Влияние изменений водно-солевого баланса на ионо- и осморегулирующую функции почек у озерной лягушки

Введение

Интерес к физиологии амфибий в значительной мере связан с ключевой позицией этих животных в эволюции наземных позвоночных, разнообразием видов и мест обитания, а также с наличием широкого спектра морфологических и физиологических приспособлений, обеспечивающих выживание земноводных в изменяющихся или экстремальных условиях окружающей среды. В то же время механизмы гомеостатической регуляции водно-солевого и кислотно-щелочного баланса внутренней среды, а также транспорта воды и ионов в специализированных эпителиях осморегуляторных органов во многом аналогичны таковым у млекопитающих. Амфибии являются одними из наиболее удобных и успешно используемых экспериментальных моделей для изучения деятельности различных органов и физиологических систем позвоночных, включая экологические, молекулярно-биологические и биомедицинские исследования, а также вопросы эволюции почек позвоночных и механизмов эпителиального канальцевого транспорта [1–3].

Почка амфибий является важнейшим органом, обеспечивающим поддержание водно-солевого баланса, 20–30% профильтровавшегося Na⁺ и Cl^– реабсорбируется в проксимальных канальцах и более 50% — в дистальных [2]. В перемещении основных осмотически активных ионов (Na⁺, Cl^–) участвуют различные транспортные белки, включая натриевые и хлоридные каналы, котранспортеры, ионные насосы и обменники [4–8]. Физиологическое значение многих из них в почках амфибий остается неясным. Электрогенный механизм транспорта Na⁺ имеется в дистальных отделах нефрона и собирательных трубках, что показано в экспериментах in vitro для жабы-аги (Bufo marinus) [9], хвостатых амфибий амфиум (Amphiuma) [10] и амбистом (Ambystoma) [11]. С помощью иммуногистохимического метода установлены распределение и локализация эпителиального натриевого канала (ENaC) в эпителиальных клетках связующего канальца и главных клетках собирательных трубок у B. marinus, в том числе при гиперосмотическом стрессе [9].

Важная роль в реализации эпителиального транспорта веществ принадлежит белкам семейства хлоридных каналов (ClC). Они представляют собой потенциалзависимые хлоридные каналы плазматической мембраны и внутриклеточные Cl^–/⁠H⁺-обменники, вовлеченные, в частности, в трансэпителиальный транспорт и эндоцитоз [12]. В проксимальном канальце в отличие от других частей нефрона одновременно с реабсорбцией воды и ионов происходит всасывание низкомолекулярных белков с помощью рецепторов эндоцитоза мегалина и кубилина, что показано у млекопитающих [13], рыб [14] и амфибий [15–17]. Внутриклеточные хлоридные каналы, ClC-3 и ClC-5 участвуют в установлении рН различных внутриклеточных компартментов в процессе эндоцитоза, от их вовлечения в ацидофикацию эндоцитозных везикул зависит эффективность гидролиза белка в лизосомах [4, 12, 18]. В почках млекопитающих ClC-5 можно обнаружить в мембране щеточной каемки эпителиоцитов проксимального канальца, однако основная его часть локализуется в апикальных эндосомах [18, 19] наряду с ClC-3 [20]. Дефицит ClC-5 при болезни Дента и у нокаутных мышей ингибировал эндоцитоз профильтровавшихся белков в клетках проксимальных канальцев [21], однако нокаут ClC-3 не приводил к нарушению эндоцитоза в почках [22]. Некоторые гомологи хлоридных каналов амфибий клонированы (см. [5]). Два из них, xClC-3 и xClC-5, идентифицированы у лягушек рода Xenopus как ортологи CLC-3 и CLC-5 млекопитающих и человека с идентичностью последовательностей от 78 до 90%, при этом показана функциональная экспрессия различных ортологов ClC-5 в ооцитах Xenopus или в клеточных линиях млекопитающих.

