ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ИЗМЕНЕНИЙ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАМЕТРОВ В ТКАНЯХ DANIO RERIO С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ БИОСЕНСОРОВ

Панова Анастасия Сергеевна1,2
Сергеева А.Д.1,3, Кельмансон И. В.1,2, Иванова А.Д. 1,3, Васильев А.В.1, Таувин М.4, Фриз С. 4, Белоусов В.В. 1,2,5, Билан Д.С. 1,2
1 – Институт биоорганической химии. им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва; 2 - Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва; 3 –  Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва; 4 - Collège de France, Париж; 5 – Федеральный центр мозга и нейротехнологий, Москва.
panova_a@ymail.com; d.s.bilan@gmail.com

Рыба Danio rerio является популярным в мире модельным организмом в медико-биологических исследованиях, так как обладает рядом привлекательных характеристик по сравнению с другими позвоночными животными. Одной из таких характеристик является прозрачность тканей на ранних этапах развития, что дает возможность использовать различные флуоресцентные инструменты. К таким инструментам среди прочих относятся флуоресцентные генетически кодируемые биосенсоры – специальным образом сконструированные белковые молекулы, позволяющие регистрировать в режиме реального времени динамику различных внутриклеточных метаболитов. 
В нашей лаборатории оборудованы помещения для содержания и работы с рыбами D. rerio. Мы проводим всестороннюю работу с данным организмом, в том числе получаем трансгенные линии, осуществляем флуоресцентную микроскопию, моделируем различные патологические состояния. Для содержания D. rerio разных возрастов собраны установки, обеспечивающие поддержание необходимых для рыб условий.  
Мы исследуем динамику ряда внутриклеточных параметров в тканях D. rerio при воспалении, а также в условиях гипоксии/реоксигенации. В частности, в своей работе мы успешно использовали ряд биосенсоров: индикаторы семейства HyPer (для регистрации пероксида водорода), SypHer3s (для регистрации динамики внутриклеточного рН), SoNar (для определения редокс-статуса НАД), а также недавно созданный в нашей лаборатории биосенсор Hypocrates, позволяющий визуализировать гипогалогенный стресс. Для обеспечения экспрессии генетически кодируемых сенсоров в тканях D. rerio мы используем два подхода: для временной экспрессии сенсора проводим микроинъекцию соответствующей мРНК в оплодотворенную икринку, а для постоянной экспрессии получаем трансгенные линии с помощью системы на основе Tol2 транспозона. Регистрацию сигнала сенсоров осуществляем с применением флуоресцентной микроскопии на анестезированных и иммобилизованных в агарозе мальках в режиме реального времени.
Для моделирования воспалительных процессов мы применяем общепринятую во всем мире модель ампутации кончика хвостового плавника. В данной модели мы впервые одновременно визуализировали динамику двух ключевых воспалительных редокс-параметров in vivo, а именно: гипогалогенный стресс и продукцию пероксида водорода. Для создания условий гипоксии/реоксигенации нами была разработана установка, позволяющая за счет проточной системы быстро изменять концентрацию кислорода в среде с рыбой параллельно со съемкой на микроскопе. С помощью данной модели мы зарегистрировали динамику соотношения НАД+/НАДН и рН в сердечной мышце мальков D. rerio разных возрастов. 
При поддержке гранта РФФИ 21-34-70031
 

Для цитирования

Панова А.C., Сергеева А.Д., Кельмансон И.В., Иванова А.Д., Васильев А.В., Таувин М., Фриз С., Белоусов В.В., Билан Д.С. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ИЗМЕНЕНИЙ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАМЕТРОВ В ТКАНЯХ DANIO RERIO С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ БИОСЕНСОРОВ. Тезисы Девятой конференции специалистов по лабораторным животным Rus-LASA. https://doi.org/10.29296/2618723X-RusLASA2021-05

Вас может заинтересовать