Анализ роли нейтрофилов в развитии воспаления в монокроталининдуцированной легочной артериальной гипертензии

Введение

Легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) — клинический синдром, сочетающий в себе патологические состояния различной этиологии и патогенеза. Это заболевание сопровождается ремоделированием и неконтролируемой вазоконстрикцией легочных сосудов, в результате чего повышается давление в системе легочной артерии и увеличивается сосудистое сопротивление. В дальнейшем это провоцирует правожелудочковую недостаточность и отек легких, что приводит к преждевременной смерти больных [1]. Особенностью ЛАГ является изменение иммунитета и развитие в легких воспалительного процесса. Об этом свидетельствуют инфильтрация легочной ткани различными воспалительными клетками (макрофагами, нейтрофилами, Т-⁠ и В-⁠лимфоцитами), увеличение уровня цитокинов и факторов роста в ремоделированных сосудах, а также циркулирующих хемокинов и цитокинов [2, 3]. Установлена связь воспалительного процесса с ремоделированием легочных сосудов при ЛАГ, которое прогрессирует в плексиформную артериопатию [2].

Одной из основных причин воспалительного патогенеза ЛАГ является оксидативный стресс, вызванный перепроизводством свободных радикалов и других оксидантов [4, 5]. Источником активных форм кислорода и хлора (АФКХ) являются фагоциты. При активации НАДФН-⁠оксидазы эти клетки генерируют супероксидные анион-⁠радикалы, которые превращаются в пероксид водорода (Н₂О₂), являющийся субстратом миелопероксидазы (МПО), катализирующей образование хлорноватистой кислоты (HOCl). Она выполняет роль основного микробицидного агента и является при этом источником свободных радикалов, что может приводить к повреждению жизненно важных молекул, нарушению клеточных функций или цитодеструкции [6, 7]. Поэтому важной составляющей медикаментозной терапии ЛАГ является снижение последствий оксидативного стресса.

Цель исследования — изучение роли нейтрофилов в формировании оксидативного стресса в экспериментальной модели ЛАГ. Выбор клеток обусловлен тем, что нейтрофилы являются основными продуцентами АФКХ благодаря высокому содержанию НАДФН-⁠оксидазы и МПО.

Материал и методы

В работе использовали: монокроталин (МКТ), гистопак-⁠1077, люминол (5-⁠амино-⁠2,3-⁠дигидрофталазин-⁠1,4-⁠дион), люцигенин (N,N’-⁠диметил-⁠9,9’-⁠бисакридиний нитрат), ABAH (гидразид 4-⁠аминобензойной кислоты), LY294002, аспирин, H₂O₂, Triton X-⁠100 (Sigma, США), Fura 2-⁠AM (Thermofisher Scientific, США), компоненты для приготовления сбалансированного буферного солевого раствора Эрла (СБСРЭ) («Анализ Х», Беларусь).

Исследования проведены на 64 рандомбредных белых крысах (самцы массой 200–250 г), содержащихся в стационарных условиях вивария Белорусской медицинской академии последипломного образования (БелМАПО) на полноценном стандартном пищевом рационе согласно установленным нормам. Для эксперимента выбирали активных животных с гладким, блестящим шерстным покровом, нормальной окраской видимых слизистых оболочек, охотно поедающих корм. До исследования животные находились под карантинным наблюдением в течение 2 нед, а за 24 ч были лишены корма. В день начала эксперимента проводили дополнительное обследование и взвешивание животных. Компоновка по группам наблюдения проводилась произвольно.

Моделирование ЛАГ у 54 животных осуществляли с помощью МКТ [8, 9]. МКТ растворяли в подогретом до 30 °С 0,9% растворе NaCl; 1 мл полученного раствора вводили крысам утром натощак в дозе 60 мг/⁠кг массы тела подкожно в область холки. После инъекции МСТ крысы с ЛАГ были случайным образом разделены на 4 группы: 2-⁠недельную (10 крыс), 4-⁠недельную (10 крыс), 6-⁠недельную (14 крыс) и 8-⁠недельную (20 крыс) группы, что обусловлено временными промежутками между началом индуцирования патологии и забором крови для анализа. Забор крови проводили утром из нижней полой вены животных под наркозом в стандартных условиях операционного блока вивария. Наркотизацию животных проводили внутримышечным введением раствора кетамина из расчета 0,2–0,3 мл на 100 г массы тела. Результаты сравнивали с соответствующими данными, полученными для контрольной группы. Контрольную группу составили 10 здоровых животных, которым вместо МКТ вводили эквивалентное количество физиологического раствора. Забор крови у этих животных производили через 2 нед после введения растворителя.

На протяжении всего эксперимента животные содержались индивидуально в стандартных условиях вивария с постоянным доступом к воде и пище. По истечении срока наблюдения животные были выведены из эксперимента с соблюдением принципов биоэтики (в соответствии со стандартами GLP) на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 1 мл 5% тиопентала натрия на 100 г массы тела.

