Бочарова О.А, Ревищин А.В., Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Кучеряну В.Г., Уткина М.В., Матвеев В.Б., Павлова Г.В. Возможности регуляции численности дофаминергических нейронов в профилактике гепатокарцином. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 2. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-02-06
Целью работы явилось изучение возможности регуляции численности дофаминергических нейронов у высокораковых мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при спонтанном гепатоканцерогенезе. Мыши профилактически получали стандартизованный комплексный фитоадаптоген (КФА), включающий компоненты 40 водноспиртовых растительных экстрактов, в том числе адаптогенов женьшеня, лимонника, родиолы розовой, а также соединения фенольной природы. КФА обладает антимутагенными, антиоксидантными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми свойствами. Опытные животные получали 10% раствор КФА с питьевой водой в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза, включая период (5–15-й день жизни), соответствующий завершению дифференцировки нормальной ткани печени. Уровень дофаминергических нейронов определяли иммуногистохимически по количеству тирозингидроксилаза-позитивных клеток в среднем мозге. Уровень молодых нейронов определяли иммуногистохимически по количеству Ki67-позитивных клеток в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампальной формации. Применение КФА в профилактическом режиме способствует сохранению высокой численности дофаминергических нейронов головного мозга в позднем онтогенезе мышей-самцов линии СВА. Предотвращение потери дофаминергических нейронов при воздействии КФА согласуются с предыдущими данными, полученными у мышей C57BL с индуцированным паркинсонизмом. В этом случае КФА предупреждал гибель дофаминергических нейронов головного мозга по типу апоптоза, подавляя уровень каcпазы-3, при этом двигательная активность животных восстанавливалась. Учитывая возможность регуляции численности дофаминергических нейронов головного мозга, экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках периферической крови, сывороточного содержания цитокинов-6 и -10, стресс-гормона кортикостерона, уровня опухолеобразования, а также выживаемости и качества жизни мышей-самцов СВА, можно полагать роль центральных нейрональных и периферических иммуноадгезионных механизмов в контроле развития экспериментальных гепатокарцином. Вместе с тем следует учесть, что модуляция центрального и периферического дофаминов, которые напрямую связаны друг с другом, позволяет детализировать механизмы усиления опухолевого роста при хроническом стрессе.
В ранее проведенных исследованиях у мышей-самцов СВА, генетически предрасположенных к развитию гепатокарцином, при профилактическом воздействии (в раннем постнатальном онтогенезе) комплексного фитоадаптогена (КФА) наблюдали снижение частоты опухолеобразования на 32%, числа и размеров опухолей. При этом выживаемость увеличилась на 16%. Противоопухолевый эффект КФА сопровождался повышением двигательной активности мышей, сохранением стабильной массы тела, удовлетворительным качеством волосяного покрова. Это сочеталось c повышением экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови, инфильтрацией гепатом лейкоцитами и деструкцией опухолевых узлов, снижением сывороточного уровня интерлейкинов-6 и -10 [1–5]. Полученные результаты по увеличению продолжительности жизни послужили основанием для оценки динамики численности дофаминергических нейронов (ДА-нейронов) в головном мозге мышей СВА и определения возможности ее регуляции с помощью КФА.
Потеря ДА-нейронов играет существенную роль при старении и стрессе. Нейромедиатор дофамин, содержащийся в ДА-нейронах, является центральным регулятором продолжительности жизни, антидепрессантом и противоопухолевым агентом. Дофамин синтезируется как в центральной нервной системе, так и в периферическом организме (вне головного мозга). Наблюдается прямая корреляция между уровнями центрального и периферического дофамина. Дофамин также способствует дифференцировке цитотоксических CD8+лимфоцитов периферической крови, конъюгации их с опухолевыми клетками, участвуя в активных фазах иммунного ответа [6, 7].
Целью настоящей работы явилось изучение возможности регуляции численности дофаминергических нейронов у высокораковых мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при спонтанном гепатоканцерогенезе.
В исследование включены 230 мышей-самцов линии СВА. Источник получения мышей: локальная колония ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с требованиями Европейской директивы по охране животных, используемых в научных целях. Мыши I контрольной группы (n = 90) получали в качестве питья воду. Поскольку КФА является водно-спиртовым экстрактом, мыши II контрольной группы (n = 60) получали 3% раствор этанола в воде (что соответствует концентрации этанола в получаемом животными препарате). Результаты определения изучаемых параметров в обеих контрольных группах не имели достоверных различий, поэтому мыши этих групп были объединены в одну контрольную группу (n = 150). Мыши опытной группы (n = 80) получали 10% раствор КФА с питьевой водой в профилактическом режиме –
в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза, включая период (5–15-й день жизни), соответствующий завершению дифференцировки нормальной ткани печени. КФА получали самки, начиная с последних сроков беременности, до отъема детенышей в возрасте 3 нед. Затем в течение 1 нед детеныши-самцы пили воду с препаратом самостоятельно.
В исследовании применили воздействие нетоксичного природного иммуномодулятора – комплексного фитоадаптогена (КФА), стандартизованного биологическим и химическим методами, и включающего компоненты 40 водноспиртовых растительных экстрактов, в том числе адаптогенов женьшеня (Panax ginseng), лимонника (Schisandra chinensis), родиолы розовой (Rhodiola rosea), а также соединения фенольной природы (флавоноиды, тритерпеновые гликозиды и др.) [8–11]. КФА обладает иммуномодулирующими, в том числе адгезиогенными, антиоксидантными, антимутагенными, гормономодулирующими, нейропротекторными свойствами [12–16].
