Регистрация внутриклеточных параметров в режиме реального времени в модели ишемии/реперфузии in vitro и in vivo

Котова Дарья Андреевна1,2
Кельмансон И.В.1,2
Почечуев М.С.3 
Иванова А.Д.1,3
Ланин А.А.3
Федотов А.Б.3
Федотов И.В.3
Желтиков А.М.3
Белоусов В.В.1,2,4
Билан Д.С.1,2
1.  Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва;
2.  Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва;
3.  Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва;
4.  Федеральный центр мозга и нейротехнологий, Федеральное медико-биологическое агентство, Москва
d.s.bilan@gmail.com

Ишемический инсульт является одной из главных причин инвалидности и смертности в настоящее время. Сосудистая окклюзия, возникающая при инсульте, ограничивает доставку кислорода и метаболических субстратов к нейронам, что приводит к изменению метаболизма клеток. Исследование молекулярных процессов, лежащих в основе этих изменений, возможно при помощи флуоресцентных биосенсоров, уникальность которых заключается в визуализации внутриклеточных биохимических параметров в режиме реального времени. 

Цель: Cравнение динамики изменения внутриклеточных параметров в модели ишемии/реперфузии in vitro и in vivo в режиме реального времени с использованием биосенсоров SypHer3s и HyPer7.

Методы: C помощью биосенсоров SypHer3s и HyPer7 регистрировали динамику изменения величины рН и концентрации пероксида водорода в цитоплазме и матриксе митохондрий в модели ишемии/реперфузии in vitro, в первичной культуре гиппокампальных нейронов мыши, и in vivo, в модели временной окклюзии среднемозговой артерии крысы. Регистрацию исследуемых параметров осуществляли при помощи флуоресцентной микроскопии (in vitro модель) и имплантированных в головной мозг крысы оптических волокон (in vivo модель).

Результаты: В экспериментах на первичной гиппокампальной культуре было обнаружено, что в условиях гипоксии рН цитоплазмы и митохондрий нейронов значительно снижается, а при реоксигенации возвращается к исходному уровню. Использование высокочувствительного к перекиси водорода биосенсора HyPer7 показало незначительное снижение концентрации H2O2 при гипоксии как в матриксе митохондрий, так в цитоплазме клеток, реоксигенация приводила к возвращению уровня H2O2 к исходным значениям. В экспериментах in vivo было зафиксировано резкое и значительное снижение рН в цитоплазме нейронов поврежденного полушария, которое сохранялось и во время реперфузии. Уровень H2O2 в матриксе митохондрий ишемизированных нейронов слегка возрастал во время окклюзии, однако значительно более существенное увеличение концентрации H2O2 наблюдалось только на следующие сутки.

Выводы: Динамика окислительно-восстановительных процессов в нейронах в условиях гипоксии/реоксигенации сильно различается в культуре клеток и в экспериментах на животных. Основной рост концентрации H2O2 в нейронах происходит не в момент ишемии/реперфузии, а значительно позднее. Разработанная нами модель позволяет визуализировать различные биохимические процессы, происходящие в мозге модельных животных в норме и патологии.

При поддержке грантов РНФ 17-15-01175.
 

Для цитирования

Котова Д.A., Кельмансон И.В., Почечуев М.С., Иванова А.Д., Ланин А.А., Федотов А.Б., Федотов И.В., Желтиков А.М., Белоусов В.В., Билан Д.С. Регистрация внутриклеточных параметров в режиме реального времени в модели ишемии/реперфузии in vitro и in vivo . Тезисы Девятой конференции специалистов по лабораторным животным Rus-LASA. https://doi.org/10.29296/2618723X-RusLASA2021-03

Вас может заинтересовать