При проведении исследований руководствовались соблюдением требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, а также требований и рекомендаций, нормативных, научно-⁠методических и справочных материалов по содержанию, кормлению и выводу их из эксперимента с последующей утилизацией (https:/⁠/⁠bioethics.belmapo.by/⁠research-⁠ethics.html). Настоящее исследование одобрено этической комиссией БелМАПО (№ 4 от 23.09.20).

Нейтрофилы выделяли из периферической крови крыс в градиенте плотности гистопака по стандартной методике [10]. Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева. Выделенные клетки ресуспендировали в СБСРЭ, рН 7,4.

Генерацию АФКХ изучали методом хемилюминесценции (ХЛ) на биохемилюминометре БХЛ-⁠1 (Минск, Беларусь). Определение АФКХ проводили с использованием 10 мкM люминола или 10 мкM люцигенина. «Респираторный взрыв» в нейтрофилах (1·10⁵ клеток/⁠мл) индуцировали с помощью адгезии клеток к поверхности стекла, для чего использовали в процессе измерения  ХЛ дно кварцевой кюветы диаметром 40 мм. Вклад в процессы внутриклеточной сигнализации ферментов, которые участвуют в образовании АФКХ, оценивали с использованием специфических ингибиторов: 0,1 мкM ABAH — ингибитор МПО, 0,1 мкM LY294002 — ингибитор фосфатидилинозитол-⁠3-⁠киназы (ФИ3К), 1 мкM аспирина — ингибитор циклооксигеназы 1/⁠2. Время прединкубации клеток с ингибиторами составляло 20 мин.

Активность секретируемой из нейтрофилов МПО оценивали по интенсивности ХЛ, измеренной в течение 10 мин в системе, содержащей 1 мл СБСРЭ (pH 5,2), 10 мкМ H₂O₂, 25 мкМ люминола и 200 мкл внеклеточной жидкости, полученной после центрифугирования суспензии нейтрофилов (1·10⁶ клеток/⁠мл), как описано в работе [11]. Перед измерением нейтрофилы стимулировали адгезией к поверхности кварцевого стекла в течение 30 мин при 37 °C. Активность секретированной МПО (∑I_секр/⁠∑I_общ×100%) оценивали как отношение активности МПО (интегральная интенсивность ЛюмХЛ) во внеклеточной среде стимулированных адгезией клеток (∑I_секр) к общей активности МПО в 200 мкл лизата клеток (∑I_общ). Лизат нейтрофилов для оценки общей активности МПО получали добавлением 10% раствора Triton X-⁠100.

Концентрацию свободного цитозольного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i) определяли с помощью флюоресцентного зонда Fura 2-⁠AM (λ_ex=340/⁠380 нм, λ_em=510 нм) на флуориметре (CM 2203 «Солар», Беларусь) по методике, описанной в работе [12]. Нейтрофилы (10⁶ клеток/⁠мл) (рН 7,4) инкубировали с 2 мкмоль/⁠л Fura 2-⁠AM при 37 °C в течение 30 мин. Клетки дважды промывали СБСРЭ и выдерживали при 37 °С в течение 30 мин для завершения деэстерификации флюоресцентного красителя. После этого клеточную суспензию помещали в кварцевую кювету и регистрировали флюоресценцию в течение 10 мин.

Концентрацию свободных цитозольных ионов кальция в нейтрофилах рассчитывали по уравнению Гринкевича:

[Ca²⁺]_i =K_d×[(R – R_min)/⁠R_max – R)]×В,

где [Ca²⁺]_i — концентрация несвязанных ионов кальция в цитоплазме (в нМ); K_d — константа связывания ионов Ca²⁺ с зондом Fura-⁠2 (при 37 °C K_d составляет 225); R — отношение интенсивности флюоресценции при λ=340 нм к интенсивности флюоресценции при λ=380 нм; R_min — отношение интенсивности флюоресценции 340/⁠380 при минимальной концентрации Ca²⁺ в среде; R_max — отношение интенсивности флюоресценции 340/⁠380 при максимальной концентрации Ca²⁺ в среде; В — отношение интенсивности флюоресценции 340/⁠380 при максимальной концентрации Ca²⁺ в среде к интенсивности флюоресценции 340/⁠380 при минимальной концентрации Ca²⁺ в среде.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Различия между контрольной и экспериментальной группой анализировали с помощью критерия Даннета. Результаты представлены как среднее значение трех или более независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Результаты считали значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Изучена генерация АФКХ нейтрофилами крыс при прогрессировании ЛАГ. Интенсивность усиленной люминолом (ЛюмХЛ) или люцигенином ХЛ (ЛюцХЛ) отражает концентрацию различных типов АФКХ в модельных и клеточных системах. Люминол известен как ХЛ-⁠индикатор всех типов АФКХ, однако более эффективно он окисляется хлорноватистой кислотой [13]. В то же время люцигенин окисляется преимущественно супероксидными анион-⁠радикалами (О₂^–) [14]. Изменение интегральной интенсивности ЛюмХЛ (∑I_ЛюмХЛ) и ЛюцХЛ (∑I_ЛюцХЛ) нейтрофилов крыс с ЛАГ и контрольной группы показаны на рис. 1, а и б. Как видно из рис. 1, а, общий выход нейтрофильных АФКХ по сравнению с контролем был значительно снижен в 2-⁠недельной группе и умеренно снижен в 4-⁠ и 6-⁠недельных группах животных. К 8-⁠й неделе прогрессирования заболевания отмечалось увеличение (в 2,3 раза) продукции АФКХ нейтрофилами. Прогрессирование ЛАГ приводило к уменьшению интенсивности ЛюцХЛ и, как следствие, продукции супероксидных анион-⁠радикалов в нейтрофилах крыс через 2 или 4 нед после инъекции МКТ с последующим умеренным увеличением через 6 нед и значительным повышением (на 20%) через 8 нед (см. рис. 1, б).