Изменения осмотического баланса у амфибий в большинстве работ изучались в условиях длительной адаптации животных к повышенной солености среды или обезвоживанию в течение нескольких часов, дней или недель. Хорошо известно, что в почках амфибий нет петель Генле, и эти животные не способны продуцировать мочу, гиперосмотическую по отношению к плазме крови, а в условиях гидратации выделяют значительное количество сильно разбавленной мочи. Однако при интенсивном обезвоживании амфибии могут вырабатывать почти изотоническую мочу и быстро реагировать на резкие изменения окружающей среды (высыхание, повышение солености), тем самым обеспечивая кардинальное изменение в крови концентраций Na⁺, Cl^– и мочевины [7]. Показано, что содержание электролитов в крови и моче, а также осмоляльность увеличивались пропорционально длительности адаптации к солености наружной среды и концентрации в ней Na⁺, продолжительности дегидратации, снижению содержания воды в организме в процессе ее испарения с поверхности тела [23–27].

Значительно меньше сведений об изменениях параметров крови и мочи у амфибий в ответ на быстрые изменения водно-солевого баланса, вызванные парентеральным введением гипертонических и изотонических растворов. У лопатонога (Scaphiopus couchi) инъекции гипертонического раствора NaCl не приводили к существенному повышению осмоляльности плазмы крови [28] при наличии реакции поиска воды и ее всасывания через кожу брюшка. Внутривенные инъекции озерным лягушкам 0,3 мл раствора Рингера, содержащего NaCl (концентрация 6%), или 1 мл изотонического раствора Рингера приводили к сходному увеличению осмоляльности мочи (до 60–80 мОсм/⁠кг H₂O) [26]. Инфузия 5% раствора соли постепенно увеличивала осмоляльность плазмы крови (до 240 мОсм/⁠кг H₂O) у лягушки-быка (Rana catesbeiana) [29]. Подкожное введение изотонического раствора лесным лягушкам (Rana silvatica) повышало осмоляльность мочи при значительной вариабельности осмоляльности плазмы крови и содержания в ней Na⁺ и Cl^– [27].

Цель работы — сравнительный анализ воздействия однократных инъекций гипертонических и гипотонических растворов, а также обезвоживания на водно-солевой гомеостаз и экскрецию ионов почками у озерных лягушек.

Задачи исследования: 1) определить осмоляльность и содержание отдельных ионов в моче и крови после примененных воздействий с последующей оценкой функциональных показателей деятельности почек клиренсовыми методами; 2) выявить с помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии наличие ClC-5 в проксимальных канальцах нефронов и возможные изменения паттерна этого канала при наиболее эффективных воздействиях на ионорегулирующую функцию почек.

Материал и методы

Животные. В опытах использовали озерных лягушек, Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771), прежнее название Rana ridibunda, отловленных в Астраханской области, со средней массой тела 102±3 г (n=66), преимущественно самцов (n=50). До экспериментов, проводимых с ноября по 1‑ю половину апреля 2022 г., зимующих лягушек содержали в холодильной камере вивария института при температуре 4 °С в пластиковых контейнерах с фильтрованной водопроводной водой, сменяемой через день, без кормления, поскольку в периоде гибернации лягушки не питаются. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), содержание животных и методы исследования одобрены комиссией по биоэтике ИЭФБ РАН (протокол № 11–1/⁠2022 от 24.11.22).

