Шекунова Е.В., Малышкин А.А., Кашкин В.А Модель гипералгетического прайминга, вызванного лоперамидом, у крыс. Лабораторные животные для научных исследований. 2018; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-03-07
Субплантарное введение простагландина Е2 (ПГЕ2) крысам приводит к развитию кратковременного повышения чувствительности к болевым стимулам (гипералгезия). Предварительное введение индукторов болевой реакции (например, каррагенина) ведет к значительному увеличению выраженности и продолжительности вызванной ПГЕ2 гипералгезии (феномен гипералгетического прайминга). Гипералгетический прайминг рассматривается как модель перехода острой боли в хроническую. Известно, что 3 последовательные интрадермальные инъекции высоко селективного агониста µ-опиоидного рецептора DAMGO индуцируют механическую гипералгезию, а также вызывают усиление эффекта ПГЕ2, т.е. способны инициировать развитие гипералгетического прайминга. Цель данного исследования – разработка модели развития гипералгетического прайминга у крыс с использованием периферического агониста опиатных рецепторов лоперамида. Для индукции длительного гипералгетического состояния использовали 3-кратное введение лоперамида в дозе 2 мкг на 1 животное. Лоперамид вводили в плантарную поверхность тазовой конечности крысы, объем введения 10 мкл. Повторные введения лоперамида осуществляли с интервалом в 1 ч. Через 1 ч после последнего введения лоперамида крысы получали инъекцию ПГЕ2, субплантарно в дозе 5 мкг на 1животное. Болевую чувствительность оценивали по порогу реакции на механическую стимуляцию плантарной поверхности лапы. Показано, что 3-кратное периферическое введение лоперамида (в отличие от 1-кратного) не обладает обезболивающим эффектом в отношении ноцицептивной реакции, вызванной ведением ПГЕ2, что свидетельствует о развитии острой толерантности к анальгетическому эффекту лоперамида. Кроме того, 3-кратное введение лоперамида привело к развитию длительного гипералгетического состояния после введения ПГЕ2, что можно рассматривать как феномен гипералгетического прайминга. В отличие от прайминга, вызываемого таким воспалительным агентом как каррагенин, на развитие которого требуется от 3 до 5 дней, прайминг, вызванный лоперамидом, развивается в течение 4 ч после последней инъекции лоперамида. В результате разработана простая и хорошо воспроизводимая методика по оценке эффективности веществ, способных предотвращать развитие гипералгических состояний, которые могут возникнуть в результате повторного введения опиатов.
Большинство экспериментальных моделей, разработанных с целью изучения хронической боли, не позволяют отделить острую боль от начала тех нейропластических изменений, которые ведут к возникновению и поддерживают развитие хронических болевых состояний. Клинические наблюдения показали, что 1-кратное повреждение тканей может вызывать долговременные процессы в первичных ноцицепторах, что ведет к повышению их чувствительности с последующим развитием гипералгезии. Предположительно, что изменение функционального состояния первичных ноцицепторов в результате болевого воздействия – один из основных механизмов, ведущих к формированию хронического болевого синдрома [1]. Механизм нейрональной пластичности в первичных афферентах, посредством которого острое воспаление или какой-либо другой стрессор может запустить долговременную гиперчувствительность ноцицепторов к воспалительным агентам, получил название «гипералгетический прайминг» (ГП). Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что ГП представляет собой не только базовый патофизиологический механизм возникновения хронических болевых состояний, но также является ключевым элементом в понимании природы многих хронических болевых синдромов. Хотя клеточные механизмы ГП локализованы в терминалях первичных афферентов, аномальная активность афферентов может выступать триггером пластических изменений в центральной нервной системе (центральная сенситизация). Поэтому некоторые авторы рассматривают этот феномен как модель перехода острой боли в хроническую [1, 2].
В эксперименте кратковременное воспаление индуцируется путем интрадермальной инъекции низкой дозы воспалительного агента, например, каррагенина. Индуцированное воспаление сопровождается развитием гипералгезии (сокращение латентного периода реакции на болевой стимул). Острое воспаление, так же как и гипералгезия, длится не более 4 дней, после чего никаких патологических изменений у животных не фиксируется. Однако если 1 нед спустя будет введен другой воспалительный агент, то этот новый стимул вызовет существенный гипералгетический ответ. Например, инъекция провоспалительного фактора простагландина Е2 (ПГЕ2), которая у интактной крысы в норме вызывает непродолжительный гипералгетический ответ, у животного, которое уже было праймировано другим воспалительным агентом, вызовет более длительную и выраженную гипералгезию. Кроме того, увеличение продолжительности гипералгетического ответа сопровождается сдвигом кривой «Доза ПГЕ2-выраженность гипералгезии» влево [1]. Гипералгезия, кроме ПГЕ2, может быть вызвана другими медиаторами воспаления, такими как аденозин или серотонин [1].
