Методические аспекты проведения ДНК-комет-теста в условиях in vivo в доклинических исследованиях

Введение

Постоянное воздействие негативных факторов окружающей среды (физических, химических и др.) в диапазонах интенсивности, выходящих за границы биологического оптимума жизнедеятельности, может приводить к повреждению генома. Это происходит как за счет прямого влияния (например, повреждение молекул ДНК ионизирующим излучением по принципу «мишени»), так и опосредовано, за счет образования в клетке свободных радикалов и активных форм кислорода. Угнетение и нарушение работы систем репарации ДНК приводят к накоплению повреждений, что в свою очередь приводит к закрепляемым мутациям, онкогенезу и гибели клеток. Образование повреждений ДНК – важное инициирующее событие в развитии патологических процессов в организме. В связи с этим особую актуальность приобретает оценка повреждений в структуре ДНК на ранних этапах, когда патологические процессы в организме еще не могут быть диагностированы на физиологическом уровне [2, 3]. Предупреждение контакта живых организмов с химическими соединениями (в том числе лекарственными средствами), способными оказывать генотоксическое действие, представляется наиболее конструктивным способом защиты от последствий индуцированного мутагенеза, поэтому возникает необходимость в совершенствовании методов для определения мутагенных свойств  соединений [4].

Метод ДНК-комет (Сomet assay, «комета-тест», электрофорез нуклеотидов отдельных клеток в геле агарозы) является наиболее перспективным из имеющихся на сегодняшний день тестов по оценке генотоксичности и канцерогенности различных химических соединений. Это быстрый и чувствительный тест, предназначенный для обнаружения повреждений ДНК и изучения эффективности функционирования систем репарации ДНК на уровне отдельных ядросодержащих клеток, при воздействии широкого спектра повреждающих агентов химической, физической и биологической природы. Данный метод также может применяться для оценки целостности генома. Преимущество метода – простота, небольшое количество экспериментального материала, экономичность, быстрота получения результатов, высокая чувствительность и производительность [4].

Значимость данного метода трудно переоценить, тем не менее важно учитывать биоэтические аспекты научных исследований. Для проведения исследования по оценке генотоксичности соединений методом ДНК-комет минимальное число животных для каждой группы составляет 5 самцов и 5 самок. При этом помимо экспериментальных групп животных, в исследование должны включаться 2 контрольные группы: интактные животные и животные, получающие вещество с доказанной мутагенной активностью (например, этилметансульфонат – ЭМС). При самых скромных подсчетах для проведения исследования необходимо приблизительно 50 голов животных. Согласно Руководству ICH S2 (R1) и Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств, ДНК-комет-тест входит в стандартную батарею тестов по изучению безопасности химических соединений. В соответствии с данными руководствами и принципами гуманности рекомендовано проведение ДНК-комет-теста в рамках исследования общетоксических свойств (в частности хронической и субхронической токсичности) с целью сокращения числа участвующих в эксперименте животных.

Традиционно анализируемые ткани в ДНК-комет-тесте готовят из небольшого свежего фрагмента ткани, используемого сразу после некропсии животных. Агенты, вызывающие повреждение ДНК, в первую очередь воздействуют на органы кроветворения (костный мозг, селезенка), биотрансформации (печень, почки) и специфические органы-мишени. В связи с этим используется ДНК-комет-тест для большого количества органов, что приводит к необходимости их криоконсервации для дальнейшего исследования. Замороженные клетки и ткани некоторые исследователи считают непригодными для теста, другие успешно применяют заморозку образцов. Основной проблемой экстренной заморозки является кристаллизация внутриклеточной жидкости, что приводит к разрушению клеточной структуры, в том числе и ядерной ДНК, необходимой для анализа [5].

Цель исследования заключалась в адаптации проведения ДНК-комет-теста в условиях in vivo с подбором условий криоконсервации образцов тканей. В данной работе представлены методические рекомендации при осуществлении ДНК-комет-теста и ключевые особенности сохранения образцов органов и тканей животных для последующего анализа.

Общие принципы ДНК-комет-теста

Первым успешным опытом исследования повреждений ДНК индивидуальных клеток принято считать работу шведских ученых Д. Остлинга и К. Йохансона (1984) [1]. Основные процедуры метода ДНК-комет, описанные в первоначальном варианте метода, заключались в иммобилизации облученных клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло. Далее проводили лизис клеточных мембран и экстракцию белков в растворе с высоким содержанием соли. Молекулы ДНК разделяли электрофорезом, треки ДНК окрашивали флюоресцентным красителем, после чего образцы изучали микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к ее релаксации, формируются фрагменты ДНК. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий хвост кометы. Кометы анализируют либо визуально с дифференциацией по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений [3].

