Характеристика модели асцитной карциномы Эрлиха и перспективы ее применения в экспериментальной фармакологии ветеринарных препаратов

Введение

Проблема изыскания новых высокоэффективных фармакологических веществ по сей день не теряет своей актуальности [1]. В настоящее время биологическое моделирование различных патологических процессов является важнейшим методом научного познания, что определяет необходимость создания на лабораторных животных таких экспериментальных моделей, которые наиболее адекватно отражали бы патогенез возникновения, особенности течения и исход, возможность воздействия на происходящие процессы, а также механизмы выздоровления [2].

Проведение доклинических исследований лекарственных средств, в том числе предназначенных для ветеринарного применения, включает целый спектр методов экспериментальной фармакологии. Экспериментальные модели широко используются для выявления фармакологических свойств лекарственных веществ различных групп, что позволяет воссоздать в модельном организме определенное состояние, например, формирование иммуносупрессии для подтверждения эффекта новых иммуномодуляторов; установления потенциальных антибластомных свойств путем инициации опухолевого роста; моделирования искусственного инфекционного процесса при отработке схем назначения антибактериальных препаратов, а также определения безопасности, профилактической и терапевтической эффективности препаратов [3–5].

Одной из самых распространенных экспериментальных моделей опухолевого роста является асцитная карцинома Эрлиха (АКЭ). Исходной опухолью для нее послужил спонтанный рак молочной железы у самок мышей, полученный в 1905 г. двумя исследователями — Р. Ehrlich и Н. Apolant [6]. Они использовали ее в качестве экспериментальной путем подкожной трансплантации клеток карциномы от мыши к мыши. В 1932 г. Loewenthal и Jahn получили жидкую форму данной опухоли путем введения раковых клеток в перитонеальную полость, в результате чего образовывалась взвесь клеток карциномы в асцитной жидкости. Эти исследователи и предложили назвать данную опухоль «асцитная карцинома Эрлиха» [7].

Методика воспроизведения модели карциномы Эрлиха

Клетки АКЭ поддерживают in vivo в форме асцита у белых беспородных лабораторных мышей путем серийного внутрибрюшинного пассажа с интервалом 4–7 сут. Мыши содержатся в стандартных условиях вивария при свободном доступе к корму и воде и находятся под ежедневным наблюдением и контролем опухолевой прогрессии [8].

При моделировании асцитного варианта опухоли используют 7-⁠дневную суспензию клеток аденокарциномы Эрлиха, перевиваемую на белых беспородных лабораторных мышах-⁠самках массой 18–20 г. Для трансплантации опухоли опытным мышам интроперитонеально вводят по 3×10⁶ опухолевых клеток на мышь в объеме 0,2 мл с раствором Хенкса (pH 7,4). Для взятия асцитной жидкости животное-⁠опухоленоситель выводят из эксперимента путем передозировки СО₂ в специальной камере и фиксируют в положении на спине на специальном столике. Кожу с шерстным покровом в области вентральной брюшной стенки обрабатывают ватным тампоном, смоченным 70° этиловым спиртом, стерильным шприцем отбирают асцитную жидкость, используя чрезбрюшинный доступ [8].

При индукции солидного варианта опухоли суспензию первичных клеток аденокарциномы Эрлиха (1,5×10⁶ кл/⁠мышь) в 0,2 мл раствора Хенкса трансплантируют подкожно во внутреннюю часть бедра правой задней лапы экспериментальных животных белых лабораторных мышей [9].

Влияние исследуемых фармакологических веществ на опухолевый процесс можно исследовать как на стадии формирования, так и интенсивного роста опухоли. В первом случае ведут наблюдение за экспериментальными животными, в период которого фиксируют изменение количества животных с опухолью и размера опухоли (средний объем опухоли) в каждой группе животных [10].

В терминальные сутки эксперимента животных подвергают эвтаназии путем передозировки СО₂, после чего препарируют и отделяют поверхностный пласт опухолевой ткани для оценки массы опухоли. Эффективность противоопухолевой терапии исследуемыми соединениями оценивают по торможению роста опухоли в процентах в каждой группе животных-⁠опухоленосителей [9, 10].

Цитологические особенности форм АКЭ

Таким образом, аденокарцинома Эрлиха может существовать в виде двух штаммов: асцитного и подкожного (солидного).