Экспериментальные процедуры. Животных, адаптированных к комнатной температуре в течение 1 ч, помещали в индивидуальные контейнеры, заполненные водопроводной водой (23 °C) до уровня 1–2 см. В начале опыта у гидратированных лягушек добивались опорожнения мочевого пузыря путем мягкого надавливания на переднюю брюшную стенку. После этого животное взвешивали на электронных лабораторных весах ВЛТЭ-210/⁠510 (Госметр, Россия) для расчета доз вводимых веществ и функциональных показателей работы почек. Все инъекции осуществляли подкожно в спинной лимфатический мешок, используя шприц с иглой 27G. Для моделирования изменений водно-солевого баланса проводили следующие серии экспериментов: 1) инъекции 0,75 М NaCl в дозе 100 мкл на 30 г массы тела, контрольным животным вводили такое же количество изотонического 0,01 М фосфатно-солевого буфера (PBS); 2) гиперволемия, создаваемая введением изотонического PBS в объеме 0,9 мл на 30 г массы тела (3% от массы тела), в контроле использовали PBS, 100 мкл на 30 г массы; 3) дегидратация путем помещения животного в сухой контейнер в сравнении с оптимальной гидратацией в контроле. Для сбора мочи контрольным и опытным животным накладывали кисетный шов на кожу промежности вокруг анального отверстия и перевязывали клоаку. Лигатуру снимали через 1 ч и собирали мочу при произвольном мочеиспускании, регистрировали объем пробы. После сбора мочи лягушкам вводили зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Институт белка, РАН, Пущино-на-Оке, Россия) для тестирования канальцевой реабсорбции. Через 20 мин лягушек обездвиживали с целью обезболивания, разрушая спинной мозг с помощью препаровальной иглы, затем собирали кровь из сердца, быстро извлекали почки и проводили эвтаназию путем декапитации. У части животных (по 3–4 лягушки из каждой серии) перевязку клоаки и сбор проб мочи и крови не проводили, а через 1 ч после воздействий и в контроле вводили лизоцим (Sigma Aldrich Inc., США). Через 20 мин лягушек обездвиживали, извлекали почки и проводили эвтаназию. Вводимые вещества (NaCl, а также белки в дозе 18 мкг/⁠100 мкл на 30 г массы тела) растворяли на PBS, осмоляльность 200 мОсм/⁠кг H₂O, pH 7,4.

Измерения и расчеты. Осмоляльность мочи и сыворотки крови определяли криоскопическим методом (в мОсм/⁠кг H₂O) на микроосмометре Osmo 1 (Advanced Instruments, США). Концентрацию натрия и калия в пробах мочи измеряли на пламенном фотометре Sherwood-420 (Sherwood Scientific, Великобритания), а в сыворотке крови — с помощью ионоселективного блока на автоматическом биохимическом анализаторе Erba XL-200 (Lachema, Чехия). На этом же анализаторе в пробах мочи и сыворотки крови определяли концентрацию Cl^– (ионоселективным методом), креатинина (кинетическим методом по реакции Яффе) с использованием готовых реактивов и сывороток фирмы Erba (Чехия). Были рассчитаны функциональные показатели, характеризующие работу почек, в том числе диурез (V, мл/⁠мин) и экскреция отдельных ионов [концентрация каждого из ионов в моче (UNa, etc.), умноженная на V]. Для оценки скорости клубочковой фильтрации (СКФ) использовали клиренс креатинина (C_Cr), определяемый как отношение содержания креатинина в моче и сыворотке крови (U_Cr/⁠P_Cr), умноженное на V. Все показатели (в соответствующих единицах) подсчитывали на 100 г массы тела.

Морфологические исследования. Образцы ткани почек фиксировали в 4% растворе параформальдегида с последующим отмыванием, криопротекцией и замораживанием в жидком азоте согласно применявшемуся ранее протоколу [16]. Срезы (толщиной 5–7 мкм) из разных частей почки готовили в криостате CM 1510 (Leica Microsystems, Германия). В иммуногистохимических исследованиях применяли поликлональные кроличьи антитела к ClC-5 (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:100, моноклональные мышиные антитела к мегалину/⁠LRP2 (MyBioSourse, США; Acris, Origene Technologies, США) в разведении 1:1000, а также флуоресцентные конъюгаты козьих антикроличьих и антимышиных иммуноглобулинов (IgGs) с Alexa Fluor 488 и 568 (Invitrogen, Molucular Probes, США) по описанной ранее процедуре [16]. Срезы монтировали на предметные стекла, заключали в мовиол и изучали в конфокальном микроскопе DMI 6000 с лазерной приставкой Leica SP II (Leica Microsystems, Германия), используя объектив с увеличением в 40 раз. В режиме лазерного сканирования использовали спектры возбуждения с длиной волны 488 и 568 нм, регистрируя свечение в зеленой (500–520 нм) и красной (590–650 нм) частях спектра соответственно. Изображения, полученные при идентичных и постоянных параметрах работы микроскопа, анализировали, пользуясь программой Image J. На изображениях надгломерулярной зоны подсчитывали относительное число профилей иммунопозитивных проксимальных канальцев (в процентах к общему числу визуализированных проксимальных канальцев). В эпителиальном слое иммунопозитивных канальцев определяли интенсивность флуоресцентного сигнала (оптическая плотность, усл. ед.) в апикальной области эпителиоцитов.

