), когда у всех животных уже имелись сформировавшиеся опухоли, введение хлонизола привело к излечению 50% животных. Результаты проведенного эксперимента дополняют ранее полученные сведения о высокой противоопухолевой активности хлонизола на моделях трансплантируемых опухолей.
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Муразов Я.Г. – концепция, сбор и систематизация материала, написание, редактирование текста статьи.
Стуков А.Н. – сбор и систематизация материала, критические замечания.
Змитриченко Ю.Г. – сбор и систематизация материала.
Точильников Г.В. – редактирование текста статьи.