Иммуноадгезивные механизмы профилактического действия фитоадаптогена на спонтанный гепатоканцерогенез

Введение

Профилактические воздействия на злокачественные новообразования могут быть направлены на регулирование адгезионных межклеточных взаимосвязей, поскольку нарушение последних является вероятным ключевым механизмом опухолевого процесса [1, 2]. Ослабление противоопухолевых иммунных реакций в значительной степени обусловлено снижением экспрессии лейкоцитарных интегринов, в том числе LFA-1 и Mac-1, обеспечивающих контактные взаимодействия эффекторов иммунитета и опухолевых клеток [3]. Вместе с тем медиаторами иммунных реакций являются цитокины, в частности повышенный уровень ИЛ6 и ИЛ10, а также слабая экспрессия молекулы адгезии ICAM-1 сопровождаются подавлением иммунных функций и наоборот [4]. Вероятно, коррекция адгезионных взаимодействий с участием сигнальной реактивности цитокинов может иметь значение для снижения опухолеобразования. 

Вместе с тем в профилактической онкологии считают корректным учитывать превентивное действие препаратов на спонтанное опухолеобразование у линейных мышей. Классической экспериментальной моделью спонтанного канцерогенеза считают линию мышей СВА с высокой частотой возникновения гепатом. У мышей самцов этой линии гепатомы наблюдаются начиная с 6-месячного возраста, а в возрасте 18–22 мес их определяют в 100% случаев [5, 6]. 

Перспективными для коррекции адгезионных взаимодействий и в качестве профилактических в отношении опухолей агентов являются нетоксичные природные средства – фитоадаптогены (женьшень, родиола розовая, элеутерококк и др.). Последние способны регулировать межклеточную адгезию, нормализуя тем самым процессы дифференцировки тканей и усиливая противоопухолевую иммунологическую реактивность организма [7]. 

Ранее в эксперименте на мышах высокораковой линии СВА было показано, что применение экстракта родиолы розовой в раннем постнатальном онтогенезе приводило к долговременному усилению взаимной адгезивности клеток ткани-мишени. При этом было отмечено снижение частоты образования спонтанных гепатом при усилении функциональной активности Т-лимфоцитов. Однако применение препарата на этапе созревания тимуса или в начальный период образования спонтанных гепатом не оказывало аналогичного эффекта [8]. 

С точки зрения сочетанных воздействий практическое применение в профилактической онкологии могут найти не монопрепараты, а фитокомплексы на их основе, что позволит решить проблему преодоления индивидуальной резистентности к отдельным адаптогенам [9]. 

Комплексный фитоадаптоген (КФА) – нетоксичная фармкомпозиция на основе компонентов экстрактов 40 растений, в том числе фитоадаптогенов (женьшеня, элеутерококка, родиолы розовой и др.). В составе КФА определены тритерпеновые сапонины, флавоноиды, эфирные соединения, аминокислоты, витамины и другие соединения. Разработаны способы его биологической и физико-химической стандартизации [10–12]. Определены антиоксидантные, антистрессорные, гормономодулирующие, антимутагенные, противоопухолевые и иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства КФА [13–16].

Цель исследования – изучение эффективности коррекции экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови, а также сывороточного уровня цитокинов ИЛ6 и ИЛ10 при профилактическом воздействии КФА для снижения уровня спонтанных гепатокарцином, увеличения продолжительности и качества жизни высокораковых мышей СВА. 

