Кательникова А.Е., Крышень К.Л., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Экспериментальные модели острого бронхита на животных. Лабораторные животные для научных исследований. 2019; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2019-01-10
Острый бронхит (ОБ) в связи с высокой заболеваемостью относится к наиболее актуальным проблемам современной пульмонологии. Поэтому идет постоянный поиск и разработка новых лекарственных средств для лечения ОБ. Для регистрации новых фармакологических субстанций и препаратов на их основе необходимы экспериментальные модели, позволяющие оценить специфическую фармакологическую активность. В настоящем обзоре всесторонне рассмотрены используемые для моделирования ОБ виды животных, индукторы патологии и их механизмы повреждения ткани, а также оцениваемые показатели. Поиск статей, опубликованных на английском языке, осуществляли по базам данных Google Scholar и PubMed (1961–2018), на русском языке – по базе данных научной электронной библиотеки eLIBRARY.RU; 43 работы мы расценили как приемлемые для включения в настоящий обзор. Несмотря на то, что обзор посвящен моделированию ОБ, сюда вошли статьи, посвященные экспериментальному моделированию острого трахеобронхита, острого бронхолегочного воспаления, острого повреждения легких и острого респираторного дистресс-синдрома, поскольку для моделирования данных патологий часто используют одинаковые индукторы патологии и пути введения. Согласно данным, приводимым в рецензированных статьях, для моделирования острого повреждения нижних дыхательных путей и легких в основном используют мышей и крыс. Наиболее популярными индукторами моделирования острой бронхолегочной патологии являются липополисахарид и сигаретный дым. Чаще всего для оценки повреждения у животных рассматривают такие показатели, как анализ бронхоальвеолярного лаважа, гистопатология и измерение отека в разные моменты времени после индукции патологии. На основании исследований, целью которых являлось получение воспаления в дыхательных путях животных, подтверждено, что невозможно получить воспалительное повреждение только в бронхах, в любом случае вовлекается легочная ткань и наоборот. Этот материал поможет исследователям выбрать подходящий метод для индукции ОБ у животных и информативные показатели для разработки протокола исследования.
По данным Федеральной службы государственной статистики, в России в 2017 г. заболевания органов дыхания у взрослых по частоте встречаемости заняли 1-е место и составили 353,5 случая на 1000 населения [1]. Самым распространенным заболеванием дыхательных путей является острый бронхит (ОБ). По результатам эпидемиологических исследований именно ОБ выступает одной из наиболее частых причин обращения пациентов за медицинской помощью в амбулаторной практике [2].
С целью регистрации новых лекарственных средств (ЛС), планируемых для лечения ОБ у человека, необходимы экспериментальные модели, позволяющие провести оценку специфической фармакологической активности препарата. Для моделирования ОБ используют разные виды животных (крыс, мышей, карликовых свиней, морских свинок, собак и т.д.), разные индукторы патологии и оцениваемые показатели. Указанное выше всесторонне рассмотрено в настоящем обзоре, который поможет исследователям выбрать подходящий метод для индукции ОБ у животных и информативные показатели для разработки протокола исследования.
Стратегия поиска. Поиск статей, опубликованных на английском языке, осуществляли по базам данных Google Scholar и PubMed (1961–2018), на русском языке – по базе данных научной электронной библиотеки eLIBRARY.RU. Поиск проводили по следующим семантическим полям: острый бронхит, животные, крысы, мыши, воспаление дыхательных путей, бронхолегочное воспаление, сигаретный дым, липополисахарид (ЛПС).
Критерии включения:
Из 646 предложенных статей теме обзора соответствовало 43. Несмотря на то, что обзор посвящен моделированию ОБ, сюда были включены статьи, посвященные экспериментальному моделированию острого трахеобронхита, острого бронхолегочного воспаления, острого повреждения легких и острого респираторного дистресс-синдрома, поскольку для моделирования данных патологий часто используют одинаковые индукторы патологии и пути введения. Кроме того, эндотрахеальное введение индуктора патологии не может изолированно поражать только бронхи или только легкие.
Наиболее популярными индукторами моделирования острой бронхолегочной патологии являются ЛПС и сигаретный дым, направленные на воспроизведение известных факторов риска – инфекция и курение (включая пассивное).