У асцитной формы аденокарциномы Эрлиха клетки имеют округлую форму и диаметр около 30–40 мкм, хотя и имеет место значительная вариабельность вследствие неоднородности материала (плоидности) и разных стадий развития клеток [11].

Ядро занимает значительную часть клетки (рис. 1). Некоторые авторы отмечают его неправильную форму, наличие лопастей и выростов. Цитоплазматическая мембрана клеток АКЭ схожа с таковой у большинства клеток животного происхождения, имеет двойную структуру и пронизана порами диаметром около 30–40 нм [11]. Она не имеет каких-⁠либо специализированных структур, однако образует амебоидные выросты, при помощи которых осуществляется движение клетки в асцитной жидкости и увеличивается ее поверхность. Кроме того, данное образование участвует в активном захвате адсорбированного на наружной мембране вещества и окружающей жидкости (различные виды пиноцитоза) [11]. Основные органеллы асцитной клетки [эндоплазматический ретикулум (ЭПР), аппарат Гольджи, митохондрии] не отличаются по строению от таковых у нормотипичных клеток. Клетки АКЭ насыщены митохондриями удлиненной, чаще неправильной формы. Обычно они расположены неравномерно, так же как и ЭПР, концентрируясь с вогнутой стороны ядра и образуя зону интенсивного обмена [11, 12].

Состав ДНК-⁠липидов, хроматин-⁠липидов и ядерных матрикссвязанных липидов в опухолевых клетках значительно отличается от состава этих липидов в нормальных клетках. Почти во всех клетках АКЭ присутствует метацентрическая хромосома. Также обнаруживаются хромосомы со спорной вторичной перетяжкой. Особенно часто эти хромосомы встречаются в гипердиплоидной линии. Все остальные хромосомы акроцентрические и различаются только размерами [7].

Асцитная жидкость с клетками карциномы Эрлиха обычно имеет серо-⁠белый цвет, иногда розоватый оттенок и в среднем содержит 1×10⁶ клеток неоплазмы в 1 мл. Клетки АКЭ не прикрепляются к синтетическим поверхностям и растут в брюшной полости в виде суспензии. На 4-⁠е или 6-⁠е сутки роста АКЭ в брюшной полости мыши накапливается около 5–12 мл асцита [7].

Характеристика фаз развития АКЭ

Латентный период после инокуляции опухолевых клеток составляет около 4–6 дней. Средняя продолжительность жизни мышей при внутрибрюшинном введении 10–16 дней [13].

Рост опухоли происходит неравномерно, что проявляется в фазном изменении количества опухолевых клеток (рис. 2).

Обычно на кривой роста АКЭ различают 4 фазы: латентный период (лаг-⁠фаза) длится 1–5 сут; фаза экспоненциального роста (период логарифмического увеличения числа клеток, лог-⁠фаза) — 7–12 сут; стационарная фаза — плато, переходящая в терминальный период (фаза угнетения) — 13–16 сут, за которым следует гибель организма. Длительность лаг-⁠фазы зависит от величины инокулята. При достаточно значительном количестве вводимых клеток (4×10⁷ кл/⁠мл) лаг-⁠фаза не наблюдается, при малом количестве вводимых клеток латентный период может быть растянут до 15–20 сут [14, 15].

Во время перехода АКЭ из пролиферирующей фазы к терминальной в клетках опухоли развиваются метаболические и морфологические изменения: снижается число митохондрий, скорость синтеза ДНК и РНК; происходит потеря внутриклеточных пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеотидов и нуклеозидов; снижается концентрация и скорость образования АТФ, биосинтеза белка; увеличивается концентрация тимидина, снижается активность тимидинкиназы, концентрация глутатиона; повышается уровень триглицеридов, холестериновых эфиров и свободных жирных кислот. Однако в результате жизнеспособность клеток АКЭ существенно не изменяется [7].