Материал и методы

В исследование были включены опытная (n=151) и контрольные – 1-я (n=90) и 2-я (n=198) группы мышей-самцов линии СВА (сублиния СВА/Lac Y). Источник получения мышей: локальная колония ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло-хина». Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе. КФА получали самки, начиная с последних сроков беременности, до отъема детенышей в возрасте 3 нед. Затем 1 нед детеныши-самцы пили воду с препаратом самостоятельно. Таким образом, опытные животные получали 10% раствор КФА с питьевой водой в течение 1-го месяца постнатального развития, включая период завершения дифференцировки нормальной ткани печени (5–15 дней постнатального онтогенеза). Мыши I контрольной группы получали в качестве питья воду. Поскольку препарат является водно-спиртовым экстрактом, мыши II контрольной группы получали 3% раствор этанола в воде (что соответствует концентрации этанола в получаемом животными препарате). Результаты определения изучаемых параметров в обеих контрольных группах не имели достоверных различий, поэтому мыши этих групп были объединены в одну контрольную (n=288) группу. Всего в исследовании использованы 439 мышей.

Животных (10–22 мышей из каждой группы) выводили из эксперимента в соответствии с этическими нормами в возрасте 4, 8, 22 мес. Определяли экспрессию СD11a и CD11b антигенов на клетках крови животных (иммунофлюоресцентным методом), сывороточный уровень цитокинов ИЛ6 и ИЛ10 (иммуноферментным методом), массу тела животных. В среднем (8 мес) и позднем (22 мес) онтогенезе оценивали частоту опухолеобразования и размеры гепатокарцином. Вместе с тем в позднем онтогенезе оценивали двигательную (поведенческую) активность животных, а также число мышей с признаками алопеции. Двигательную активность определяли в тесте «открытого поля» с помощью системы Opto-Varimex-3. Печень животных подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином-эозином. Объем опухолей (мм³) вычисляли по стандартной формуле: А•В•С•0,52, где А, В, С – максимальные размеры опухоли по длине, ширине и высоте. Среднюю продолжительность жизни и медиану выживаемости определяли по методу Каплана–Майера. 

Статистический анализ результатов осуществляли по программе Statistica 6.0, применяя дисперсионный анализ ONE–WAY ANOVA с оценкой достоверности различий по критерию Newman-Keuls. 

Результаты и обсуждение

Обобщенные эффекты профилактического воздействия КФА на модели спонтанного гепатоканцерогенеза представлены на рисунке.

У контрольных мышей-самцов СВА развитие гепатом сопровождалось снижением экспрессии CD11a и CD11b антигенов параллельно с возрастанием сывороточного уровня ИЛ6 и ИЛ10 [17]. В 22 мес низкодифференцированные трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы без признаков лимфоцитарной инфильтрации были выявлены у всех животных этой группы [18, 19]. Вместе с тем у мышей отмечено снижение массы тела, участки алопеции на шерстном покрове. На фоне спонтанного гепатоканцерогенеза также нарушалась двигательная активность животных. В результате СПЖ контрольных мышей не достигла двухлетнего возраста (22 мес), медиана выживаемости составила 21 мес [20].

Профилактическое применение КФА приводило к долговременному усилению экспрессии CD11a и CD11b антигенов и снижению сывороточного уровня ИЛ6 и ИЛ10 по сравнению с этими показателями у контрольных животных [17]. Последнее может способствовать повышению активности противоопухолевых реакций иммунитета при инфильтрации спонтанных гепатокарцином активированными лимфоцитами и деструкции опухолевой ткани. В результате у мышей СВА под воздействием КФА выявлено снижение частоты возникновения гепатокарцином (69,2%), числа опухолей (1,0±0,3) и объема опухолевой массы на 1 мышь (268±82 мм³) по сравнению с контролем (соответственно 100%; 2,7±3; p<0,001 и 1044±193 мм³; p<0,05) [19]. Гепатокарциномы мышей в той или иной степени были инфильтрированы, вероятно, активированными лимфоцитами. В опухолевой ткани также выражены деструктивные признаки [18]. Соматическое состояние мышей опытной группы в позднем онтогенезе было удовлетворительным – без признаков похудания и алопеций. Двигательная активность опытных животных была выше, чем контрольных. В итоге СПЖ мышей СВА увеличилась на 17,1% (до 25,4 мес). Медиана выживаемости увеличилась на 25,6% (до 26 мес) [20]. Однако ни одно животное контрольной группы не пережило 1000 дней (около 33 мес), в то время как при воздействии КФА указанный срок пережили 2 мыши. Самый высокий показатель выживаемости составил 1038 дней (34 мес 4 дня), что в пересчете на годы жизни человека соответствует 98 годам. При этом контрольные мыши в пересчете на людей прожили около 60 лет, опытные мыши – около 70. 

