Выбор оптимального дизайна эксперимента на примере модели ЛПС-индуцированного острого респираторного дистресс-синдрома у крыс

Гайдай Дмитрий Сергеевич 
АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия
[email protected]

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — тип дыхательной недостаточности, характеризующийся быстрым началом распространенного воспалительного процесса в легких. Симптомы включают одышку, учащенное дыхание и синеватую окраску кожи. ОРДС в основном возникает в первые 12-48 часов от начала основного заболевания. ОРДС - основная причина смерти при новой коронавирусной инфекции, возникающий в 3–17% случаев, что делает поиск новых лекарственных средств для его лечения особенно актуальным.
Целью научно-исследовательской работы являлась разработка экспериментальной модели ОРДС у крыс, соответствующей ряду критериев 1) наличие характерных макроскопических изменений ткани легких 2) наличие системного и местного воспалительного ответа.
Для индкуции патологии крысам самцам линии Wistar эндотрахеально вводили хорошо известный индуктор острого воспалительного процесса липополисахарид (ЛПС), выделенный из E.сoli серотипа O111:B4 (Sigma-Aldrich, США), в дозах 10 и 15 мг/кг. Животных эвтаназировали через 4, 8, 24, 48 и 72 часа (n = 5 на каждой временной точке), проводили макроскопический анализ легких, осуществляли отбор бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и отбирали кровь из сердца. В образцах БАЛ с помощью гематологического анализатора оценивали общее количество лейкоцитов, методом микроскопии в мазках анализировали лейкоформулу. В супернатантах БАЛ и сыворотке крови методом иммуноферментного анализа измеряли уровень цитокинов TNFα и IL-6 как основных медиаторов цитокинового шторма характерного для ОРДС.
Максимально выраженные макроскопические изменения легких (гиперемия, отек) наблюдали через 48 и 72 часа после введения ЛПС как в дозе 10, так и 15 мг/кг.
По результатам измерения концентрации лейкоцитов установлен максимум их накопления через 24 ч после индукции патологии ЛПС в обеих дозах и с сохранением через 48 статистической значимости (относительно интактных животных) только для дозы 15 мг/кг. До 80-90% клеток в лаваже на сроках 24-48 часов составляли нейтрофилы, что соответствует этапу острого воспаления. Через 72 ч после введения ЛПС наблюдали начало развития стадии разрешения воспаления по изменению процентного соотношения лейкоцитов в сторону увеличения макрофагов.
По результатам ИФА установлено, что вне зависимости от дозы ЛПС концентрация TNFα в сыворотке крови и БАЛ достигает своего максимума через 4-6 ч после индукции патологии с последующим резким снижением его уровня практически до фоновых значений.  Схожую динамику в сыворотке крови животных наблюдали и для IL-6. В то же время в бронхоальвеолярном лаваже концентрация IL-6 сохранялась на достаточно высоком уровне (достоверно выше, чем у интактных животных) вплоть до 48 часов после введения ЛПС в дозе 15 мг/кг.
Таким образом, полученные результаты позволили выбрать оптимальный дизайн эксперимента. Для моделирования патологии наиболее корректно использовать  эндотрахеальное введение ЛПС в дозе 15 мг/кг. Измерение концентрации TNFα целесообразно осуществлять в сыворотке крови через 4 часа после индукции патологии.  Изменения в легких (в том числе микроскопические), подсчет количества лейкоцитов, расчет процентного содержания нейтрофилов/ макрофагов и измерение содержания IL-6 следует изучать в образцах БАЛ через 48 часов, поскольку это крайняя временная точка, в которой наблюдаются достоверные отличия у животных с патологией относительно фона.