Первые исследования механизмов ГП показали, что при развитии ГП происходит изменение функционирования системы внутриклеточных посредников. Гипералгезия, вызванная введением ПГЕ2, опосредуется в основном активацией каскада цАМФ – протеинкиназа А (ПКА) в первичных ноцицепторах, в результате чего она значительно снижается на фоне введения ингибиторов ПКА в рецептивные поля этих нейронов. Возникающий на фоне индукции ГП пролонгированный гипералгетический ответ не чувствителен к ингибиторам ПКА, а, как показали исследования, снижается при селективном ингибировании эпсилон-изоформы протеинкиназы С (ПКС). Более того, опосредованный ПКС ответ не заменяет ответ, опосредованный активацией ПКА, а добавляется к нему [1].
Хроническое введение агонистов µ-опиоидных рецепторов приводит к развитию толерантности к анальгетическому эффекту, более того, формируется повышенная чувствительность к болевым стимулам, известная как феномен опиат-индуцированной гипералгезии [3, 4]. Высказывается предположение, что в основе развития толерантности к опиатным анальгетикам и в развитии гипералгетических состояний, сопровождающих хронические болевые синдромы, лежат одни и те же молекулярные механизмы, в частности, активация протеинкиназ в первичных ноцицепторах [5, 6]. Возможно, неэффективность обезболивания, связанная, например с развитием толерантности к анальгетическим эффектам опиатов, и развитие ГП – это процессы, которые в своей основе могут иметь общие молекулярные механизмы [5, 6]. Торможение нейропластических изменений, ассоциированных с развитием ГП, может представлять собой новое направление в терапии боли, направленное на возобновление чувствительности к опиоидам [2]. Поэтому так необходимо изучать влияние агонистов опиатных рецепторов периферического действия на развитие ГП с целью возможности купирования развития хронической боли на этапе перехода от острой боли к формированию тех нейропластических изменений, в результате которых поддерживается состояние хронической боли.
Цель данного исследования – разработка модели индукции гипералгетического прайминга с использованием периферически активного агониста опиоидных рецепторов лоперамида у крыс.
Эксперименты выполнены на самцах крыс линии Wistar массой 200–250 г (питомник «Рапполово», Россия). Животных содержали в условиях 24-часового фоторежима (12 ч день : 12 ч ночь, включение света в 8:00), контролируемой температуры (22±2ºC) и влажности (65±10%) воздуха при свободном доступе к очищенной воде и стандартному корму (гранулированный комбикорм). За 1 нед до начала эксперимента животные были рассажены в клетки индивидуального содержания.
Все экспериментальные процедуры выполнены в ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, согласно рекомендациям Руководства по использованию лабораторных животных для научных и учебных целей [7].
Перед основной частью исследования была проведена серия экспериментов для выбора эффективной дозы лоперамида. В 2 группах животным (n=6) с интервалом в 1 ч вводили 3 инъекции лоперамида в плантарную поверхность задней лапы в дозах 2 мкг и 10 мкг на животное (за одно введение). Объем однократного субплантарного введения составил 10 мкл. Введение осуществляли с помощью гамильтоновского шприца и катетера. Гипералгезию оценивали по увеличению чувствительности (в г) к механической стимуляции с помощью электронного аналгезиметра (IITC Inc., CA, США) через 1 ч после последней инъекции.
В основной части эксперимента физиологический раствор (Ф), растворы лоперамида (Л) и/или простагландина Е2 (ПГЕ2) вводили в плантарную поверхность задней лапы крысы. Лоперамид вводили в объеме 10 мкл, ПГЕ2 – 50 мкл. Доза лоперамида – 2,0 мкг на 1 животное за 1 инъекцию, ПГЕ2 – 5,0 мкг на 1 животное;
4 группы животных получали препараты по следующим схемам:
Статистическая обработка. Для анализа данных применяли двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями, в случае обнаружения достоверного влияния исследуемого фактора последующие межгрупповые сравнения были проведены с использованием критерия Бонферрони. Различия были определены при уровне значимости р<0,05. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения SPSS v16 (IBM Corp., США).
Перед проведением основной части исследования была определена доза периферического агониста опиоидных рецепторов лоперамида. В данной серии экспериментов животные получали 3 инъекции лоперамида с интервалом в 1 ч, в дозах 2 и 10 мкг/кг. Изменение механической чувствительности оценивали через 1 ч после последней инъекции. Лоперамид в дозе 10 мкг вызывал выраженное повышение чувствительности к механической стимуляции, которое фиксировалась через 1 ч после последней инъекции (см. таблицу). При введении в более низкой дозе – 2 мкг – лоперамид не вызывал изменения чувствительности. Для дальнейших исследований была выбрана доза лоперамида 2 мкг.
Результаты основного эксперимента показали, что простагландин Е2 (ПГЕ2) (ФФФ + ПГЕ2) вызывал гипералгетический ответ, максимально выраженный через 60 мин после инъекции (снижение порога чувствительности на 70% по сравнению с исходным уровнем) (см. рисунок). Как видно на рисунке, 1-кратная инъекция лоперамида (2 мкг, одновременно с ПГЕ2) (ФФЛ + ПГЕ2) снижала вызванную ПГЕ2 гипералгезию через 1 ч после инъекции (21,0±5,0 г) в группе, получавшей ПГЕ2 (ФФФ + ПГЕ2) и 58,6±7,0 г – в группе, получавшей лоперамид вместе с ПГЕ2 (ФФЛ + ПГЕ2). Таким образом, лоперамид при 1-кратном введении оказывал выраженное антиноцицептивное действие.