Для выявления механизмов образования АФКХ в нейтрофилах крыс с МКТ-⁠индуцированной ЛАГ использовали следующие специфические ингибиторы: АВАН, аспирин и LY294002. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что после добавления АВАН к нейтрофилам здоровых животных интегральная интенсивность ЛюмХЛ снизилась до 20±10% от контрольного значения (в отсутствие ингибитора). Однако в обработанных АВАН нейтрофилах крыс, которым вводили МКТ, снижение продукции АФКХ менее выражено при прогрессировании ЛАГ: продукция АФКХ снижается до 32±7, 38±10, 42±7 и 59±6% в группах для 2, 4, 6 и 8-⁠й недели соответственно. Таким образом, наблюдается тенденция к снижению вклада МПО в генерацию АФКХ нейтрофилами животных с ЛАГ. Ингибирование циклооксигеназы 1/⁠2 также приводило к снижению выхода АФКХ в нейтрофилах. Как следует из анализа результатов, представленных в таблице 1, генерация АФКХ клетками, обработанными аспирином, через 2 нед после введения МКТ повышалась более чем в 2 раза, затем снижалась и была ниже контрольного уровня через 8 нед прогрессирования ЛАГ.

Участие PI3K в продукции свободных радикалов нейтрофилами крыс с ЛАГ имеет сложный характер. Ингибирование ФИ3К способствовало повышению продукции АФКХ во всех группах животных с ЛАГ. В контрольных образцах добавление ингибитора ФИ3К приводило к снижению выхода АФКХ до 70±12%, что свидетельствует о значительном вкладе этого фермента в образование АФКХ. В 2-⁠ и 6-⁠недельных группах LY294002 вызывал повышение общей интенсивности ЛюмХЛ. Через 8 нед после инъекции МКТ ФИ3К, вероятно, не была вовлечена в образование АФКХ нейтрофилами. Анализ результатов, полученных с помощью ингибиторов ферментов, вовлеченных в процессы внутриклеточной сигнализации при формировании «дыхательного взрыва» нейтрофилов, свидетельствует, что прогрессирование ЛАГ со 2-⁠й по 8-⁠ю неделю сопровождается снижением вклада МПО, усилением роли циклооксигеназы 1/⁠2 и модификацией передачи сигналов ФИ3К при генерации АФКХ нейтрофилами.

С интенсификацией процессов трансдукции активационного сигнала в клетках связывают повышение концентрации свободных ионов кальция в цитозоле ([Ca²⁺]_i) [15]. Мы исследовали уровень [Ca²⁺]_i в цитозоле нейтрофилов здоровых и больных крыс через 2 нед после индуцирования ЛАГ с помощью МКТ. Было показано, что [Ca²⁺]_i в клетках здоровых крыс составляет 296±24 нМ. Через 2 нед после инъекции МКТ этот параметр увеличился в 2,5 раза (до 729±69 нМ), что указывает на активацию процессов кальцийзависимой внутриклеточной сигнализации.

На рис. 2 приведены значения интенсивности ХЛ, отражающие уровень образования HOCl под действием МПО, секретированной из нейтрофилов во внеклеточную среду после их стимуляции адгезией в течение 30 мин. Данный параметр характеризует галогенирующую активность МПО [11]. Как видно на рис. 2, через 2 и 4 нед после инициирования ЛАГ наблюдалось небольшое увеличение продукции HOCl во внеклеточной среде. Через 6 и 8 нед уровень HOCl был повышен на 100–150%. Эти данные показывают, что прогрессирование ЛАГ сопровождается усилением процессов секреторной дегрануляции нейтрофилов, в результате чего из клеток во внеклеточную среду высвобождается больше МПО.

Заключение

Полученные данные указывают на важную роль нейтрофилов в развитии воспаления в МКТ-⁠индуцированной ЛАГ. Изменение продукции АФКХ нейтрофилами крыс в динамике ЛАГ свидетельствует о модификации функциональной активности этих клеток, что выражается в усиливающейся предактивации (прайминге), сопряженной с нарушением кальцийзависимых процессов трансдукции активационного сигнала с участием МПО, циклооксигеназы 1/⁠2 и ФИ3К. При этом через 2–8 нед после индуцирования ЛАГ в результате нарастающей секреторной дегрануляции наблюдается увеличение выхода из нейтрофилов важнейшего медиатора воспаления фермента МПО, который катализирует реакцию образования HOCl и, как следствие, является потенциальным индуктором оксидативного/⁠галогенирующего стресса в организме.