В 1988 г. предложена модификация метода ДНК-комет [6]. В ней предлагалось подвергать лизированные клетки щелочной обработке для денатурации ДНК и последующего электрофореза в щелочной среде, что позволяло улучшить качество метода (появилась возможность обнаружения однонитевых разрывов ДНК и щелочелабильных сайтов, в которых разрывы ДНК образуются при щелочных условиях среды) и повысить его чувствительность и воспроизводимость, однако это практически не затрагивает основные принципы метода [7, 8]. Большинство лабораторий, внедривших данный методический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности, касающихся продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК [2].

На базе лаборатории клеточной биологии и цитогенетики (АО НПО «Дом Фармации», Ленинградская область, 2019) отработана методика ДНК-комет-теста в условиях in vivo. В качестве тест-системы использовали самцов и самок аутбредных крыс в возрасте 6–8 нед. Для теста выбраны печень, почки (как органы биотрансформации и выведения), селезенка, костный мозг (как органы кроветворения). Для сохранения образцы подвергали экстренной заморозке при температуре -80°C. Гомогенизированные органы иммобилизировали в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Далее образцы лизировали в буфере с высоким содержанием соли. После щелочной обработки молекулы ДНК разделяли электрофорезом в щелочной среде, треки ДНК визуализировали при помощи флюоресцентного красителя SYBR Green I (например, Sigma-Aldrich, США), после чего проводили микроскопию. Общая схема постановки теста представлена на рис. 1.

Выбор животных

Эксперимент предпочтительно проводить на мелких лабораторных грызунах – мышах или крысах, половозрелых самцах и/или самках. Также допускается использование других видов животных, если это научно обосновано. Во избежание большого разброса оцениваемых показателей необходимо использовать генетически однородных животных, отклонение по массе тела и возрасту которых на момент эксперимента не должно превышать 10%. Ни одна из инбредных или аутбредных линий не выделяется как предпочтительная [9, 10].

В целях уменьшения количества задействованных животных, а также оптимизации и удешевления ДНК-комет-тест допускается проводить в рамках исследования общетоксических свойств химических соединений, в частности хронической токсичности [9, 11].

Вещества для положительного контроля

В качестве положительного контроля используют вещества супермутагены, оказывающие генотоксическое действие. Наиболее часто применяют ЭМС (например, Chem Cruz, США) в дозе 200 мг/кг, также могут быть выбраны и другие вещества, если это научно обосновано. Примеры веществ, дающих генотоксический эффект, некоторые их ткани-мишени и используемые дозы приведены в таблице. Животных подвергают эвтаназии через 3 ч после введения контрольных веществ.

Особенности криоконсервации органов лабораторных животных

Поскольку объект для ДНК-комет-теста – целый ряд органов и тканей, анализ может быть продолжителен по времени, поэтому требуется криоконсервация для дальнейшего постепенного их исследования. Для проведения ДНК-комет-теста достаточно небольшого фрагмента исследуемого органа, оставшийся фрагмент подлежит рутинному гистологическому анализу (если это предусмотрено дизайном эксперимента). Этот аспект весьма  важен при проведении ДНК-комет-теста в рамках изучения хронической токсичности. В ходе различных экспериментов выявлено, что наилучшим методом сохранения фрагментов органов и тканей без разрушения ядерной ДНК является экстренная заморозка в морозильной камере при -80°C в фосфатно-солевом буфере, содержащем 20 мМ ЭДТА и 10% диметилсульфоксид (ДМСО) [5].

Очень важно не давать препаратам долго нагреваться выше 2–8°C до и после заморозки, так как ДМСО при нагревании оказывает генотоксическое действие [17].

Процедуру сохранения органов и тканей необходимо наладить таким образом, чтобы препараты были заморожены в течение 10 мин после эвтаназии животного. Для этого удобно использовать контейнер с сухим льдом, который должен находиться рядом с животным, подвергнутым вскрытию для извлечения органов и тканей.

Также стоит обратить внимание на размер замораживаемой ткани, фрагмент должен быть тонким и небольшим (75–100 мг), чтобы ДМСО успел пропитать все клетки. P. Jackson и соавт. [18] описывают метод быстрого измельчения образца ткани на льду перед его заморозкой при -80°C с целью снижения количества криоповреждений ДНК.