Ранее в клинических исследованиях было получено увеличение показателей выживаемости больных распространенным раком желудка при воздействии КФА в составе комплексного лечения (операция + полихимиотерапия) [21]. У пациентов контрольной группы (n=46), получавших только основное
лечение, продолжительность жизни составила 5,9±0,9 мес. Применение КФА у больных основной группы (n=33) позволило повысить период выживаемости до 14,5±2,3 мес (р=0,00001). При этом разница между медианами выживаемости для основной (13,0±2,0) и контрольной (5,0±0,7) групп значима при ошибках выборок соответственно 17,05 и 14,44%.

При обсуждении полученных результатов следует отметить, что усиление экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA и Mac-1 на поверхности иммунных эффекторов может обеспечивать восстановление рецепторного взаимодействия с их лигандами – гистонеспецифическими молекулами адгезии на опухолевых клетках (ICAM-1,2). Регуляцию последних, в свою очередь, осуществляют гистоспецифические факторы адгезии (контактины). Воздействие КФА, вероятно, может устранять дефицит гистоспецифических факторов адгезии, нормализуя процессы пролиферации и дифференцировки клеток ткани-мишени, что приводит к снижению частоты возникновения спонтанных гепатом на 31%. 

Повышение экспрессии LFA и Mac-1 также способствует накоплению лимфоцитов в патологическом очаге. При этом в клетки опухоли активно проникают факторы разрушения, в том числе протеиназы, лимфотоксины и реактивные интермедиаты кислорода, азота, водорода (ОН, О₂, Н₂О₂, NO). Также возможен несекреторный лизис опухолевых клеток при активации на них FasAPO1-антигена (рецептора, запускающего механизм апоптоза клетки). Все эти процессы могут иметь значение для восстановления иммунореактивности в отношении опухолевых клеток при новообразованиях [22, 23].

Снижение сывороточного уровня ИЛ6 и ИЛ10 способствует подавлению образования антител, экранирующих антигены опухолевых клеток, тем самым уменьшая защиту последних от разрушения иммунными эффекторами. Вместе с тем уменьшение сывороточного уровня ИЛ6 и ИЛ10, определенное параллельно с более высокой массой опытных животных в позднем онтогенезе, может негативно регулировать патогенез кахексии животных, снижая сывороточный уровень С-реактивного белка и предупреждая при этом расщепление мышечных белков [24, 25].

Также уменьшение содержания ИЛ6 сочетается с полноценным шерстным покровом животных опытной группы в результате стимуляции функциональной активности волосяных фолликулов при подавлении воспалительного процесса в кожном покрове [26].

Очевидно, иммуноадгезионные реакции имеют значение для подавления возникновения и прогрессии спонтанных гепатокарцином, а также, соответственно, повышения выживаемости и улучшения соматического состояния животных.

Сопоставляя полученные результаты по увеличению продолжительности жизни экспериментальных мышей с данными других исследователей, можно отметить их преимущество. 

Так, антибиотик рапамицин, введенный в пищу скрещенным инбредным мышам (С57Bl/6×BALB/c), начиная с возраста 270 дней, приводил к увеличению выживаемости на 14% – у самок и на 9% – у самцов, замедляя рост опухолей, процессы старения, либо то и другое у мышей, предрасположенных к развитию опухолей. Известно, что рапамицин подавляет TOR-сигнальный путь, в том числе рапамицин-киназу, и увеличивает таким образом выживаемость беспозвоночных, включая дрожжи, нематоды и дрозофилы. При этом вес животных не снижается, если применять рапамицин и в среднем, и в позднем онтогенезе. Однако это вещество имеет побочные эффекты, являясь иммуносупрессором [27, 28]. Поэтому проводить испытания с рапамицином в качестве предполагаемого геропротектора на людях невозможно.

