Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов кроликов и их абсолютным значениям

Е.А. Рощина, научный сотрудник отдела специфической токсикологии и фармакодинамики, ORCID: 0000-0002-9257-4241

АО НПО «Дом Фармации»,188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Е-mail: [email protected]


DOI: 10.29296/2618723X-2022-01-05
Ключевые слова: доклинические исследования непараметрическое определение референсных интервалов белый великан масса органов

Для цитирования:

Рощина Е.А. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов кроликов и их абсолютным значениям. Лабораторные животные для научных исследований. 2022; 1. https://doi.org/10.29296/2618723X-2022-01-05

Резюме

Оценка массы органов в токсикологических исследованиях является неотъемлемой частью изучения фармацевтических препаратов, химических веществ и медицинских устройств. Референсные интервалы в научных статьях часто основываются на данных 10-летней давности или результатах, собранных из нескольких центров, с возможной вариабельностью в измерениях. Поэтому доклиническим центрам для корректной интерпретации данных следует устанавливать внутренние референсные интервалы по массовым коэффициентам и абсолютным значениям внутренних органов экспериментальных животных.

В настоящей статье определены референсные интервалы для массовых коэффициентов органов кроликов породы белый великан, а также их абсолютных значений. Данные по массе органов кроликов получены на основании токсикологических исследований, проведенных в НПО «Дом Фармации» за период 2018–2021 гг. Возраст животных на момент некропсии составлял 16–22 нед. Исследования были выполнены с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики.

На основании рекомендаций Общества токсикологической патологии (STP) у экспериментальных кроликов регистрировали массу следующих органов: печень, сердце, почки, мозг, селезенка, тимус, семенники/яичники, надпочечники. Дополнительно анализировали массу легких. При потере массы тела животными на фоне тестируемого объекта возможно увеличение массовых коэффициентов органов. Поэтому анализ данных по массе органов относительно массы головного мозга может исключить ложное влияние объекта на органы, поскольку масса мозга не изменяется с увеличением или снижением массы тела. Также для исключения подобных ошибок можно выполнять анализ абсолютных значений массы органов.

Данные разделены по диапазонам массы тела кроликов, поэтому в каждой выборке представлено <200 значений, что не позволяет использовать параметрический метод определения референсных интервалов. Таким образом, расчет выполняли непараметрическим методом.

По соотношению выбросов (массовых коэффициентов относительно массы тела животных и массы головного мозга и абсолютных значений массы органов) у самцов кроликов различий не выявлено, но у самок наименьшее количество выбросов установлено при расчете массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных. Поэтому в зависимости от влияния исследуемых объектов на массу тела животных можно использовать разные методы расчета массовых коэффициентов или абсолютные значения массы органов.

Введение

В доклинических исследованиях изменения массы органов могут быть связаны с эффектами, вызванными тестируемыми объектами. Поэтому выбор соответствующих органов для регистрации массы в токсикологических исследованиях включает:

  • понимание механизма действия, метаболизма и токсикокинетики исследуемого объекта;
  • физиологию подопытных животных;
  • совокупный набор данных из предыдущих исследований тех же или подобных соединений (объектов исследования).

Общество токсикологической патологии (STP) рекомендует регистрировать массу печени, сердца, почек, головного мозга, селезенки, тимуса, семенников/яичников и надпочечников у всех видов животных, задействованных в токсикологических исследованиях [1].

Например, изменение массы печени может указывать на влияние тестируемого объекта, вызывая гепатоцеллюлярную гипертрофию (например, индукцию ферментов или пролиферацию пероксисом). Масса печени может быть увеличена в исследованиях продолжительностью <7 дней в случае сильнодействующих соединений, индуцирующих печеночные ферменты. Повышенная масса сердца может быть единственным свидетельством гипертрофии миокарда, которое часто трудно распознать макроскопически и микроскопически. Изменения массы почек могут отражать различную патологию почек. Вариации массы надпочечников могут указывать на гипертрофию, гиперплазию или атрофию, связанную со стрессом или эндокринопатией [2].

Изменения массы головного мозга редко связаны с нейротоксичностью. Практическое использование этого показателя заключается в возможности вычислять соотношение массы органа к массе головного мозга.  Данное  соотношение полезно,  когда  тестируемый  объект  влияет  на  конечную  массу  тела.  STP  рекомендует  регистрировать  массу головного  мозга,  чтобы  при  необходимости  можно  было  рассчитать  массу  органа  относительно  головного  мозга [1].

Цель настоящей работы – определение референсных интервалов массовых коэффициентов органов, рассчитанные относительно массы тела и головного мозга, и абсолютных значений массы органов кроликов породы белый великан.