Приготовление препаратов клеток

Важнейшим этапом, от которого зависит продолжительность всего исследования и его качество, является приготовление препаратов с иммобилизированными в агарозу клетками. Заранее готовят 1% раствор универсальной агарозы, с этой целью в 50 мл приготовленного фосфатно-солевого буфера (10 мМ ЭДТА) растворяют 0,5 г универсальной агарозы, нагревают в микроволновой печи до полного растворения и ставят на термостатируемую поверхность электрической плитки, нагретую до 50°C. Особое внимание следует обращать на чистоту предметных стекол. Для соблюдения этого условия стекла замачивают на 4–8 ч в 95% спирте и удаляют спирт со стекол при помощи горелки. Подготовленные предметные стекла помещают на термостатируемую поверхность, нагретую до 50°C, затем опускают в горячий 1% раствор универсальной агарозы так, чтобы агароза покрывала всю действующую поверхность стекла, захватив примерно 5 мм шероховатой части; протирают нижнюю поверхность стекла от агарозы и помещают на горизонтальную поверхность сушиться.

После этого наносят второй и третий слои агарозы, 1 и 0,5% растворы легкоплавкой агарозы для второго и третьего слоев следует приготовить заранее, чтобы агароза успела остыть до температуры 37°C.

Далее все манипуляции необходимо проводить в комнате с желтым светом, не допуская попадания ультрафиолетовых лучей на микропрепараты. Воздействие ультрафиолета оказывает повреждающее действие на молекулы ДНК клеток и может влиять на результаты анализа [4].

Размораживать образцы следует в воде, нагретой до 37°C. Как только буфер растаял, орган немедленно промывают в прохладном (4°C) фосфатно-солевом буфере, растирают в ступке на холоде с тем же буфером и быстро измельчают до образования суспензии клеток. Ждут не больше 1 мин, чтобы крупные фрагменты органа осели на дно, после чего 10–50 мкл суспензии клеток помещают в пробирку типа «эппендорф» с 250–290 мкл фосфатно-солевого буфера, при этом концентрация суспензии должна составлять примерно 4×104 клеток.

В эппендорфах смешивают 300 мкл суспензии клеток и 300 мкл 1% легкоплавкой агарозы и наносят на предметное стекло с одним слоем агарозы в объеме 70 мкл, накрывают покровным стеклом для равномерного распределения суспензии и ставят на холод до застывания геля. После затвердевания геля покровные стекла удаляют (рис. 2). Наносят третий слой 0,5% легкоплавкой агарозы, так же накрывают покровным стеклом и помещают на холод до застывания геля.

Лизис клеток

Через 10 мин покровные стекла снимают, микропрепараты помещают в тару для замачивания предметных стекол, заливают рабочим лизирующим раствором (2,5 М NaCl, 10 мМ Tris, 100 мМ Трилон Б, 1% Triton X-100, pH  10,0, 4°C) и помещают в холодильник при 4°C на 1 ч для проведения лизиса. Оптимальное время лизирования клеток составляет 1 ч, но этот процесс можно продлить до 24 ч [19]. Для предотвращения попадания света на клетки тару необходимо упаковать в фольгу.

Щелочная денатурация

По окончании лизиса стекла в течение 20 мин обрабатывают охлажденным щелочным буфером (0,3 M NaOH, 1 мМ ЭДТА, pН 13,0, 4°C) для раскручивания двойной спирали ДНК и образования щелочелабильных сайтов [19].

Электрофорез

Следующий этап проведения ДНК-комет-теста – электрофорез. Для электрофореза используют горизонтальную камеру SE-2 (170×180) (ООО «Хеликон», Россия) и источник питания PowerPac HV (BioRad, США). Для этого обработанные стекла выкладывают по всей площади камеры в один слой. Далее заливают охлажденным до 4°C щелочным электрофорезным буфером так, чтобы препараты были на 2–3 мм ниже уровня буфера.

Точное количество буфера необходимо для того чтобы уравновесить электродвижущую силу в 25 V при взятой за константу силе электрического тока 300 А. Объем буфера зависит от объема и площади электрофорезной камеры. Для облегчения регулировки необходимых параметров электрофореза в последующих экспериментах можно замерить необходимый объем буфера в электрофорезной камере. Электрофорез длится 20 мин (рис. 3).

Для предотвращения перегрева и поддержания температуры буфера 4°C при температуре окружающей среды 20–25°C необходимо сверху и снизу обложить камеру хладагентами. Отклонения в указанных температурных режимах может приводить к вариабельности получаемых результатов [20].