Опухолевый рост сопровождается изменением доли популяций клеток в асцитной жидкости (рис. 3). Накопление асцитной жидкости в перитонеальной полости происходит параллельно росту АКЭ и в конечном счете является одним из факторов (помимо разрушающего действия неоплазии), приводящих к смерти животного-⁠опухоленосителя в результате давления, оказываемого на органы. Клетки АКЭ секретируют сосудорасширяющий фактор, который стимулирует накопление асцитной жидкости (но не нормальной плазмы и сыворотки) в перитонеальной полости [7]. В различных исследованиях показано промитотическое действие асцита на клетки АКЭ, а также увеличение регенерации поврежденных органов мыши-⁠опухоленосителя под действием промитотических EACF (Ehrlich ascites carcinoma factor) — факторов асцитной карциномы Эрлиха, однако опухолевые факторы, содержащиеся в асците, снижают пролиферацию клеток костного мозга и иммунокомпетентных клеток. Таким образом, асцитная жидкость вместе с факторами, секретируемыми АКЭ, оказывает защитное действие на клетки опухоли [16, 17].

Влияние АКЭ на иммунную систему

В ряде исследований показано иммуносупрессивное действие факторов, секретируемых АКЭ, на иммунную систему. Например, сиаломуцины, секретируемые АКЭ, способны связываться с сиалоадгезинами макрофагов, тем самым способствуя супрессии миелопоэза [18, 19]. Действие гуморальных факторов, секретируемых АКЭ [углеводов, простагландина E₂ (рrostaglandin E₂, PGE₂), фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) и др.], может способствовать нейтрофилезу, тромбоцитозу, экстрамедуллярному гематопоэзу, спленомегалии, иммуносупрессивному действию, изменениям в миелоидной составляющей костного мозга и селезенки, которые происходят при росте АКЭ [19–23]. Возможна секреция опухолью колониестимулирующих факторов [например, гранулоцитарно-⁠макрофагального колониестимулирующего фактора (granulocyte-⁠macrophage colony stimulating factor, GM-⁠CSF)], что может вести к увеличению числа клеток-⁠предшественников макрофагов и гранулоцитов. Способность гемопоэтических тканей продуцировать и рекрутировать фагоциты к месту инфекции и роста опухоли имеет центральное значение для обеспечения раннего иммунологического ответа [18]. При этом наблюдается массовая миграция этих клеток в кровь с последующим накоплением в селезенке [23]. Вырабатываемые клетками АКЭ растворимые протеины муцина-⁠1 (MUC-⁠1) препятствуют стимуляции Т-⁠клеток благодаря активации системы комплимента к анти-⁠MUC-⁠1-⁠антителам, связавшим антиген [24]. Экспрессия опухолевыми клетками во внеклеточное пространство трансформирующего фактора роста β (transforming growth factor beta, TGF-⁠β) ингибирует пролиферацию NK-⁠ и Т-⁠клеток через негативную регуляцию интерлейкином-⁠2 (IL-⁠2) пролиферативных сигналов [25, 26], а также функции Th [27, 28]. Обнаружено супрессивное действие опухолевых цитокинов на INF-⁠γ-⁠секретирующие клетки, в результате чего наблюдается торможение Т-⁠хелперов типа 1 (Th1) клеточного действия, приводя к недостаточной активности опухолеспецифичных Т-⁠лимфоцитов [29, 30].

Клетки аденокарциномы Эрлиха способны не только противостоять действию цитотоксических Т-⁠лимфоцитов (CTL клетки) и NK-⁠клеток, но и целенаправленно индуцировать механизмы программируемой гибели этих клеток (рис. 4). Установлено, что подобное действие малигнизированных клеток на иммуноциты осуществляется с помощью белков, один из которых является рецептором активированных клеток иммунной системы Fas (Apo-⁠1/⁠CD95), другой представляет его лиганд FasL (CD95L) и экспрессируется на цитоплазматической мембране злокачественно-⁠трансформированных клеток [31].

Таким образом, факторы, экспресcируемые клетками АКЭ, приводят к систематическому снижению адаптивного и врожденного иммунитета. Имеются данные о стимуляции АКЭ не только регуляторных Т-⁠лимфоцитов (клеток-⁠супрессоров лимфоцитарной активности, CD25⁺), но и супрессорных клеток миелоидного происхождения (myeloid-⁠derived suppressor cells, MDSC), которые способны ингибировать действие различных компонентов иммунной системы, подавляя развитие противоопухолевого ответа [32, 33]. Таким образом, очевидно влияние опухолевых клеток на иммунную систему, что позволяет исследовать эффекты препаратов, обладающих иммунотропной активностью.