В табл. 1–4 представлены индукторы для моделирования острого повреждения нижних дыхательных путей и легких на разных видах животных. Грызуны и мелкие животные широко используются для моделирования патологий дыхательной системы, хотя есть много ограничений, включая анатомические различия и общие функции легких. Несмотря на эти ограничения, уровень, до которого они воспроизводят патологию или восстановление ткани, считается достаточным для ответа на многие фундаментальные вопросы. В то же время модели на крупных животных важны на доклинических стадиях для воспроизведения сложных клинических состояний. Крупные животные больше похожи на людей с точки зрения архитектуры легких, количества долей и характера ветвления дыхательных путей [3].
Крысы. Крыса наиболее часто используется, как в биомедицинских исследованиях по изучению токсичности лекарственных препаратов. По сравнению с другими лабораторными животными, крысы воспроизводят многие признаки аллергии дыхательных путей и аллергической астмы, которые схожи с клиническими признаками у человека. Одно из главных преимуществ, что эти данные могут быть экстраполированы из экспериментальных исследований на человека [3]. Крысы используются для моделирования острых и хронических патологий нижних дыхательных путей и легких [4–17]. Одним из важных ограничений при этом является проблема воспроизведения структуры и патологии малых дыхательных путей, так как крысы имеют только несколько уровней ветвления дыхательных путей, что сильно отличается от структуры дыхательных путей человека [18]. Из-за недостатка бокаловидных клеток у крыс регистрируют слабый метапластический ответ [19].
Мыши. В течение многих лет мыши были часто используемой тест-системой для моделирования заболеваний человека, поскольку их физиология и генетика близки человеку [20–22]. Генетический материал мыши подобен генетическому материалу человека на 99% [21, 23]. Таким образом, мышь обеспечивает превосходный молекулярный/генетический инструментарий для фармакологических исследований [3]. Их небольшой размер делает возможным проведение крупномасштабных/высокопроизводительных исследований, а также является экономически выгодным. В настоящее время иммунная система мышей очень хорошо изучена. Доступность инбредных штаммов и специфических генов, которые могут быть направлены на оценку функции конкретного гена при повреждении, позволяет широко использовать мышей в исследованиях с моделированием патологий дыхательной системы [24–47] (см. табл. 2).
Морские свинки. Роберт Кох в 1882 г. был первым, кто использовал морских свинок в качестве хозяина для бактериальных инфекций [48, 49]. С тех пор они служат в качестве лабораторных животных, хотя и не так часто, как крысы и мыши. В основном морские свинки задействованы в исследованиях анафилаксии, гнотобиотиков, астмы, иммунологии, инфекционных и пищевых заболеваний и отологии [3]. Дыхательные пути морских свинок очень чувствительны к аллергенам, как и у людей. В настоящее время их обычно применяют для тестирования новых препаратов, направленных на лечение астмы. Также морских свинок выбирают в качестве тест-системы для изучения туберкулеза из-за их высокой восприимчивости к инфекции. Они показывают отличную реакцию на стандартные пероральные химиопрепараты и вакцины. Морские свинки, инфицированные туберкулезом, считаются «золотым стандартом» для изучения различных методов доставки лекарств и вакцин и оценки их безопасности. Хемокины и цитокины являются основными регуляторами иммунных реакций на туберкулез и образование гранулемы, как у людей, так и у морских свинок. Поэтому морские свинки представляют собой отличную модель для понимания иммунологических реакций на туберкулез [49, 50].
Собаки. Собак используют в качестве тест-систем в ряде исследований в области ортопедических и зубных имплантатов, систем доставки лекарств, фармакокинетики и медицинской визуализации. К их уникальным преимуществам относят спокойный характер, хорошо развитые когнитивные функции и способность к обучению [3]. Для собак доступен широкий спектр медицинских приборов и процедур. Интубацию дыхательных путей у собак легко проводить из-за относительно короткой формы рта и его способности широко открываться. Поэтому на собаках изучают модели как острого, так и хронического повреждения нижних дыхательных путей и легких [52–55]. Хотя сходство дыхательной системы человека с собачьей позволяет использовать их для оценки новых лекарственных форм и вариантов лечения, но здесь возникают этические проблемы. Кроме того, существует значительная вариабельность беспородных собак, хотя в некоторых исследованиях желательно, чтобы собаки разных пород давали больше информации о патогенезе и эффективности лечения. Эта гетерогенность вносит сложности с точки зрения анализа полученных результатов [3].
