Опыт моделирования гнойно-воспалительной раны на фоне иммуносупрессии

Введение

Гнойная патология мягких тканей остается одной из самых распространенных и актуальных групп заболеваний человека. Как известно, широкий круг факторов влияет на все фазы заживления ран. 

У здоровых людей гнойно-воспалительные раны встречаются редко. Они обычно возникают у пациентов с хроническими заболеваниями или получающих иммуносупрессивную терапию, например глюкокортикоиды. В настоящее время пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями составляют около 40% больных хирургического профиля, а послеоперационные гнойные осложнения развиваются в среднем у 30% больных [1]. Такие осложнения сопровождаются снижением показателей иммунитета (количества и функций иммунокомпетентных клеток); ингибированием ангиогенеза, пролиферации фибробластов и синтеза компонентов внеклеточного матрикса [2].

В опубликованных научных статьях для проведения экспериментов предлагаются разнообразные модели гнойных ран, что ставит исследователей перед сложным выбором, так как неотъемлемой частью изучения новых направлений в лечении ран является использование адекватной модели гнойно-воспалительного процесса мягких тканей in vivo. 

Цель данной работы – получение модели гнойно-воспалительного процесса в кожных ранах крыс для последующего исследования лечебного воздействия на раневую поверхность холодной плазмы атмосферного давления, а также различных лекарственных препаратов. 

Материал и методы

Эксперимент был выполнен на 44 белых беспородных крысах-самцах массой 180–190 г  (питомник РАН «Рапполово», Россия). Условия содержания животных соответствовали стандартным условиям вивария. Температуру воздуха поддерживали на уровне 20–24°С, влажность – 45–65%, световой режим – 12 ч свет/12 ч темнота. Акклиматизацию животных осуществляли в течение 14 сут. 

Крыс содержали в индивидуальных клетках со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты на животных проводили в полном соответствии с Директивой Европейского Совета по соблюдению этических принципов в работе с лабораторными животными (The European Council Directive (86/609/EEC)) и Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза.  

Индукцию патологии (оперативное вмешательство по нанесению кожных ран) осуществляли под наркозом. В качестве наркоза и анестезирующего вещества использовали «Золетил 100» (Virbac, Франция) (30 мг/кг массы тела, внутримышечно) – диссоциативный анестетик, разрешенный к применению на территории Российской Федерации. Перед нанесением полнокожных ран у животного в области операционного поля на спине между лопатками ножницами состригали шерсть. Остатки шерсти удаляли с помощью крема для депиляции (Eveline Cosmetics, Польша), который наносили на 3 мин. Затем операционное поле последовательно обрабатывали однократно 5%-ым спиртовым раствором йода и 70º этиловым спиртом. С помощью стерильного стилета для биопсии кожи Dermo-punch диаметром 5 мм (Sterylab, Италия) крысам через оттянутую кожную складку на спине между лопатками, наносили 2 полнослойные кожные раны глубиной до поверхностной фасции мышц [3]. Вырезанный участок кожи удаляли с помощью пинцета и ножниц, затем пришивали (шовный материал лавсан 4-0) силиконовое кольцо толщиной 1 мм с диаметром внутреннего отверстия
5 мм [4, 5] или 8 мм. Наличие раны не доставляло животным дискомфорта, не влияло на их двигательную активность и аппетит.

Для иммуносупрессии использовали введение метотрексата-эбеве (раствор для инъекций 10 мг/мл, шприц – 2 мл, «Ebeve», Австрия). Метотрексат вводили по 2 схемам: однократное введение – в дозе 10 мг/кг внутримышечно (6 животных) [6] и ежедневное введение – в течение 4 сут в дозе 150 мкг/кг внутримышечно (8 животных). Для получения желаемой концентрации метотрексат разводили стерильным физиологическим раствором. В качестве 2-го варианта иммуносупрессии применяли гидрокортизон (125 мг) («Гедеон Рихтер», Венгрия)  в дозе 25 мг/кг (внутримышечно) в течение 7 сут (1-й укол – за 1 сут до нанесения раны) [2].

