Вариабельность биохимических показателей крови и установление референтных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 12: обыкновенные игрунки

Введение

Обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus) — актуальная модель приматов, широко используемая в доклинических исследованиях, направленных на изучение фармакокинетики, фармакодинамики и фармакологической безо­пасности новых лекарственных веществ. Кроме того, игрунки широко задействованы в исследованиях, связанных с вопросами старения, с изучением аутоиммунных и метаболических нарушений, а также заболеваний репродуктивной и центральной нервной систем [1–3]. Несмотря на ограниченное их использование по сравнению с яванскими макаками, у игрунок есть определенные преимущества, выделяющие их на фоне других лабораторных животных. Обыкновенные игрунки просты в обращении и физиологически схожи с человеком. Самки становятся репродуктивно зрелыми в 1,5 года, а размножающиеся пары производят потомство обычно в течение 5–7 лет. У обыкновенных игрунок в среднем 3 помета за 2 года с 2–4 особями в помете по сравнению с 1 детенышем за 1–2 года у яванских макак, конечно, при условии соблюдения оптимальных условий содержания. Данная физиологическая особенность позволяет использовать игрунок в исследованиях репродуктивной токсичности и эмбриотоксичности [4, 5]. У мармозеток относительно короткий жизненный цикл — 10–15 лет, что можно использовать в исследованиях хронической токсичности веществ, изучении механизмов старения и социального поведения, которые схожи с человеческими. В отличие от грызунов у рассматриваемого вида приматов и человека наблюдается высокая степень гомологии иммуноглобулинов и Т-⁠клеточного рецептора, что делает этот вид подходящей тест-⁠системой для иммунологических исследований [6–9], например, в экспериментах с моделированием ревматоидного артрита, рассеянного склероза или гиперчувствительности дыхательных путей [10–12].

Игрунок используют в качестве тест-⁠системы изучения инфекционных заболеваний человека [13, 14] — гепатита С, геморрагических лихорадок, вызванных филовирусами и аренавирусами, восточного конского энцефалита, тяжелого острого респираторного синдрома, гриппа, вирусной инфекции денге, COVID-⁠19. В литературе описано несколько моделей бактериальных респираторных инфекций игрунок, патогенез которых схож с таковым у человека. К примеру, болезнь легионеров — тяжелая форма пневмонии, вызывается Legionella pneumophila [15]. Игрунки также очень восприимчивы к воздушно-⁠капельным инфекциям Burkholderia pseudomallei, и у них развивается мелиоидоз, подобный тому, что у человека [16]. Быстро прогрессирующее заболевание сопровождается высокой температурой, снижением активности и одышкой. Также игрунки могут служить альтернативой моделям, используемым для изучения патогенеза сибирской язвы [17] и туберкулеза, макакам и грызунам [18]. Экспериментальное заражение лептоспирозом обыкновенных игрунок также воспроизводит симптомы течения заболевания у человека. Все вышесказанное указывает на перспективность применения рассматриваемых животных для изучения различных заболеваний, имеющих бактериальную или вирусную этиологию и поражающих в основном дыхательную систему организма [19].

Эволюционная близость игрунок и людей отражается в их сопоставимой морфологии мозга, поэтому опосредует перспективность их применения в исследованиях в области неврологии. Кроме того, продолжительности жизни способствует изучение динамики развития нейродегенеративных заболеваний. Относительно большой размер головного мозга позволяет визуализировать протекающие в нем патологические изменения с помощью магнитно-⁠резонансной или позитронно-⁠эмиссионной томографии. Обыкновенные игрунки подходят для изучения болезни Паркинсона, поскольку у них развивается спектр симптомов, схожий с таковым человека, — апатия, неподвижность, ригидность мышц, тремор, неухоженный вид, измененное выражение морды животного, замедленность непроизвольных движений [20]. Обыкновенные игрунки также являются релевантной тест-⁠системой для моделирования болезни Альцгеймера. У рассматриваемых животных развивается амилоидоз при инъекции β-⁠амилоида в структуры головного мозга, а также образуются спонтанные старческие бляшки в пожилом возрасте [21–23]. Игрунки в дополнение к макакам также являются хорошей тест-⁠системой для изучения когнитивных свойств [24, 25].