Карликовые свиньи. Свиньи имеют большие преимущества, что позволяет широко использовать их в качестве моделей в доклинических исследованиях во всем мире. Физиология, иммунология, морфология органов и метаболизм свиньи практически идентичны человеку [3, 56]. Более того, последовательности генома свиньи уже выявлены и могут быть сопоставлены с человеческими аналогами [57]. Хотя большинство медицинских устройств для человека можно применять у свиней, некоторые процедуры, включая интубацию трахеи, у свиней сложнее, чем у других животных или человека [58]. Большинство исследований в области дыхательной системы требуют интубации животного, которое у свиней осложняется из-за длинного и узкого рта, а также нет возможности открыть его так широко, как у собаки. Кроме того, их гортань маленькая по сравнению с размером их тела, что делает интубацию еще сложнее. Свиньи также чувствительны к любым устройствам или процедурам, проводимым внутри полости рта, поэтому во время интубации может развиться ларингоспазм [59].
ЛПС, или эндотоксин, – составная часть наружных клеточных мембран грамотрицательных бактерий. ЛПС постоянно выделяется и циркулирует в окружающей среде. При попадании в организм ЛПС действует как провоспалительный агент [60, 61]. Например, при остром вдыхании ЛПС у человека появляются такие клинические симптомы, как лихорадка, озноб и бронхоспазм [61, 62]. Распознавание ЛПС опосредовано Toll-подобным рецептором типа 4 (TLR4). Это распознавание включает в себя связывание ЛПС с ЛПС-связывающим белком, а затем с CD14, который ассоциируется с комплексом, включающим TLR4 и MD2. Образование TLR4-центрированного рецепторного комплекса с ЛПС индуцирует сильный иммунный ответ, который способствует секреции провоспалительных цитокинов (IL-1b, IL-6, IL-8 и TNF-α) по пути MyD88. Передача сигналов ЛПС также включает MyD88-независимый каскад, который обеспечивает экспрессию IFN-индуцибельных генов [60, 63]. В результате активируются все основные клеточные функции, связанные с развитием фагоцитоза и представлением антигенов, продукцией NO и свободных форм кислорода, синтезом низкомолекулярных медиаторов воспаления и группы провоспалительных цитокинов, к которым относятся интерлейкины: IL-1, IL-6, IL-18, TNF-α, интерфероны I типа, хемокины [63]. За счет того, что ЛПС является мощным активатором врожденного иммунного ответа, его часто используют для моделирования патологий со стороны дыхательной системы [4–8, 24–36, 58]. Патологические изменения в нижних дыхательных путях и в легких на фоне введения ЛПС представлены в табл. 1, 2 и 5.
Сигаретный дым. Курение табака является важным фактор риска ОБ и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [55]. В табачном дыме содержатся активные формы кислорода, которые повреждают эпителиальные клетки дыхательных путей, вызывая перекисное окисление липидов клеточных мембран, активируют окислительно-чувствительные клеточные пути и вызывают повреждение ДНК. Компоненты табачного дыма активируют внутриклеточные сигнальные каскады эпителиальных клеток, которые приводят к активации воспалительных генов за счет индукции АР-1 и NF-kB. Поэтому в мокроте курильщиков обычно повышена продукция цитокинов типа IL-1β, TNF-α, IL-6, а также IL-8 – с дальнейшим увеличением при обострении [64, 65].
Сигаретный дым индуцирует многие признаки острого бронхита и воспаления легких, включая инфильтрацию слизистой бронхов, изменения уровней провоспалительных цитокинов, легочную инфильтрацию макрофагами и нейтрофилами, фиброз дыхательных путей и эмфизему [3, 9, 37–44, 55]. Однако в настоящее время не существует стандартизированного метода или протокола исследования по воздействию сигаретного дыма на животных, что ограничивает его использование в качестве индуктора патологии. В эксперименте должны рассматриваться стандартизированные сигареты для доставки точной дозы взвешенных или твердых частиц, включая никотин и окись углерода, ведь тип сигарет, создающих дым (коммерческие сигареты или исследовательские сигареты, с фильтром или без него), компоненты сигаретного дыма, используемые для воздействия, системы доставки («все тело» vs «только нос») и, что наиболее важно, доза дыма – важные определяющие факторы [55, 66]. Существуют два метода экспозиции сигаретного дыма: метод называемый «только нос», когда дым подают прямо к носу и пасти животного, и окуривание «всего тела» при помещении животного помещают в камеру, наполненную контролируемой концентрацией дыма. Оба метода широко практикуются и показывают сходные результаты в отношении наличия в БАЛ популяций воспалительных клеток, уровней цитокинов и терапевтического ответа [67, 68].
