Вариабельность биохимических показателей крови и установление референтных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 11: собаки

Введение

Доклинические исследования на животных до сих пор играют значимую роль в научных исследованиях, направленных на разработку и изучение эффективности новых лекарственных средств и хирургических методов коррекции патологических состояний. При этом исследования с использованием крупных лабораторных животных проводятся редко ввиду их экономической и организационной сложности. Несмотря на это, такие животные, как собаки, кошки, свиньи или яванские макаки, являются незаменимыми тест-⁠системами в доклинических исследованиях на определенных этапах изучения лекарственных средств [1, 2].

Собака является распространенной моделью in vivo по нескольким причинам — относительно большой размер тела и анатомическое сходство с человеком. К тому же патофизиология некоторых естественных заболеваний собак более схожа с таковой человека, чем грызунов. Наиболее подходящая порода собак для проведения доклинических экспериментов — это бигль. Собаки, в отличие от грызунов, имеют примерно такое же количество генов, как и люди, и большинство этих генов являются близкими ортологами [3, 4].

Наиболее часто в доклинических исследованиях собаки применяются в изучении искусственного кровообращения, шунтирования коронарной артерии, устранения аневризмы аорты, коррекции врожденных пороков сердца и замены сердечного клапана [5–7]. Данный вид животных также используется для исследований в области трансплантации почек, легких и сердца, протезирования суставов, хирургии желудочно-⁠кишечного тракта, при изучении хронического и геморрагического панкреатита, амилоидоза, заболевания межпозвоночных дисков, воспаления легких, гиперреактивности дыхательных путей, хронического бронхита, астмы, эмфиземы [8–11]. Данные животные также используются при моделировании заболеваний пародонта ввиду того факта, что десна собак реагирует аналогично человеческой десне в ответ на накопление зубного налета [12]. Разработаны модели офтальмологических заболеваний на собаках — прогрессирующая атрофия сетчатки и аномалия глаза. Также собаки являются подходящей моделью для изучения и терапии катаракты ввиду близкой анатомической схожести глаза собаки и человека [13, 14].

Отдельным пунктом применения собак в доклинических исследованиях являются изучение и терапия онкологических заболеваний [15, 16]. Собаки представляют собой значимую модель для оценки новых фармакологических и хирургических методов лечения онкологических патологий. Многие онкологические процессы у собак имеют общие черты с онкологическими патологиями человека, включая этиологическое и морфометрическое сходство. Наиболее часто изучаемые патологии — меланома, карцинома желудка, гемангиосаркома, лимфома, злокачественный гистиоцитоз и неходжкинская лимфома [17, 18].

Помимо всего вышеперечисленного, стоит упомянуть о системе цитохрома Р450 собаки и ее сходстве с человеческой. Известно, что функциональная активность семейств CYP1 и CYP3, а также подсемейств CYP2А, CYP2D и CYP2E собак сопоставима с ортологами человека. Соответственно можно предположить наличие определенной прогностической ценности и экстраполяции на человека данных, полученных при изучении лекарственных веществ, чей метаболизм в основном связан с ферментами данных семейств и подсемейств [19–22].

Ввиду широкой вовлеченности собак в доклинические исследования возникает необходимость контроля за состоянием здоровья животных, находящихся в эксперименте. Целью работы является создание базы референтных значений биохимических показателей крови собак породы бигль. Данные показатели необходимы в доклинических исследованиях при оценке состояния здоровья животных, адекватности сформированной патологической модели, повышения точности проведения исследований, интерпретации полученных значений, а также при проверке безопасности новых исследуемых лекарственных веществ. Референтные значения, полученные в исследовании, могут быть использованы в качестве исходных данных для анализа биохимических показателей крови собак породы бигль, используемых в доклинических исследованиях.