Уровень ДА-нейронов определяли иммуногистохимическим методом по количеству тирозингидроксилаза-позитивных клеток в среднем мозге. Уровень молодых нейронов определяли иммуногистохимическим методом по количеству Ki67-позитивных клеток в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампальной формации. Показатели оценивали ввозрасте животных 3–4 и 21–22 мес. Статистический анализ результатов проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ONE–WAYANOVA программы Statistica 6,0, достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты подсчета численности ДА-нейронов, иммунопозитивных по тирозингидроксилазе, представлены в табл. 1. На рис. 1 показана микрофотография среза мозга мыши, окрашенного на тирозингидроксилазу.
Как следует из табл. 1, количество ДА-нейронов среднего мозга у молодых половозрелых (3–4 мес) мышей-самцов контрольной группы составило 11 824±480. При увеличении возраста и на фоне спонтанного опухолеобразования наблюдали статистически достоверное снижение данного показателя на 29% (до 8460±343; р=0,0002).
Профилактическое воздействие КФА препятствовало снижению ДА-нейронов по сравнению с этим показателем у контрольных животных в возрасте 21–22 мес (11 236,2±554,7; р=0,001).
Таким образом, кратковременное введение КФА в раннем онтогенезе приводит к предупреждению возрастного снижения количества ДА-нейронов головного мозга у мышей СВА. В данном случае мы имеем дело не только с процессом старения, но и со спонтанным гепатоканцерогенезом. Поэтому указанный эффект может быть опосредован влиянием КФА как на процессы старения, как на механизмы канцерогенеза, так и на то и другое одновременно.
В результате показана высокая положительная корреляция между численностью ДА-нейронов в позднем онтогенезе и продолжительностью жизни мышей (R = +0,93±0,02). Вместе с тем выявлена высокая обратная зависимость между численностью ДА-нейронов и частотой спонтанных гепатокарцином у мышей-самцов СВА (R = – 0,91±0,03).
Результаты подсчета количества пролиферирующих молодых нейронов представлены в табл. 2. На рис. 2 показана микрофотография среза мозга мыши, окрашенного на Ki67 белок. Из данных табл. 2 следует, что численность молодых нейронов, экспрессирующих Ki67, у высокораковых мышей СВА в возрасте 3–4 мес составила 116,0±8,3. В возрасте 22 мес у этих мышей изучаемый показатель снизился до 13,9±1,6 (р<0,00014). Количество пролиферирующих нейронов при профилактическом воздействии КФА у старых мышей не изменилось в сравнении с контрольными животными в этом же возрасте (13,2±1,8; р = 0,97). На нейрогенез КФА не повлиял. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что дофамин ингибирует нейрогенез во взрослом гиппокампе. Предупреждение потери ДА-нейронов может снижать необходимость их восполнения. Поэтому усиление пролиферации молодых нейронов не является оправданным, что и подтверждают полученные данные.
Результаты предупреждения потери ДА-нейронов при воздействии КФА согласуются с ранее полученными данными у мышей C57BL с индуцированным паркинсоническим синдромом, где выявлено, что КФА предотвращает гибель ДА-нейронов головного мозга по типу апоптоза, подавляя уровень каспазы-3. При этом нарушенная двигательная активность животных восстанавливалась [14].
Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что, с одной стороны, снижение численности ДА-нейронов у старых мышей СВА по сравнению с молодыми подтверждает данные литературы о возрастном уменьшении количества ДА-нейронов и, соответственно, уровня дофамина. Действительно, с одной стороны, потерю ДА-нейронов считают ключевым центральным фактором старения [6]. С другой стороны, предупреждение уменьшения числа ДА-нейронов под воздействием КФА коррелирует со снижением уровня гепатокарцином, повышением жизнеспособности и качества жизни высокораковых животных [5]. Учитывая известные из литературы геропротекторные, антидепрессантные и противоопухолевые свойства дофамина, можно полагать единую логику событий (объединенную комплексом активности этого катехоламина), демонстрирующую протекторное действие КФА на дофаминергическую систему головного мозга.
Применение КФА кратковременно в раннем онтогенезе способствует сохранению высокой численности ДА-нейронов головного мозга в позднем онтогенезе мышей-самцов линии СВА. Учитывая возможности регуляции численности ДА-нейронов головного мозга, экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках периферической крови, сывороточного содержания цитокинов-6 и -10, стресс-гормона кортикостерона, уровня опухолеобразования, а также выживаемости и качества жизни мышей-самцов СВА, можно полагать роль центральных нейрональных и периферических иммуноадгезионных механизмов в контроле развития экспериментальных гепатокарцином. Вместе с тем следует учесть, что модуляция центрального и периферического дофаминов, которые напрямую связаны друг с другом, позволяет детализировать механизмы усиления опухолевого роста при хроническом стрессе.
По результатам исследования сделаны следующие выводы:
О.А. Бочарова – дизайн исследования, редактирование текста рукописи (research design, editing of the manuscript text).
А.В. Ревищин – проведение экспериметов, описание методов (performing experiments, methods description).
Е.В. Бочаров – проведение экспериментов, обработка результатов, написание текста рукописи, (performing experiments, processing results, writing the text of the manuscript).
Р.В. Карпова – написание текста рукописи, подбор литературы (writing the text of the manuscript, selection of literature).
В.Г. Кучеряну – проведение экспериментов, подбор литературы (performing experiments, selection of literature).
М.В.Уткина – обработка результатов (processing results).
В.Б. Матвеев – консультативный анализ исследования и рукописи (consultative analysis of the research and the manuscript).
Г.В. Павлова – дизайн исследования, редактирование текста рукописи (research design, editing of the manuscript text).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.