Было показано, что ожирение и метаболический синдром игрунок схожи с таковыми человека, в связи с этим игрунок используют в качестве тест-⁠системы для моделирования метаболических заболеваний, например, ожирения, индуцированного высококалорийной диетой. У животных наблюдается гипертриглицеридемия и гипергликемия [26, 27]. У игрунок, получающих пищу с высоким содержанием жиров или углеводов, нарушается метаболизм глюкозы, развиваются гиперплазия островков поджелудочной железы и атеросклероз [28].

Игрунки являются релевантными тест-⁠системами для изучения метаболизма лекарств и токсикологических исследований из-⁠за сходства суперсемейств цитохрома P450 [29, 30] этого вида животных и человека, что опосредует вероятную схожесть фармакокинетических и фармакодинамических характеристик широкого спектра лекарственных средств у двух видов.

Высокая вовлеченность обыкновенных игрунок в доклинические исследования опосредует очевидную необходимость мониторинга здоровья рассматриваемых животных и создания диапазонов нормы по наиболее часто используемым биохимическим показателям. Данные значения позволят отслеживать изменения здоровья лабораторных животных и оценивать успешность формирования модельной патологии в фармакодинамических исследованиях. Таким образом, целью данного исследования является формирование референтных интервалов (РИ) биохимических показателей сыворотки крови здоровых половозрелых обыкновенных игрунок с дальнейшим применением полученных показателей в исследовательской работе.

Материал и методы

Для формирования РИ использовали данные, полученные от интактных животных в декабре 2022 г. Анализу подлежали значения, определенные у 24 самцов и 24 самок (небеременные и нерожавшие, без учета фазы эстрального цикла). Возраст самцов и самок обыкновенных игрунок составлял 12 мес, масса тела в среднем — 350 г. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26 °С, относительная влажность 40–75%, 12-⁠часовой световой день. Кормление обыкновенных игрунок проводили в соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в одинаковых условиях с помощью общепринятых аналитических методов. Для исследования использовали кровь, которую отбирали из латеральной вены cафена задней лапы животных в вакуумные пластиковые пробирки (ООО «КОРВЕЙ», объем 0,5 мл, Россия). Для получения сыворотки кровь центрифугировали в течение 15 мин при 3000 оборотах в 1 мин на центрифуге Z216-⁠MK (HermleLabortechnik, Германия). В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-⁠25 (BioSystems, Испания) с использованием соответствующих наборов регистрировали следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин (ХС), триглицериды (ТГ), общий белок, альбумин, глюкоза, креатинкиназа (КК), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и общий билирубин (ОБ). Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов производства Вектор-⁠Бест (Россия), для установления уровня остальных аналитов использовали биохимические наборы BioSystems (Испания). Статистическую обработку осуществляли, используя пакет программ GraphPad Prism 9 (США), статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки [31], вид распределения определяли, применяя критерий Шапиро—Уилка.

Результаты и обсуждение

РИ являются важной составляющей доклинических исследований и помогают оценить здоровье лабораторных животных в динамике. Данные значения могут быть составлены по широкому перечню показателей: биохимических, гематологических, коагулологических, анатомических и др. На изменения показателей влияет большое количество факторов, к числу которых можно отнести токсическое действие исследуемых соединений, физическое состояние лабораторных животных или их анатомические особенности, питание, содержание в виварии и др. Интервалы нормы специфических показателей, например кардиомаркера тропонина, могут быть полезны в изучении специфической токсичности исследуемых агентов. Таким образом, РИ могут быть использованы в качестве эталона здоровья лабораторных животных, они указывают на любые изменения, если таковые имеются, в ходе доклинического исследования [32].