Статистика. Для количественной оценки результатов применяли методы параметрической и непараметрической статистики. В случае соответствия показателей закону нормального распределения по результатам теста Шапиро–Уилка данные представляли в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±SEM), сравнения проводили с использованием непарного t-теста Стьюдента. Другие данные представляли как медиану с верхним и нижним квартилями [Me (Q1; Q3)], для сравнения независимых групп использовали U- или T-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Для расчетов и статистической обработки данных пользовались программой Microsoft Office Excel 2010 и онлайн-калькуляторами.

Результаты и обсуждение

Измеренные у озерных лягушек показатели крови в контрольных сериях опытов были весьма стабильными, а существенные изменения установлены после инъекции гипертонического раствора или обезвоживания (табл. 1). Инъекция 0,75 М NaCl привела к достоверному увеличению концентрации Na⁺ и Cl^– в крови и некоторому росту осмоляльности. При дегидратации увеличилась осмоляльность и концентрация Na⁺ и K⁺ крови, а после инъекций изотонического раствора все измеренные показатели не отличались от контроля. Концентрация измеренных ионов и осмоляльность мочи в контрольных условиях были низкими, что типично для полностью гидратированных амфибий. Наибольшая реакция почек была выявлена в ответ на инъекции NaCl, выражавшаяся в существенном повышении осмоляльности и концентрации Na⁺ и Cl^– в моче (табл. 2). При этом установлено статистически значимое повышение минутного диуреза и клиренса креатинина (табл. 3). В условиях дегидратации и гиперволемии увеличилось только содержание в моче Na⁺ и Cl^– при неизменной величине диуреза и СКФ. В то же время при анализе ионорегулирующей функции почек установлено усиление экскреции Na⁺ и Cl^– в результате всех примененных воздействий (см. табл. 3).

Показатели, измеренные в наших контрольных опытах у гидратированных озерных лягушек, были в пределах или ниже установленных ранее в сыворотке или плазме крови у отдельных видов бесхвостых амфибий. Так, у разных лягушек и жаб (Rana ridibunda, Rana temporaria, Bufo bufo, B. marinus) средние значения осмоляльности крови находились в диапазоне 180–240 мОсм/⁠кг H₂O [23, 25, 30, 31]. Более высокие значения (247–275 мОсм/⁠кг H₂O) приводятся для некоторых видов из южных мест обитания. К ним относятся R. ridibunda из Турции [32] и северного Израиля [33], R. silvatica из южного Огайо (США) [27], а также S. couchi, пустынная жаба из национального заповедника в Буэнос-Айресе [34]. Измеренная концентрация Na⁺ в крови у P. ridibundus оказалась сходной с таковой у B. marinus [30], съедобной лягушки Rana esculenta [24] и R. temporaria [31] — около 100 мМ. Это несколько ниже, чем у B. bufo [23], R. ridibunda [33], R. catesbeiana [35] и леопардовой лягушки Rana pipiens [24] — 117, 115, 116–121 и 133 мМ соответственно. Концентрация Cl^– в крови у P. ridibundus была такой же, как у R. silvatica [27]. Более высокие значения (78–116 мМ) приводятся для R. catesbeiana [35], B. bufo [23] и зеленой жабы B. viridis [26].