Рост клеток неоплазмы в перитонеальной полости сопровождается инфильтрацией клетками иммунной системы и генерацией хронического воспаления в связи с продукцией в зоне роста опухоли таких хемоаттрактантов, как IL-⁠8, стимулирующий макрофаги протеин-⁠1 (Macrophage-⁠stimulating protein-⁠1, MSP-⁠1 и др.) [34]. Так, было показано повышение содержания циклооксигеназы-⁠1 [ЦОГ-⁠1 (COX1)] и индуцибельной NO-⁠синтазы (iNOS) в клетках перитонеальной жидкости, сопровождающееся увеличением содержания их продуктов (NO_х и PGE2) в ходе роста АКЭ [35, 36]. Кроме того, наблюдалось повышение уровней IL-⁠2, IL-⁠6, PGE2 и NO_х в сыворотке крови мышей на экспоненциальной фазе опухолевого роста [37].

Важным фактором миграции миелоидных клеток в процессе опухолевого роста, приводящим к их накоплению, в том числе и в крови, является GM-⁠CSF. При этом существуют данные как о противо-⁠, так и проопухолевом действии полиморфно-⁠ядерных гранулоцитов в ходе роста АКЭ [38].

Мигрировавшие в область опухоли моноциты становятся опухолеассоциированными макрофагами (tumor associated macrophages, TAM) двух типов: М1, проявляющими противоопухолевую активность через высокий синтез NO_х и провоспалительные цитокины, или М2, играющими важную роль в иммуносупрессии и прогрессии опухоли (рис. 5) [39].

Предполагается, что в течение лаг-⁠фазы макрофаги сохраняют активированный фенотип и контроль над ростом опухоли, однако со временем в асците происходит увеличение уровней PGE2, IL-⁠10, VEGF, TGFβ и других факторов опухолевого микроокружения (гипоксия, измененный рН), что стимулирует переход фенотипа макрофагов из М1 в М2 [39–43]. Выявлено накопление MDSC в перитонеальном экссудате мышей с АКЭ уже на 6-⁠е сутки роста опухоли, при этом содержание клеток MDSC в крови не изменяется [35].

Следует отметить, что АКЭ в ходе опухолевого роста способна изменять активность различных иммунокомпетентных клеток. Например, вызывать состояние пониженной реактивности Т-⁠лимфоцитов на энтеротоксин Staphylococcus aureus главным образом благодаря влиянию на CD8⁺ Т-⁠клетки, а также вызывая уменьшенную экспрессию IFN-⁠γ [22]. Кроме того, выявлена повышенная способность к образованию активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами крови и макрофагами перитонеальной жидкости на поздних стадиях развития опухоли при стимуляции клеток опсонизированным зимозаном и Candida albicans [44].

Заключение

Хорошая воспроизводимость in vivo, возможность роста в двух формах тканевой организации, высокая способность к трансплантации, отсутствие регрессии, быстрая пролиферация, 100% злокачественность, отсутствие опухолеспецифического трансплантационного антигена (Tumor-⁠specific transplantation antigen, TSTA), а также относительная стабильность гистопатологических свойств позволяют использовать перевиваемую аденокарциному Эрлиха для решения многих задач в экспериментальной фармакологии. Информация об особенностях взаимодействия модели с тестируемыми на ней соединениями поможет получить новые данные не только о свойствах тестируемых агентов, а также позволит оценить биологические характеристики используемых экспериментальных моделей [6, 45, 46].

Модель АКЭ хорошо зарекомендовала себя при скрининге веществ, обладающих антибластомными свойствами, и оценке эффективности противоопухолевых препаратов. Также получено много информации о реализации механизмов ингибирующего действия исследуемых веществ на рост опухоли, в первую очередь за счет влияния на основные процессы канцерогенеза, подавления клеточной пролиферации, стимуляции апоптоза в трансформированных клетках, а также вследствие повышения противоопухолевого иммунитета.

Данная модель как в асцитной, так и в солидной форме позволяет воспроизводить онкогенез у лабораторных животных и изучать влияние фармакологических веществ на опухолевый рост и состояние иммунного ответа в условиях опухолеиндуцированной иммуносупрессии и хронического воспалительного процесса, а также исследовать механизмы адаптации клеток, в том числе иммунной системы, в условиях действия факторов канцерогенеза.