Материал и методы

Данные, используемые для формирования референтных интервалов (РИ), были получены от интактных животных за временной период май—сентябрь 2022 г. в АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ». Проведенные манипуляции и эксперименты одобрены биоэтической комиссией, одобрение получено до начала фактических работ на животных. В исследование было включено 56 самцов и 48 самок (небеременные и нерожавшие, без учета фазы менструального цикла) собак породы бигль. Возраст животных соответствовал диапазону 10–18 мес, масса тела самок была в пределах 7–11 кг, а самцов — 8–14 кг. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26 °С, относительная влажность 40–75%, 12-⁠часовой световой день. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/⁠63/⁠EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение интересующих биохимических показателей проводили в одинаковых условиях с использованием общепринятых преаналитических и аналитических методов. Для исследования использовали кровь, которую отбирали из латеральной подкожной вены передней лапы исследуемых животных натощак, без седации и анестезии в вакуумные пластиковые пробирки с активатором свертывания и гелем (ООО «КОРВЕЙ», Россия). На момент забора крови животные были клинически здоровы. Затем для получения сыворотки кровь сразу после забора центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/⁠мин на центрифуге ОПн-⁠3.04 «Дастан» (Киргизия). Полученную сыворотку переносили в стерильные пробирки, в которых определяли биохимические показатели. В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-⁠25 (BioSystems, Испания) с использованием соответствующих наборов регистрировали следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов («Вектор-⁠Бест», Россия), для определения уровня остальных аналитов использовали биохимические наборы (BioSystems, Испания). Все статистические расчеты проводили с использованием программы GraphPad Prism 9.0 (США), статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки, который был описан ранее [23–25], вид распределения определяли с помощью критерия Шапиро—Уилка, парное сравнение между животными разного пола проводили с применением U-⁠критерия Манна—Уитни и t-⁠критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Из последующего анализа были исключены значения, называемые «жесткие» и «мягкие» выбросы, то есть данные, лежащие за пределами интервала Q3 и Q1 (1-⁠го и 3-⁠го квартилей). Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом:

Q1–1,5IQR и Q3+1,5IQR.

Данные, касающиеся доли статистических выбросов по каждому показателю и выходящие за пределы РИ, представлены в табл. 1.

Наиболее часто статистические выбросы при анализе сыворотки крови собак у самцов отмечались в отношении мочевины, щелочной фосфатазы и триглицеридов 3,6% соответственно, у самок — в отношении аланинаминотрансферазы (4,8%) и триглицеридов (8,3%).

Вид распределения полученных значений определяли по критерию Шапиро—Уилка. В зависимости от вида распределения РИ рассчитывали следующим образом:

Х_ср±1,96SD — для нормального распределения;

2,5–97,5‰ (процентили) — для ненормального распределения (табл. 2).

В табл. 2 представлены результаты РИ биохимических показателей крови собак.

Полученные диапазоны значений самцов и самок сопоставимы между собой по всем рассматриваемым показателям, статистической разницы выявлено не было. Можно отметить незначительное превышение верхнего предела РИ щелочной фосфатазы, холестерина и общего билирубина у самок, аспартатаминотрансферазы, креатинкиназы и лактатдегидрогеназы у самцов.

При сравнении полученных интервалов с референтными значениями из источников литературы (табл. 3) показано, что в целом диапазоны рассматриваемых показателей схожи, но присутствуют и различия. Так, интервалы значений креатинина, щелочной фосфатазы, креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, полученные в ходе исследования, оказались шире аналогичных показателей, представленных в литературе. Рассчитанные интервалы аланин­аминотрансферазы, холестерина, триглицеридов и общего билирубина собак были короче представленных в других публикациях. Данные различия могут быть объяснены широким перечнем факторов. К ним можно отнести состояние и возраст животных, условия содержания в питомнике, питание. Большую роль в составлении РИ играет преаналитический этап, а именно место и метод забора биоматериала, используемые расходные материалы, время от забора биообразца до проведения анализа, а также аналитический этап, связанный с используемыми реагентами и чувствительностью анализатора. Полученные в ходе исследования значения аспартатаминотрансферазы, общего белка, альбумина и глюкозы совпали с аналогичными показателями из научной литературы.

Сопоставляя полученные биохимические показатели крови собак породы бигль и соответствующие показатели человека (см. табл. 3), можно сделать вывод, что РИ креатинина, мочевины, общего белка и глобулинов собак сопоставимы с таковыми человека. Рассчитанные диапазоны аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, холестерина, глюкозы, креатинкиназы и лактатдегидрогеназы собак шире, чем у человека. Стоит отметить, что средние значения данных показателей у собак соотносятся с верхней границей нормы у человека. Рассчитанные диапазоны триглицеридов, альбумина и общего билирубина собак короче, чем у человека.

Для получения значимых и надежных результатов в экспериментах на животных крайне важным является тот факт, чтобы вид и выбранная модельная патология должным образом соответствовали клинической патологии человека. Выбор релевантной модели требует глубоких знаний о конкретных видах и породах, это необходимо для того, чтобы убедиться в адекватности постановки модели и полученных данных. Ниже представлены справочные данные о биохимических показателях, рассматриваемых в статье и их изменениях при различных патологических и физиологических состояниях у собак породы бигль (табл. 4).