Осмоляльность крови является строго регулируемым параметром ввиду направленности механизмов гомеостатической регуляции на стабилизацию объема клеток при изменении осмоляльности окружающей среды [3]. У разных видов амфибий различия в осмоляльности крови и содержании в ней натрия как основного иона могут быть обусловлены множеством факторов, а спектр адаптаций амфибий к повышенной солености среды, согласно недавнему обзору, значительно шире, чем полагали ранее [36]. В среде с повышенной соленостью у амфибий повышается концентрация Na⁺ и Cl^– в плазме крови, снижаются выработка мочи и транспорт Na⁺ в коже [37]. Отмечена связь между осмоляльностью плазмы крови в норме и способностью амфибий выдерживать осмотический стресс, что происходит за счет увеличения в крови концентрации мочевины [26]. Так, некоторые наземные и полуводные виды амфибий могли адаптироваться к высокой солености среды (400 мМ NaCl) или длительному обезвоживанию (крабоядная лягушка R. cancrivora, а также жабы B. viridus и S. couchi). В контроле они имели более высокую осмоляльность плазмы крови (270–305 мОсм/⁠кг H₂O) и концентрацию мочевины по сравнению с плохо адаптирующимися видами, выживающими только в среде с умеренной соленостью (130–200 мМ NaCl). К последним относится большинство бесхвостых амфибий, включая озерных лягушек, у которых, согласно нашим опытам, осмоляльность крови в норме в среднем не превышала 200 мОсм/⁠кг H₂O.

Было продемонстрировано, что организм зимующих озерных лягушек способен реагировать на рост уровня натрия в крови, вызванный инъекцией 0,75 М NaCl, повышением осмоляльности мочи, усилением диуреза и экскреции Na⁺ и Cl^– почками. У летних озерных лягушек при внутривенном введении раствора Рингера, содержащего NaCl в концентрации 6%, отмечены аналогичные изменения осмоляльности мочи [25]. Внутрибрюшинное введение 0,5–1,0 M NaCl лопатоногам незначительно повышало осмоляльность крови [28] как при введении 0,75 M NaCl в наших опытах. При длительной дегидратации (23 дня), приводившей к уменьшению содержания воды в организме R. silvatica на 10% относительно влажной массы тела, осмоляльность и концентрация Na⁺ и Cl^– в плазме возрастали в 1,5 раза [27]. В наших опытах показано, что даже кратковременное обезвоживание (1 ч) у озерной лягушки приводило к достоверному увеличению осмоляльности и концентрации Na⁺ в сыворотке крови, хотя у лягушки-быка для повышения осмоляльности плазмы требовалось не менее 1,5–2,5 ч обезвоживания [29]. При дегидратации в отличие от инъекций NaCl также отмечено снижение концентрации K⁺ крови, по‑видимому, за счет поступления этого иона в клетки, поскольку его экскреция с мочой не увеличивалась. При гиперволемии показатели крови не изменялись, однако повышалась экскреция с мочой Na⁺ и Cl^–. Гиперволемия у R. silvatica приводила к значительной вариабельности осмоляльности плазмы крови и содержания в ней этих ионов, но повышала осмоляльность мочи [27]. Величина СКФ во всех контрольных опытах оказалась весьма стабильной (порядка 8–10 мкл/⁠мин на 100 г массы тела) и увеличивалась только после инъекций 0,75 M NaCl (см. табл. 3). В контроле и после инъекций NaCl у всех лягушек имела место реабсорбция GFP в значительном числе проксимальных канальцев. При маркировании проксимальных канальцев по мегалину хорошо видно, что GFP присутствует в большинстве мегалин-позитивных профилей канальцев (рис. 1, а, б).

В целом статистически значимое увеличение уровня Na⁺ в крови у озерной лягушки после инъекции 0,75 M NaCl и обезвоживания (101±3 и 106±2 мМ против 96±3 мМ в контроле) находилось в пределах нормальных физиологических значений этого показателя у других видов амфибий, но было достаточным для усиления ионорегулирующей функции почек. Это побудило нас к сопоставлению паттерна ClC-5 в нефронах в контроле и после введения 0,75 М NaCl, то есть при усиленном поступлении в почечные канальцы осмотически активных веществ. Распределение ClC-5 анализировали в образцах, полученных в опытах с введением лизоцима, который в течение 20 мин после инъекции хорошо всасывается в эпителии проксимальных канальцев, что было показано ранее [16]. Присутствие в клетках мегалина как основного рецептора эндоцитоза служило важным показателем способности эпителиоцитов к захвату лизоцима, являющегося известным лигандом этого рецептора. После инъекций NaCl не наблюдалось изменений как паттерна мегалина по сравнению с контролем (рис. 1, в, г), так и величины сигнала, которая составила 32,7 (30,4; 36,1) и 31,0 (29,5; 32,7) усл. ед. соответственно (p>0,05; n=4 в каждой группе).