Для инфицирования ран, с целью получения локального воспалительного процесса использовали 2 вида бактерий S. aureus 6 и P. indica 23. Суточную культуру микроорганизмов выращивали до концентрации 10^8-9 КОЕ/мл на жидкой питательной среде сердечно-мозговой бульон (Brain Heart Infusion Broth, HiMedia, Индия). Биопленку S. aureus 6 и P. indica 23 (10^11-12 КОЕ/см²) формировали предварительно на поверхности плотной питательной среды (агар Мюллера–Хинтона, HiMedia, Индия) в течение 24 ч при температуре 37ºС. В экспериментах использовали культуры микроорганизмов из коллекции ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Раны однократно инфицировали разными способами. В область дна раны вносили суспензию бактерий 10⁹ КОЕ/мл в количестве 0,1 мл S. aureus 6 или P. indica 23 на рану. 2-й способ – внесение суспензии смешанной бактериальной культуры S. aureus 6 и P. indica 23 в концентрации 10^8-9 КОЕ/мл в количестве 0,1 мл на рану. В 3-м случае на рану наносили фрагменты плотной питательной среды со сформированной биопленкой (10^11-12 КОЕ/см²)  S. aureus 6 или P. indica 23. Для этого, вырезанные из плотной питательной среды фрагменты с биопленкой, равные по размеру диаметру раны (5 мм), помещали на дно раны. После внесения микроорганизмов раневую поверхность изолировали от внешней среды стерильной прозрачной пищевой пленкой на 2 сут. Пленка крепилась к поверхности силиконового круга благодаря своим свойствам, без постороннего клеящего средства.

Эвтаназия животных не осуществлялась.

В течение всего эксперимента раны ежедневно фотографировали. Полученные изображения переносили в компьютер, калибровали и измеряли площадь раневого поражения с помощью программы Scion Image (NIH, США). После чего рассчитывали площадь раневой поверхности на 3-и, 5-е и 7-е сутки. Результаты выражали в % от исходной площади. Количество микроорганизмов в инфицированных ранах определяли с помощью высевов. Для этого ежедневно отделяемое раны отбирали с помощью стерильного тампона и распределяли по поверхности плотной питательной среды (агар Мюллера–Хинтона). Посевы помещали в термостат и выдерживали в течение 24 ч при температуре 37ºС.  Результаты посевов, т.е. количество колониеобразующих единиц, подсчитывали и выражали в КОЕ/см².

Каждое животное взвешивали до начала эксперимента и в последующие дни.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы Statistics 19.

Результаты и обсуждение

Заживление раны начиналось с пролиферативной стадии и выражалось в появлении краевой эпителизации, приводящей к уменьшению площади раны путем сокращения и фиброплазии (образование соединительной ткани). Динамику течения воспалительного процесса в эксперименте оценивали по появлению краевой эпителизации.

Фиксация краев раны с помощью силиконового кольца позволяла предупредить преждевременное стягивание краев раны, что давало возможность «стандартизировать» площадь раны, независимо от индивидуальных особенностей процесса заживления у экспериментального животного, а также оценить воздействие изучаемого препарата. Поскольку диаметр внутреннего отверстия силиконового кольца (5 мм) совпадал с диаметром наносимой раны [4], то возникала трудность с оценкой появления краевой эпителизации при заживлении раны (рис. 1). В связи с этим было решено применять силиконовое кольцо с диаметром внутреннего отверстия 8 мм, что на 3 мм больше диаметра самой раны, что позволило с легкостью осуществлять визуальную оценку появления краевой эпителизации
(рис. 2). 

Введение метотрексата однократно в дозе 10 мг/кг привело к гибели 2 из 6 животных (~30%) на 3-й день от начала эксперимента. Введение препарата  в дозе
0,15 мг/кг в течение 4 сут вызвало на 3-и сутки гибель 6 из 8 (75%) животных. Животные теряли примерно 20–30% массы тела. У выживших животных отмечалось воспаление слизистой оболочки глаз (слизистое или гнойное отделение из глаз), жидкий стул, снижение двигательной активности, потеря аппетита. 

Метотрексат – антиметаболит группы структурных аналогов фолиевой кислоты. Препарат оказывает противоопухолевое, цитостатическое и иммунодепрессивное действия. Подавляет синтез и репарацию ДНК, клеточный митоз, в меньшей степени влияет на синтез РНК и белка. Наиболее чувствительны к препарату активно делящиеся клетки [7]. Согласно полученным результатам, использовать этот препарат нерационально.  