Известно, что повышение в сыворотке концентрации аланинаминотрансферазы у собак, как и у человека, является специфичным индикатором повреждения печени. Холестаз и обструкция желчных путей также могут увеличить сывороточную активность аланинаминотрансферазы вследствие токсических эффектов солей желчных кислот, оказываемых на гепатоциты. Увеличение активности аланинаминотрансферазы у собак наблюдается и при тяжелых поражениях мышечной ткани. Совместное исследование активности креатинкиназы, более специфичного фермента, помогает установить этиологию повышения аланинаминотрансферазы (мышцы или печень). Повышение сывороточной активности аланинаминотрансферазы у собак обычно рассматривается как патологическое состояние в случаях, когда ее значения превышают верхнюю границу нормы более чем в 2 раза. Период полувыведения аланинаминотрансферазы у собак в сыворотке крови составляет от 1 до 3 дней, а пик уровня фермента приходится на первые 48 ч. Такие препараты, как парацетамол, кортикостероиды, сульфаниламиды, рифампицин, фенобарбитал и фенитоин, могут вызвать повышение уровня аланинаминотрансферазы у собак [39–41].

Сывороточная активность аспартатаминотрансферазы у собак может быть либо в пределах нормы или незначительно увеличиваться даже при тяжелых заболеваниях печени, которые приводят к выраженному снижению печеночной массы, или обусловлены действием токсинов, ингибирующих активность трансаминаз. Метронидазол, цефалоспорины, циклоспорины и изониазид понижают активность аспартатаминотрансферазы, кортикостероиды, эритромицин, рифампицин, сульфаниламиды и ацетаминофен, наоборот, повышают ее активность [41–43].

Различные заболевания гепатобилиарной системы у собак могут привести к увеличению активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови. При холестазе, наряду с повышением активности рассматриваемого фермента, одновременно могут увеличиваться концентрация общего билирубина и желчных кислот. Липидоз или воспаление паренхимы печени могут затруднить отток желчи по желчным канальцам и вызвать повышенную выработку и высвобождение щелочной фосфатазы. Также характерно повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови собак при увеличенной активности остеобластов. Это увеличение наиболее часто выявляется у молодых животных. Щелочная фосфатаза может увеличиваться при остеосаркоме и других костных новообразованиях, развитии доброкачественных и злокачественных опухолей. У собак общая активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови может увеличиваться в 2–6 раз после введения некоторых противосудорожных препаратов — фенобарбитала, примидона и фенитоина [41–43].

У собак креатинкиназа чаще всего используется в качестве маркера повреждения мышечной ткани в результате травмы, хирургического вмешательства, внутримышечных инъекций или врожденной миопатии. Чувствительность и специфичность активности креатинкиназы в сыворотке крови наиболее информативны в диагностике повреждений скелетных мышц, миокарда, а также при неврологических расстройствах. Увеличение активности креатинкиназы после повреждения мышц происходит быстро и достигает максимума через 6–12 ч. У собак период полувыведения креатинкиназы в среднем составляет до 3 ч. Незначительное увеличение активности креатинкиназы в сыворотке крови возможно после физической нагрузки. Самый высокий уровень креатинкиназы отмечен у щенков, с возрастом этот показатель снижается. Кортикостероиды, стрептокиназа, инсулин, пенициллины, сульфаниламиды и фенитоин способны увеличивать активность фермента [41, 44].

Гипоальбуминемия у собак может возникать в результате прохождения альбумина в клубочковый ультрафильтрат (первичная моча) и предполагает поражение клубочков и хронический характер заболевания. При заболеваниях печени гипоальбуминемия не выявляется, пока не будут нарушены более 70% функции гепатобилиарной системы. Гипоальбуминемия часто сопровождается гиперглобулинемией. Снижение концентрации альбумина у собак может привести к значительному уменьшению онкотического давления и перемещению жидкости из внутрисосудистого пространства в интерстициальную область. В результате этого развивается гипотония, образуются подкожные отеки и отеки легких, а также полостные выпоты — плеврит и асцит. Ацетилсалициловая кислота способствует снижению альбумина в сыворотке крови. Увеличение концентрации альбумина, как правило, является результатом обезвоживания или гемоконцентрации. Тестостерон, эстроген, соматотропин и глюкокортикоиды способствуют повышению уровня альбумина в сыворотке крови. Снижение соотношения альбумина к глобулину у собак может возникать при почечной протеинурии [45, 46].

Билирубинемия у собак чаще всего возникает в результате усиленного разрушения эритроцитов, тяжелых гепатоцеллюлярных повреждений и угнетения конъюгационных или секреторных механизмов печени, снижения секреции билирубина и нарушения выведения желчи в кишечник. Увеличение содержания в крови билирубина может быть следствием приема лекарственных и токсических веществ, вызывающих гемолитическую анемию, острую печеночную недостаточность или печеночную дисфункцию. Фенобарбитал вызывает повышение уровня билирубина в сыворотке крови [43, 45].