Тяжелые металлы (кадмий, никель). Кадмий – токсичный элемент, представляющий серьезную опасность для человека и животных. Избыток кадмия нарушает усвоение и обмен других микроэлементов (Zn, Cu, Se, Fe), что может вызывать их дефицит. Он вытесняет кальций и замещает цинк в составе биомолекул. Накапливаясь в почках, кадмий вызывает почечный кальциевый ацидоз, вследствие чего могут развиваться 2 формы остеомаляции: кальципеническая и фосфопеническая [69].
В открытом доступе обнаружены 2 статьи с описанием использования кадмия в качестве индуктора ОБ. По результатам исследований кадмий вызывал не только воспаление в бронхах, но и в легочной ткани, т.е. сочетанное воспаление. Признаков поражения печени и почек в экспериментах при ингаляционном способе доставки кадмия не обнаружено [53, 54].
По данным литературы воздействие растворимых и нерастворимых соединений никеля активирует в организме HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) [70, 71]. Увеличение экспрессии HIF-1 приводит к повышению экспрессии генов, которые обеспечивают адаптацию клеток к гипоксии [70, 72]. Ингаляция хлоридом никеля в течение 5 дней приводит к развитию у крыс острого бронхиолита [10]. Хроническое воздействие никеля на крыс приводит к гиперплазии и фиброзу легочной ткани [70, 73].
Мелфалан. Мелфалан, или L-фенилаланин мустард, сегодня широко используется в качестве противоопухолевого препарата, это высокотоксичный бифункциональный алкилирующий агент [46]. Воздействие мелфалана в высоких дозах вызывает апоптоз и некроз, что приводит к серьезным повреждениям тканей, как в эпителии бронхов, так и в эндотелии [74]. Воздействие низких доз аналогов мелфалана с раздражающим действием может активировать внутриклеточные пути передачи сигнала в клетках дыхательного эпителия, приводящие к провоспалительному ответу [45, 46, 75]. Есть данные, что в дополнение к активации таких путей как стресс-индуцированной клеточной стимуляции, воздействие алкилируещего агента (так называемого «фосфорамид мустард») усиливает внутриклеточный окислительный стресс и механизмы антиоксидантной защиты [46].
Сернистый ангидрид (SO2). Для моделирования ОБ на крысах, мышах, морских свинках и собаках в качестве провоспалительного агента использовали длительную экспозицию SO2 [11, 12, 51, 76–79]. SO2 – раздражитель верхних дыхательных путей; при вдыхании в высоких концентрациях вызывает нейтрофильное воспаление и гиперсекрецию слизи дыхательных путей [12]. Механизм SO2-индуцированной секреции слизи и воспаления включает такие нейрогенные вещества, как NK-1 и вещество P [78]. Предполагается также участие окислительного стресса [12]. По результатам ряда экспериментов воспаление дыхательных путей у мышей [80] и повышенная гиперреактивность дыхательных путей у крыс [12] были связаны с увеличением экспрессии хемокинов на фоне экспозиции SO2.
Таким образом, эффекты, вызванные SO2 у крыс, коррелируют с симптомами бронхита у людей, но их тяжесть и продолжительность отличаются. Вполне вероятно, что механизм, с помощью которого SO2 вызывает бронхит, отличается от причины возникновения бронхита у людей, причем у крыс возможно лишь ограниченное повреждение.
Азотная кислота. Модель с использованием азотной кислоты впервые была описана T. Moran и R. Heelstrom [81]. Такой способ применения азотной кислоты – это дешевый, быстрый и безопасный метод модели облитерирующего бронхиолита. Экспериментальный облитерирующий бронхиолит, индуцированный азотной кислотой, был продемонстрирован ранее у кроликов и хомяков [13]; при гистологическим исследовании были выявлены сходные изменения с описанными в аналогичной модели с введением аденовируса и гистологической картиной облитерирующего бронхиолита у детей.