Введение лоперамида 3-кратно не оказывало антиноцицептивного эффекта, т.е. лоперамид не снижал вызванную ПГЕ2 гипералгезию через 1 ч после инъекции ПГЕ2 (группа ЛЛЛ + ПГЕ2). Повышенная чувствительность к механической стимуляции у этих животных сохранялась в течение 4 ч. Полученные данные свидетельствуют о развитии ГП, т.е. потенциале гипералгетического ответа, вызванного ПГЕ2 на фоне 3-кратного введения лоперамида (см. рисунок). В то же время 3-кратное введение лоперамида с последующим введением физиологического раствора не изменяло порог чувствительности. Через 1 сут пороги реакции возвращались к норме во всех экспериментальных группах.
Гипералгезию оценивали по увеличению чувствительности (в г) к механической стимуляции с помощью электронного анальгезиметра. Данные представлены в виде средних значений порога отдергивания тазовых конечностей (M ± SEM).
Согласно результатам проведенного исследования, 3-кратное (в течение 3 ч) введение лоперамида в дозе 2 мкг с последующим введением ПГЕ2 приводит к развитию толерантности к анальгетическому эффекту лоперамида. Это выражалось в отсутствии анальгетического эффекта в группе, получившей 3 последовательные инъекции лоперамида и ПГЕ2 через 1 ч после завершения введений, в то же время в группе, получившей лоперамид 1 раз, ПГЕ2 не вызвал ноцицептивной реакции, т.е. лоперамид продемонстрировал обезболивающий эффект. Через 4 ч в группах, получивших 1 раз лоперамид и ПГЕ2 пороги реакции были близки к нормальным значениям, но в группе, получившей 3 инъекции лоперамида и ПГЕ2, по-прежнему, сохранялось состояние повышенной чувствительности к механической стимуляции, что свидетельствует о развитии ГП. Как показывают исследования последних лет, развитие острой толерантности к анальгетическим эффектам опиатов и ГП – процессы, в основе которых лежат сходные молекулярные механизмы [2]. Предполагается, что основной мишенью является эпсилон-изоформа протеинканизы С [8].
Развитие хронической толерантности легко воспроизводится в лабораторных условиях на различных видах животных, где схема эксперимента основана на многократных инъекциях опиатов в течение нескольких дней или длительной инфузии с помощью имплантированных осмотических мини-насосов [9, 10]. Однако было замечено, что продолжительность опиатной аналгезии значительно меньше, чем можно было бы предположить, исходя из кривой «время–концентрация» [11]. В результате возникла гипотеза о развитии острой толерантности фармакодинамической природы к анальгетическому действию опиатов. В экспериментальных условиях на моделях развития хронической толерантности было продемонстрировано, что степень развития толерантности находится в обратной зависимости от внутренней активности агониста опиатных рецепторов [12]. Так, например, в отношении морфина, более слабого агониста, степень развития толерантности к анальгетическому эффекту выше, чем в отношении фентанила, более сильного агониста. Исследования Киссина и соавт. (1991) показали, что острая толерантность в отличие от хронической не имеет связи с анальгетическим потенциалом опиата [13], что предполагает различные механизмы в основе развития этих 2 видов толерантности [14].
Большинство экспериментальных подходов к изучению механизмов развития толерантности связано с выработкой хронической толерантности. Однако именно развитием острой толерантности объясняется снижение продолжительности анальгетического действия опиатов после 1-кратной инъекции. Например, существует мнение, что применение опиатов до и во время хирургической операции ведет к снижению их эффективности в послеоперационном периоде [15, 16]. Хотя механизмы развития острой и хронической толерантности к анальгетическому эффекту опиатов могут различаться, следует отметить, что запускаемые при действии агониста опиоидных рецепторов такие процессы внутриклеточной адаптации, как десенситизация и down-регуляция рецепторов, вносят вклад в развитие, как острой, так и хронической толерантности [14]. В то же время необходимо детальное изучение механизмов развития острой толерантности. Это важное направление экспериментальных исследований, создает основу для поиска фармакологических средств, предотвращающих развитие острой толерантности, а значит средств, которые могут пролонгировать и усиливать анальгетическое действие опиатных анальгетиков после их 1-кратного применения.
Таким образом, разработан простой протокол, позволяющий оценивать фармакологическую эффективность веществ, обладающих не только анальгетической активностью, но и потенциалом предотвращать развитие толерантности к антиноцицептивному эффекту опиатов.
Данное экспериментальное исследование выполнено в рамках Государственного задания № 056-00016-18-01
ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова МЗ РФ и
№ АААА-А18-118012290373-7 Института эволюционной физиологии
и биохимии
им. И П. Сеченова РАН.