Основной причиной гипергликемии у собак является сахарный диабет, который развивается в результате нехватки или дефекта инсулина. Необходимо дифференцировать сахарный диабет от гипергликемии, вызванной действием катехоламинов и кортизола при стрессе. Гипогликемия может развиться вследствие повышенного потребления глюкозы тканями, например, при физической перегрузке, сокращения количества поступающей глюкозы при голодании или печеночной недостаточности. Стойкая гипогликемия отмечается при новообразовании β-⁠клеток и высокого потребления глюкозы. Бета-⁠адреноблокаторы, антигистаминные препараты, этанол, производные сульфонилмочевины, салицилаты и анаболические стероиды могут снижать уровень глюкозы в крови. Кортикостероиды, агонисты центральных α2-⁠адренорецепторов, фуросемид, тиазидные диуретики, производные фенотиазинов и гепарин вызывают гипергликемию [47, 48].

Повышение уровня креатинина у собак обычно свидетельствует о снижении фильтрации в почечных клубочках и понижении выделительной функции почек, также может наблюдаться при обезвоживании, поскольку вместе с этим повышается плотность мочи и, следовательно, содержание креатинина в моче. Увеличение рассматриваемого показателя в сыворотке крови не всегда является специфическим показателем заболевания почек и может изменяться под влиянием экстраренальных симптомов. Снижение образования креатинина возможно при сильном истощении организма и снижении мышечной массы животного [49].

У щенков до месячного возраста уровень мочевины в крови несколько выше референтных значений, у животных старше 2–3 мес уровень мочевины становится немного ниже референтных значений в результате быстрого роста и увеличения интенсивности анаболических процессов. Повышение уровня мочевины в крови наряду со снижением скорости клубочковой фильтрации и возрастанием уровня креатинина обусловливает развитие азотемии. Азотемия всегда сопоставляется со значением относительной плотности мочи и уровнем диуреза (анурия, олигурия или полиурия). Для определения типа азотемии часто используют расчет индекса отношения мочевины к креатинину в сыворотке крови. Это отношение у мелких домашних животных составляет примерно 20:1, а у крупных — 10:1. Повышение коэффициента может быть связано с обезвоживанием или кишечным кровотечением, тогда как понижение коэффициента чаще всего связано с увеличением диуреза. При желудочно-⁠кишечном кровотечении возрастает уровень азота мочевины без увеличения уровня креатинина [45, 50].

Источниками высокой активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови у собак являются повреждения мышц, печени и разрушающиеся эритроциты. После повреждения тканей сывороточная активность лактатдегидрогеназы достигает пика через 24–48 ч и возвращается к норме в течение 7–10 дней. Для выявления повреждения мышечной ткани уровень лактатдегидрогеназы в крови является менее информативным показателем, чем креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы, и на ее сывороточную активность существенно влияет даже незначительный гемолиз. В совокупности исследование сывороточной активности лактатдегидрогеназы может помочь в дифференциальной диагностике патологического процесса. Сообщалось об увеличении уровня фермента в сыворотке у собак, пораженных лейкемией [51, 52].

Обнаружение гипертриглицеридемии в образце крови собаки после 12-⁠часового периода голодания указывает на стойкую или патологическую гиперлипидемию. Патологическая гипертриглицеридемия, как правило, вторична по отношению к основному заболеванию эндокринной системы, поджелудочной железы, печени или почек. Первичная гиперлипидемия встречается редко и, как правило, вызвана генетическими отклонениями [53].

Для каждого изученного показателя были рассчитаны коэффициенты вариации, что в грубом приближении соответствует меж­индивидуальной вариабельности этих показателей в человеческой популяции. В широком смысле под этим определением подразумевается изменчивость качественных и/⁠или количественных особенностей структуры и/⁠или функций, присущих двум и более отдельным (индивидуальным) животным. Сравнительные данные приведены в табл. 5.

Схожая вариабельность отмечена по таким показателям, как креатинин, мочевина, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза и триглицериды. Различия присутствуют среди таких показателей, как холестерин, общий белок, альбумин, глюкоза, общий билирубин, креатинкиназа и лактатдегидрогеназа. Рассматриваемые показатели имеют более широкую вариабельность у собак в отличие от человека. Данную информацию необходимо учитывать при интерпретации полученных значений в доклинических исследованиях.

Заключение

Собака является важной моделью в доклинических исследованиях. Данные, полученные от животных, используют для изучения патогенеза и лечения различных заболеваний систем организма, онкологических процессов и исследования новых лекарственных средств. В ходе работы были получены референтные интервалы биохимических показателей крови самцов и самок собак породы бигль. Рассчитанные значения проанализированы как между собой, так и с аналогичными показателями из других источников литературы. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови собак и человека демонстрирует наличие некоторых видовых различий, которые необходимо учитывать в экспериментальной деятельности. Полученные референтные интервалы биохимических показателей рассматриваемого вида животных могут дать ценную информацию о моделируемой патологии или об изучаемых субстанциях в ходе проведения доклинического эксперимента и мониторинга здоровья животных.