Кроликов нечасто используют в качестве модельных объектов, поэтому источников литературы, включающих информацию о массе органов, недостаточно. Преимущества данной тест-системы следующие:

  • этический и экономический аспекты вопроса проведения исследований хронической токсичности – кролики являются предпочтительным видом животных, так как относятся к «не грызунам» [3];
  • в рамках хронической токсичности данная тест-система позволяет проводить токсикокинетические исследования [4];
  • тестируемые объекты в виде капсул и таблеток можно вводить без разрушения лекарственной формы.

Материал и методы

Для расчета референсных интервалов были использованы данные, полученные от контрольных / интактных групп токсикологических экспериментов в период с 2018 по 2021 г. Все исследования были проведены в соответствии принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) [5], и Правилами надлежащей лабораторной практики.

Во всех экспериментах модельным объектом были кролики породы белый великан в возрасте 16–22 нед (242 самца и 253 самки), поставленные из крестьянско-фермерского хозяйства (КФХ) «Нера». Были использованы небеременные и нерожавшие самки.

Животных содержали в стандартных условиях:

  • температура 15–22°C;
  • относительная влажность воздуха 45–65%;
  • 12-часовой световой день;
  • группами (боксы с решетчатым полом без подстила) или индивидуально (клетки с подстилом);
  • площадь пола клетки содержания на 1 животное соответствовала регламентирующим стандартам [6].

Всех животных подвергали эвтаназии путем передозировки смеси ветеринарных препаратов Золетил 100 (Virbac Sante Animale, Франция) + Ксилазин 2% (Interchemie werken «De Adelaar» B.V, Нидерланды) и Пропофол-Каби 20 мг/мл (Фрезениус Каби Дойчланд ГмбХ, Германия), затем удаляли жизненно важные органы (легкие, сердце, головной мозг). В течение эксперимента доступ к корму и воде не был ограничен, за исключением 4 ч до эвтаназии. Массу тела определяли непосредственно перед некропсией.

Полученные  данные  были  разделены  на  2  группы  в  зависимости  от  массы  тела  животных (самцы – 2310–3770 и 3775–5586 г,  самки – 2310–3810 и 3815–5650 г).

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica 10 (StatSoft, США). Статистические выбросы оценивали при помощи метода Тьюки. Референсные интервалы были определены непараметрическим методом.

Результаты и обсуждение

Из массива данных были исключены статистические выбросы. Их определяли отдельно по каждому значению органа в группах с учетом диапазона массы. Исключали данные, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5.IQR) – (Q3+1,5.IQR), где Q1 и Q3 – границы 1-го и 3-го квартилей, а IQR – межквартильный интервал (Q3–Q1) [7] (табл. 1, 2).

Таблица 1. Доля статистических выбросов при расчете массовых коэффициентов органов самцов кроликов относительно массы тела

Таблица 2. Доля статистических выбросов при расчете массовых коэффициентов органов самок кроликов относительно массы тела

Таблица 3. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов самцов кроликов, рассчитанные как отношение массы органа к массе тела

Референсные интервалы для полученных результатов были определены в промежутке 2,5–97,5 процентиля, представленные в табл. 3 и 4 [8].

Таблица 4. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов самок кроликов, рассчитанные как отношение массы органа к массе тела

Представленные значения массовых коэффициентов органов у самцов и самок кроликов в большинстве случаев незначительно уменьшаются с увеличением массы тела животных за счет роста мышечной и жировой тканей.

Ввиду возможного влияния тестируемых объектов на массу тела животных (в сторону снижения) при анализе полученных данных массовые коэффициенты органов, рассчитанные относительно массы тела, увеличиваются. В таких случаях можно выполнить анализ данных по массе органов относительно массы головного мозга, поскольку масса мозга не изменяется с увеличением или снижением массы тела. Также для исключения подобных ошибок можно выполнить анализ абсолютных значений массы органов.

Статистические выбросы, определенные методом Тьюки, при расчете массовых коэффициентов органов самцов и самок кроликов относительно головного мозга и представлении абсолютных значений были исключены из массива данных. Общее  количество  выбросов  представлено  в  табл.  5–8.

Таблица 5. Доля статистических выбросов при расчете массовых коэффициентов органов самцов кроликов относительно головного мозга

Таблица 6. Доля статистических выбросов при расчете массовых коэффициентов органов самок кроликов относительно головного мозга

Таблица 7. Доля статистических выбросов при анализе абсолютной массы органов самцов кроликов

Таблица 8. Доля статистических выбросов при анализе абсолютной массы органов самок кроликов

Соотношение выбросов, полученных при анализе массовых коэффициентов органов (относительно массы тела животных и массы головного мозга) и абсолютных значений масс органов, у самцов кроликов не различалось. У самок кроликов меньшее количество выбросов выявлено при расчете массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных.