Таким образом, КФА – нетоксичный препарат широкого спектра действия, применяемый в раннем онтогенезе, увеличивал выживаемость мышей без снижения их веса и оказывал иммуномодулирующее действие, не обладая при этом побочными эффектами. Это отличает наши результаты от таковых с рапамицином. 

В результате КФА, применяемый в раннем онтогенезе, увеличивал выживаемость мышей, сохраняя удовлетворительным соматический статус и двигательную активность животных. Очевидно, коррекция клинической симптоматики и иммунобиологических показателей у высокораковых мышей СВА определяется разносторонним характером действия КФА, а именно – его антимутагенной, антистрессорной, антиоксидантной, гормономодулирующей, противоопухолевой, иммуномодулирующей, в том числе адгезиогенной и интерфероногенной активностями, выявленными ранее [15, 29–31].

Профилактический эффект КФА в отношении опухолей может быть также обусловлен входящими в его состав соединениями фенольной природы (флавоноиды, фенологликозиды, тритерпеновые гликозиды). Учитывая, что в качестве узкобороздочных лигандов последние могут оказывать прямое или опосредованное действие на процессы репарации ДНК, проявляя антиканцерогенные эффекты, данные соединения могут быть эффективными в составе препаратов для профилактики рака [32, 33].

Заключение

Таким образом, повышение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mаc-1 на эффекторах иммунитета, а также снижение сывороточного уровня цитокинов ИЛ6 и ИЛ10 при профилактическом воздействии нетоксичного КФА может иметь значение для усиления цитолитических потенций иммунной системы в отношении опухолей. Инфильтрация спонтанных гепатокарцином лимфоцитами может способствовать усилению противоопухолевых реакций иммунитета, а также повышению продолжительности и качества жизни животных. 

Учитывая профилактическое действие КФА в жидкой форме при развитии спонтанных гепатокарцином у мышей СВА, предрасположенных к развитию спонтанных гепатокарцином, его лечебный эффект при предраковом заболевании (лейкоплакии слизистой оболочки полости рта у людей), антимутагенные и антиоксидантные свойства, дальнейшие исследования препарата, содержащего соединения фенольной природы, могут быть перспективными при создании нетоксичных лекарств-геропротекторов для эффективной профилактики и лечения новообразований, возрастных патологий, а также для увеличения продолжительности жизни человека.

Воздействие КФА в раннем онтогенезе, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени, снижало уровень спонтанных гепатокарцином на 31%, увеличивало продолжительность жизни мышей-самцов высокораковой линии СВА на 17,1% и медиану выживаемости – на 25,6% по сравнению с таковой у контрольных животных. Лучшую выживаемость мышей-самцов линии СВА, получавших КФА профилактически, сопровождала удовлетворительная двигательная активность без признаков похудания и алопеций.

Коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mаc-1 на эффекторах иммунитета и сывороточного уровня цитокинов ИЛ6 и ИЛ10 при профилактическом воздействии нетоксичного КФА может иметь значение для повышения цитолитических потенций иммунной системы в отношении опухолей.

Инфильтрация спонтанных гепатокарцином лимфоцитами может способствовать усилению противоопухолевых реакций иммунитета, а также повышению продолжительности и качества жизни животных. 

Учитывая профилактическое действие КФА в жидкой форме при развитии спонтанных гепатокарцином у высокораковых мышей СВА, его лечебный эффект при лейкоплакии слизистой оболочки полости рта у людей, антимутагенные и антиоксидантные свойства, дальнейшие исследования препарата, содержащего соединения фенольной природы (флавоноиды, тритерпеновые гликозиды и др.), могут быть перспективными при создании нетоксичных лекарств-геропротекторов для эффективной профилактики и лечения новообразований, возрастных патологий, а также для увеличения продолжительности жизни человека.