Из последующего анализа были исключены значения, называемые «жесткие» и «мягкие» выбросы, то есть данные, лежащие за пределами интервала Q3 и Q1 (1-⁠го и 3-⁠го квартилей). Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом:

Q1–1,5IQR и Q3+1,5IQR.

Данные о доле статистических выбросов по каждому показателю и значения, выходящие за пределы РИ, представлены в табл. 1.

Наибольшие статистические выбросы и отклонения среди биохимических показателей крови самцов обыкновенных игрунок зарегистрированы в отношении аспартатаминотрансферазы — 8,3%, креатинина, общего билирубина и триглицеридов — 4,2% соответственно (см. табл. 1). У самок наибольшие статистические отклонения отмечены в отношении показателя глюкозы — 8,3%, а также креатинина, альбумина, креатинкиназы и лактатдегидрогеназы — 4,2% соответственно. По всем остальным показателям статистических выбросов и отклонений выявлено не было.

РИ для полученных результатов, в зависимости от вида их распределения, рассчитывали как среднее ±1,96 стандартное отклонение (Х_ср±1,96SD) для нормального распределения и как промежуток 2,5–97,5 процентили (‰) для непараметрического распределения. Вид распределения определяли с помощью критерия Шапиро—Уилка. Полученные данные представлены в табл. 2.

Полученные референтные диапазоны обыкновенных игрунок самцов и самок сопоставимы между собой по всем рассматриваемым показателям, статистической разницы выявлено не было (см. табл. 2).

В табл. 3 представлены данные биохимических показателей крови обыкновенных игрунок на основании источников литературы. Перевод показателей, представленных в традиционных единицах, в единицы системы СИ был проведен с помощью коэффициентов, представленных на сайте: http://unitslab.com/ru.

При сравнении полученных интервалов с референтными значениями источников литературы показано, что в целом диапазоны рассматриваемых показателей как самцов, так и самок схожи. Полученные референтные значения креатинина и холестерина аналогичны диапазонам данных литературы. Однако верхние границы рассчитанных РИ мочевины, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, общего билирубина, креатинкиназы и триглицеридов оказались ниже аналогичных значений, представленных в научной литературе. Полученный диапазон нормальных значений щелочной фосфатазы обыкновенных игрунок оказался шире данных литературы. По таким полученным диапазонам значений, как общий белок, альбумин, глюкоза и лактатдегидрогеназа, были найдены не только аналогичные значения, указанные в литературе, но и превышающие таковые. Различия в полученных интервалах нормальных значений с аналогичными диапазонами из других публикаций могут быть связаны с преаналитическими, аналитическими и постаналитическими особенностями постановки анализа. Важными факторами также являются сезонность, условия содержания и рацион игрунок. Именно поэтому серьезным аспектом в доклинических исследованиях является создание РИ здоровых лабораторных животных в каждом научном центре. Это может помочь избежать спорных ситуаций и получить более достоверную информацию в ходе исследований.

Далее полученные референтные значения биохимических показателей крови здоровых игрунок были сопоставлены с аналогичными значениями здорового человека. Так, было показано, что нормальные РИ креатинина обыкновенных игрунок находятся в более низком диапазоне значений по сравнению с показателями человека. Уровень мочевины, глюкозы, креатинкиназы, лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы у изучаемого вида лабораторных животных имеет более широкий диапазон, чем у человека. Кроме того, активность лактатдегидрогеназы здоровых игрунок находится в более высоком диапазоне значений. Диапазоны активности аспартатаминотрансферазы игрунок значительно превышают таковые человека, а активность аланинаминотрансферазы, наоборот, значительно ниже. Нормы холестерина, триглицеридов, общего белка и альбумина схожи у двух видов. РИ общего билирубина здоровых обыкновенных игрунок короче такового у человека. Данная информация и сравнение биохимических особенностей могут быть полезны при экстраполяции полученных результатов между двумя видами.