По окончании электрофореза микропрепараты аккуратно (не допуская сползания агарозного слоя со стекла) помещают в контейнер с 70% этанолом на 2–3 мин для дегидратации и фиксации.

Окраска микропрепаратов

Микропрепараты окрашивают раствором SYBR Green I (например, Sigma-Aldrich, США) путем нанесения и распределения по всему препарату нескольких капель красителя. Окраску производят в течение 5 мин. Перед микроскопией остатки красителя с микропрепаратов не следует убирать [21].

Визуализация и анализ ДНК-комет

Визуализируют готовые и окрашенные микропрепараты с использованием флюоресцентной микроскопии, например, в флюоресцентном режиме (набор фильтров 09) микроскопа Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Германия) с высокочувствительной камерой. Обработку комет осуществляют с помощью специализированного программного обеспечения (например, Comet-Д версия 2.0), проводят анализ результатов исследования определяя процент ДНК  в «хвосте кометы».

Данные обрабатывают на сохраненных цифровых изображениях либо в режиме реального времени в зависимости от программного обеспечения. Важно отметить, что из анализа исключаются апоптотические клетки, выявляемые на микропрепаратах в виде слабофлюоресцирующих ДНК-комет с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой» (рис. 4) [22].

Ожидаемые результаты

На рис. 5 приведены собственные результаты анализа повреждений ДНК в 3500 клеток в четырех органах – печени, почках, селезенке, костном мозге. Группе положительного контроля вводили внутрижелудочно ЭМС в дозе 200 мг/кг, контрольной группе животных – дистиллированную воду (растворитель).

Результаты исследования показали зависимость, при которой наблюдается в «хвосте кометы» до 10% ДНК у клеток без воздействия препарата и 30–50% ДНК у клеток, подвергшихся токсическому воздействию мутагена (см. рис. 5) [22].

В сравнительном исследовании свежих и замороженных образцов тканей крыс линии SD (рис. 6) показано, что замороженные ткани демонстрируют аналогичный свежим тканям дозозависимый эффект при внутрижелудочном введении ЭМС в дозе 0, 25, 50, 100 и 200 мг/кг [23].

Также есть данные, опубликованные W. Barfield, B. Burlinson [24], в которых процент «хвоста кометы» в интактных клетках варьирует от 3,2 до 14,9, а процент «хвоста» в положительном контроле колеблется от 50,4 до 64,4. При этом можно сделать вывод, что данные контрольных групп должны значимо различаться, однако могут иметь небольшой диапазон вариаций от лаборатории к лаборатории.

Ключевые рекомендации

ДНК-комет-тест имеет ряд особенностей, влияющих на результативность метода. При постановке пилотных экспериментов мы столкнулись с определенными трудностями. Для того чтобы избежать ошибок и наладить эксперимент должным образом, советуем обратить внимание на следующие аспекты:

• время заморозки и разморозки играет значительную роль для результатов анализа (препараты должны быть заморожены как можно быстрее после эвтаназии животного, а затем разморожены и зафиксированы в агарозные слои за максимально короткий промежуток времени);
• гомогенизацию органов стоит проводить быстро, в холодной ступке;
• все манипуляции с органами, начиная с гомогенизации, следует проводить в защищенном от ультрафиолета месте при желтом освещении;
• особое внимание необходимо уделять температуре буферных растворов, которая  не должна превышать 4°C;
• при застывании агарозных слоев на хладагенте важно следить за температурой стекол, нельзя давать агарозным слоям замораживаться;
• стекла должны быть чистыми и обезжиренными для предотвращения сползания агарозных слоев со стекол во время электрофореза;
• для облегчения регулировки необходимых параметров электрофореза объем буфера в электрофорезной камере рекомендуется замерить.

Заключение

ДНК-комет-тест находит применение в различных сферах (при клинических и доклинических исследованиях, в области экологии и др.) и может использоваться для изучения разнообразных воздействий (лекарственных средств, радиационного излучения, бытовой химии, промышленных химических веществ, различных заболеваний и др.) на живые клетки. От лаборатории к лаборатории метод может изменяться и модернизироваться.

Описанный метод криоконсервации тканей животных может быть применен для проведения ДНК-комет-теста в рамках исследования общетоксических свойств, что позволит значительно сократить количество животных, используемых для реализации программы доклинических исследований.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Е.А. Гайдай – сбор и анализ данных, концепция и дизайн исследования, написание и редактирование текста статьи

А.А. Дорофеева – постановка эксперимента, сбор данных литературных источников, написание текста статьи

К.Л. Крышень, Д.С. Гайдай – сбор данных литературных источников, редактирование текста статьи