В табл. 9–12 представлены референсные интервалы по массовым коэффициентам органов, рассчитанных как отношение массы органа к массе головного мозга, и абсолютной массы каждого органа.

Таблица 9. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов самцов кроликов, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга

Таблица 10. Референсные интервалы по массовым коэффициентам органов самок кроликов, рассчитанные как отношение массы органа к массе головного мозга

Таблица 11. Референсные интервалы по абсолютным массам органов самцов кроликов

Таблица 12. Референсные интервалы по абсолютным массам органов самок кроликов

При поиске источников литературы были найдены значения только по абсолютным массам органов самцов кроликов, средняя масса тела животных составляла 2240 г [9]. Поэтому для сравнения данных, полученных на основании токсикологических исследований в НПО «Дом Фармации» и приведенных в табл. 13, использовали значения по абсолютной массе каждого из органов, соответствующие диапазону массы тела самцов кроликов 2310–3770 г.

Таблица 13. Референсные интервалы по абсолютной массе (г) каждого из органов самцов кроликов

При сравнении референсных интервалов, полученных в нашей работе и согласно Brown, Pearce, Van Allen (1925), установлено, что данные сопоставимы.

Заключение

Определение референсных интервалов по массовым коэффициентам органов относительно массы тела и головного мозга, а также абсолютных значений массы органов позволяет доклиническим центрам создавать собственные внутрилабораторные нормы, на основании которых можно выявить влияние (или его отсутствие) тестируемого объекта на органы животных.

В соответствии с полученными данными можно сделать вывод, что при исследовании токсичности следует основываться на значения массовых коэффициентов органов относительно массы тела животных. Однако при установлении влияния исследуемых объектов на массу тела животных можно использовать абсолютные значения массы органов или массовые коэффициенты органов относительно массы головного мозга.

При сравнении полученных показателей по абсолютным значениям массы органов самцов с данными литературы [9] можно заключить, что референсные интервалы сопоставимы, что подтверждает корректность проведенного исследования.

Необходимо учитывать, что изменение массы органов должны оцениваться в контексте класса соединения, механизма действия и всего набора данных для конкретного исследования.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Сведения о конфликте интересов

Автор  заявляет об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной 
статье. 

Список литературы

  1. Sellers R.S., Mortan D., Michael B., et al. Society of Toxicologic Pathology Position Paper: Organ Weight Recommendations for Toxicology Studies // Toxicologic Pathology. – 2007; 35(5): 751-755. DOI: 10.1080/01926230701595300.
  2. Greaves P. Histopathology of Preclinical Toxicity Studies: Interpretation and Relevance in Drug Safety Studies (Fourth Edition). – Academic Press, 2012. – 886 p. DOI: 10.1016/C2010-0-67226-9
  3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Миронов А. Н. ‒ М.: Гриф и К, 2012. ‒ 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstvennykh sredstv. Chast' pervaya. / Mironov A. N. ‒ M.: Grif i K, 2012. ‒ 944 s. (In Russ.)]
  4. Decision of board of the Eurasian economic commission of November 26, 2019 No. 202 «About approval of the Management on preclinical trials of safety for the purpose of conduct of clinical trials and registration of medicines»
  5. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes, Strasbourg, 1986.
  6. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Восьмое издание / пер. с англ. Под ред. И.В. Белозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Красильщиковой. – М.: ИРБИС, 2017. – 336 с.[Rukovodstvo po soderzhaniyu I ispolsovaniyu laboratornykh zhivotnykh. Vos’moe izdanie / per. C angl. Pod red. I.V. Belozercevoi, D.V. Blinova, M.S. Krasil’shikovoi. – M.: IRBIS, 2017. – 336 s. (In Russ.)]
  7. Луговик И.А., Макарова М.Н. Токсикологические исследования. Референтные интервалы массовых коэффициентов внутренних органов на выборке в 1000 аутбредных крыс // Лабораторные животные для научных исследований. – 2021; 1: 3-11. [Lugovic I.A., Makarova M.N. Toksicologicheskie issledovaniya. Referentnye intervaly massovykh koefficientov vnutrennykh organov na vyborke v 1000 autbrednykh krys // Laboratory animals for scientific research. – 2021; 1: 3-11.(In Russ.)] DOI: 10.29296/2618723X-2021-01-01.
  8. Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов // Лабораторная служба. – 2019; 8(2): 36-44. DOI 10.17116/labs2019802136 [Evgina S.A., Savel’ev L.I. Sovremennye teoriya i praktika referentnykh intervalov //Laboratornaya sluzhba. – 2019; 8(2): 36-44. (In Russ.)]
  9. Brown W.H., Pearce L., Van Allen C.M. Organ weights of normal rabbits // Journal of experimental medicine. – 1925; 42(1): 69–82.

Вас может заинтересовать