Изменения уровней биохимических показателей может происходить в результате широкого спектра патологических и физиологических факторов, а также преаналитических и аналитических манипуляций (табл. 4). Далее в статье приведены некоторые особенности игрунок, которые могут быть полезны при постановке доклинического эксперимента с использованием этого вида животных.

Наибольшая активность аланинаминотрансферазы у обыкновенной игрунки наблюдается в печени. Также высокие значения активности фермента выявлены в сердечной мышце и почках. Самый высокий уровень активности аспартатаминотрансферазы наблюдается в сердечной мышце, высокие уровни активности фермента также зарегистрированы в печени, скелетных мышцах, почках и мозге [41].

Из-⁠за своего небольшого размера и значительной двигательной активности игрунки испытывают более острую потребность в увеличении запаса энергии, и для них характерен более высокий и менее стабильный уровень глюкозы в крови, чем у людей. Вследствие высокой скорости метаболизма игрунок и их потребности в частом питании у больных животных может легко развиться гипогликемия. Уровень глюкозы, мочевины, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы выше у молодых особей [42].

Обыкновенные игрунки подвержены развитию ожирения, сопровождающегося дислипидемией и измененным метаболизмом глюкозы [43]. В настоящее время это состояние часто встречается у животных, содержащихся в неволе. Ожирение у игрунок приводит к росту таких патологий, как гепатомегалия, стеатоз печени, диабет, атеросклероз, кардиомиопатии и инсульт. Также интересным фактом является то, что ожирение у игрунок может развиваться очень рано, в детском возрасте, это указывает на перспективность использования этих животных в исследованиях детского ожирения и нарушения метаболизма жиров и углеводов [44].

Значительное изменение активности лактатдегидрогеназы может происходить при относительно низком уровне гемолиза сыворотки, в то время как более высокая степень гемолиза также повышает уровни аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и билирубина, но в меньшей степени, чем лактатдегид­рогеназы. Уровень общего белка, альбумина и активность щелочной фосфатазы не зависят от наличия гемолиза. Седация, используемая при различных физикальных манипуляциях с животными, также может повлиять на биохимические параметры. В литературе [42] описано, например, повышение уровня аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и креатинкиназы, а также снижение уровня глюкозы, фосфора, натрия и калия под кетаминовой анестезией.

Развитие хронического поражения почек у игрунок часто сопровождается снижением массы тела, анемией и повышением уровня мочевины в крови, креатинина и щелочной фосфатазы [45].

Для каждого показателя были рассчитаны коэффициенты вариации (CV=SD/⁠Х_ср×100%), что в грубом приближении соответствует меж­индивидуальной вариабельности этих показателей в человеческой популяции (табл. 5).

Вариабельность двух видов была схожа по таким показателям, как аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, триглицериды и лактатдегидрогеназа. Значения креатинина, мочевины, аланинаминотрансферазы, холестерина, общего белка, альбумина и глюкозы были выше у обыкновенных игрунок, а вариабельность таких показателей, как общий билирубин и креатинкиназа, выше у человека. Данная информация может быть полезна при сравнении биохимических особенностей двух видов, экстраполяции значений, а также применима в доклинических исследованиях.

Заключение

Обыкновенные игрунки являются релевантной тест-⁠системой для изучения широкого спектра патологических состояний. В ходе проведенного исследования были установлены референтные (нормальные) диапазоны стандартных биохимических показателей сыворотки крови здоровых обыкновенных игрунок. Данные значения необходимы для оценки физиологических и патологических состояний организма животных, важны в доклинических исследованиях при моделировании патологических состояний и в динамике их развития, а также при определении безопасности новых фармакологических агентов. Ввиду большого количества преаналитических, аналитических и постаналитических факторов, а также условий содержания животных, которые могут повлиять на значение и интерпретацию полученных данных, важным аспектом в сфере доклинических исследований является составление нормальных референтных диапазонов любых исследуемых параметров в каждом научном центре отдельно. Это поможет избежать искажений и неточностей в интерпретации установленных значений, а также минимизировать ошибки в ходе исследовательской работы.