Метка к ClC-5 присутствовала в структурах почечных клубочков и эпителии проксимальных канальцев. Флуоресцентный сигнал был наиболее интенсивным в сосудистой сети клубочка и околоканальцевых капиллярах (рис. 2, а). Основываясь на свидетельствах участия ClC-5 в процессе эндоцитоза белка, распределение ClC-5 анализировали главным образом в эпителии проксимальных канальцев. По ходу проксимальных канальцев иммунофлуоресценция ClC-5 выявлялась, начиная с начальных сегментов, сразу после шеечного отдела, характеризующегося наличием реснитчатого эпителия (рис. 2, б). В эпителиоцитах контрольных образцов метка распределялась преимущественно в апикальной цитоплазме (рис. 2, в), а также в субапикальной и перинуклеарной зонах (рис. 2, б, г). При визуальной оценке сигнала после инъекций NaCl отмечено усиление свечения в апикальной зоне клеток (рис. 2, д), что в отдельных канальцах имело вид яркой узкой полосы непосредственно под щеточной каемкой (рис. 2, г).

Для количественной оценки иммунофлуоресценции ClC-5 в образцах ткани почек лягушек в контроле (n=4) и опыте (n=4) было идентифицировано по 480 проксимальных канальцев. Отмечена тенденция к увеличению (в процентах) иммунопозитивных профилей проксимальных канальцев после инъекций NaCl — 57 (51; 63) по сравнению с 47 (42; 54) в контроле (p>0,05, T-критерий Манна–Уитни). При дальнейшем анализе просмотрено 65 и 50 изображений и визуализировано 230 и 227 иммунопозитивных канальцев соответственно. Установлено увеличение интенсивности сигнала ClC-5 (в усл. ед.) в апикальной зоне эпителиальных клеток от 17,7 (15,4; 19,4) в контроле до 26,9 (23,6; 31,4) после инъекций NaCl (p<0,05), а также повышение максимума свечения от 154 (123; 178) до 211 (197; 225); p=0,057. Таким образом, при увеличении СКФ и усиленном поступлении в почечные канальцы осмотически активных веществ увеличивается количество ClC-5 в эпителии проксимальных канальцев. Это согласуется с наличием тесной связи между поступлением различных веществ с током жидкости в просвет почечных канальцев и последующей их реабсорбцией и транспортом в эпителиальных клетках. Ранее показано [38], что у мышей с мозаичной экспрессией ClC-5 в проксимальных канальцах происходит снижение аквапорина 1 в апикальной цитоплазме ClC-5‑негативных клеток и угнетение эндоцитоза белка. Исходя из установленных изменений паттерна ClC-5 в проксимальных канальцах после инъекции 0,75 M NaCl, для дальнейших исследований представляет интерес детальное изучение в этих условиях захвата и везикулярного транспорта экзогенных белков.

Заключение

В ходе проведенного сравнительного анализа эффектов однократных инъекций гипертонических и гипотонических растворов, а также обезвоживания на водно-солевой гомеостаз и экскрецию ионов почками у озерных лягушек показано, что инъекции 0,75 M NaCl озерным лягушкам оказались наиболее эффективными из примененных воздействий в отношении ионо- и осморегулирующей функций почек. Повышение концентрации Na⁺ и Cl^– в крови сопровождалось усилением экскреции этих ионов с мочой и повышением экспрессии ClC-5 в проксимальных канальцах почек. Можно полагать, что дальнейшие опыты на лягушках в представленных физиологических моделях могут внести вклад в понимание функционирования молекулярных детерминант эпителиального канальцевого транспорта и эндоцитоза белка в почках при изменении водно-солевого гомеостаза.