Формалин. По данным литературы применение в качестве индуктора воспаления раствора формалина обосновано быстротой развития воспаления на прилежащие ткани и с сохранением признаков воспаления в течение 7 дней [82, 83]. Например, в результате введения формалина в носовые ходы у животных развиваются такие симптомы, как затрудненное дыхание, чихание, покраснение слизистой, серозные и гнойные выделения, что характерно для клинической картины острого риносинусита у человека. На микроскопическом уровне у животных развиваются: полнокровие, очаговый некроз слизистой оболочки носовых ходов, гиперплазия, выраженная инфильтрация лейкоцитами и мононуклеарами, увеличение количества бокаловидных клеток [82, 83]. Эндотрахеальное введение формалина приводит к появлению патологических изменений в месте контакта с тканями с развитием таких форм острого бронхита, как катаральный и катарально-гнойный [14].
Живичный скипидар. Эндотрахеальное введение скипидара сопровождается патологическими изменения в месте введения и переходом на легочную ткань, что обусловлено физико-химическими свойствами скипидара [15, 16]. На фоне введения скипидара в лимфоцитах крови и ткани легких крыс возникает энергодефицит.
Вирусы и бактерии в комбинации с сигаретным дымом. Вирусы и бактерии в качестве индукторов позволяет воспроизвести ОБ близкий по течению к клиническому инфекционному бронхиту у человека [17, 47]. В структуре патогенеза вирусных респираторных инфекций выделяют 4 последовательно развивающиеся фазы вне зависимости от вида вируса. Это фаза внедрения и репродукции возбудителя – вначале в эпителиальных клетках респираторного тракта, а затем — в кровяном русле, с развитием реакции со стороны альвеолоцитов и макрофагов. Фаза развития токсических или токсикоаллергических реакций сопровождается повышением проницаемости капилляров и формированием микроциркуляторных нарушений [84]. В инициации воспаления в ответ на внедрение бактерий одна из ведущих ролей принадлежит TLR, которые реагируют путем активации внутриклеточных сигнальных путей, изменяя экспрессию генов [85].
Существует много экспериментальных моделей воспаления в нижних дыхательных путях на разных видах животных, включая мелких и крупных. Однако требуется стандартный протокол, который бы определял параметры, подлежащие оценке, и необходимые процедуры. В настоящем обзоре представлена информация о способах индукции ОБ у разных видов животных, различных методах, используемых для этой цели, и различных параметрах, которые могут быть оценены. К наиболее распространенному индуктору моделирования острой бронхолегочной патологии относится ЛПС – универсальный провоспалительный агент. С помощью ЛПС индуцируются острые процессы в бронхолегочной системе на разных уровнях, что применимо как к индукции ОБ, так и индукции воспаления в легких, респираторного дистресс-синдрома и бронхиолита. Индукция ОБ сигаретным дымом по частоте встречаемости занимает 2-е место и является самостоятельным направлением. В отличие от ЛПС при воздействии сигаретным дымом характерен быстрый переход острого воспаления в подострое с затрагиванием легочной ткани. Поэтому сигаретный дым как индуктор наиболее подходит для моделирования хронической патологии дыхательных путей и в частности для хронической обструктивной болезни легких. Как свидетельствуют полученные данные, невозможно получить воспалительное повреждение только в бронхах, так или иначе вовлекается и легочная ткань. Данный факт подтверждается в исследованиях, целью которых – получение воспаления в дыхательных путях животных [9, 53, 54, 58]. Тем не менее к индукторам, способным в большей степени повреждать бронхи, чем легкие, можно отнести такие воспалительные агенты, как формалин, тяжелые металлы и кислоты, так как они оказывают выраженное местно-раздражающее действие. Кроме того, формалин в качестве провоспалительного агента применим для моделирования картины характерной для бронхита, возникающего после гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. Экспозиция тяжелыми металлами и кислотами подходит для воспроизведения профессиональных заболеваний дыхательной системы. В экспериментах на животных наиболее часто в качестве тест-системы применяются мелкие лабораторные животные крысы и мыши, но на заключительных стадиях доклинических исследований целесообразно привлечь крупных животных – карликовых свиней и собак. Однако использование последних ограничивается с этической точки зрения. Эта информация полезна для разработки протоколов по изучению специфической фармакологической активности новых препаратов направленных на лечение заболеваний нижних дыхательных путей.