Гидрокортизон входит в группу глюкокортикостероидов (ГКС), которые, как известно, предотвращают активацию фосфолипазы A2, стимулируя образование ее ингибитора – липокортина, нарушают синтез простагландинов и выделение макрофагального хемотаксического фактора, ингибируют активацию тканевых кининов, уменьшают миграцию макрофагов и лимфоцитов в очаг воспаления. Преимущество гидрокортизона в моделировании гнойно-воспалительного процесса обусловлено тем, что ГКС подавляют различные стадии иммуногенеза, но не оказывают митостатического действия [8]. Воздействуя на функции клеток, которые играют важную роль при заживлении ран, ГКС вызывают значительное замедление процесса репарации тканей. Известно, что у пациентов, принимающих ГКС или получающих другую иммуносупрессивную терапию, наблюдается значительное замедление заживления кожных ран [2].

В экспериментах с гидрокортизоном животные были разделены на 5 групп по 6 крыс в каждой в зависимости от способа инфицирования раны (см. таблицу).

Результаты исследования показали, что на всем протяжении эксперимента значения степени заживления у крыс I и II группы, практически не отличались, и на 5-е сутки эксперимента площадь раневой поверхности составила около 75%, на 7-е сутки – 55% от площади нанесенной раны (рис. 3). В этих группах не формировался гнойно-воспалительный процесс (рис. 4), и на 3-и сутки роста микроорганизмов не обнаружено. 

У животных III группы при использовании микробной суспензии в жидкой питательной среде, содержащей клетки S. aureus 6 и P. indica 23 в концентрации 10⁸ КОЕ/мл в количестве 0,1 мл, на 2-е сутки от начала эксперимента получили гнойную кожную рану с заданной бактериальной обсемененностью, которая по своим характеристикам была максимально приближена к реальному клиническому течению раневого процесса (рис. 5). На 3-и сутки микробная обсемененность раны составила 10⁶  КОЕ/см², к 5-м суткам уровень обсемененности еще оставался высоким 10⁵  КОЕ/см², а к 7-м суткам обсемененность снижалась до 10² КОЕ/см². Площадь раневой поверхности на 5-е сутки составляла 90%, а к 7-м суткам достигала 75% от площади исходной нанесенной раны (см. рис. 3). 

В группах IV и V инфицирование осуществляли при помещении на рану кусочка плотной питательной среды со сформированной биопленкой S. aureus 6 или P. indica 23 в концентрации 10^11-12 КОЕ/мл. На сегодняшний день принято считать, что биопленка микроорганизмов – хорошо сформированное сообщество физиологически активных клеток, погруженных в биополимерный матрикс, обладающий повышенной устойчивостью к факторам окружающей среды.  Развитие любого инфекционного процесса бактериальной природы связано с развитием биопленки [9]. Помещение хорошо сформированной биопленки на раневую поверхность может привести к развитию острого воспалительного процесса в ране. Однако результаты исследования показали, что на протяжении эксперимента показатели заживления у крыс были высокими. Так, на 5-е сутки эксперимента площадь раневой поверхности составила около 50%, на 7-е сутки – меньше 20% от площади нанесенной раны (см. рис. 3). В этих группах не отмечалось гнойно-воспалительного процесса, и на 3-и сутки обсемененность ран отсутствовала.

Одной из более вероятных гипотез, объясняющих это явление, является наличие агаризованной питательной среды в ране. Возможно, агар-агар проявляет сорбционные свойства и нейтрализует выделяемые микроорганизмами факторы патогенности в ране, тем самым улучшая показатели заживления. По результатам исследования на 7-е сутки инфицированные биопленками на агаре раны заживали лучше, чем при других условиях. 

Заключение

В результате проведенных исследований была выбрана оптимальная модель получения гнойной раны на фоне иммуносупрессии. Использование гидрокортизона (25 мг/кг в течение 7 сут), в отличие от метотрексата, не приводило к летальности животных, а однократное введение суспензии смешанной культуры S. aureus 6 и P. indica 23 вызывало развитие гнойно-воспалительного процесса в течение 48 ч. Увеличение диаметра внутреннего отверстия силиконового фиксатора краев раны позволило более точно проводить планиметрическую оценку ран и визуально наблюдать за скоростью краевой эпителизации. 

Работа выполнена при поддержке гранта Санкт-Петербургского государственного университета № 037.218.2016