Механизм регенерации тканей грудной конечности на примере иглистого тритона

Введение

Травмы и переломы конечностей встречаются довольно часто как у человека, так и у животных, при этом процесс пострепаративной регенерации тканей зависит от многих факторов в том числе от видовых и от индивидуальных особенностей организма. В частности, у крупных животных, таких как лошади или коровы, этот процесс протекает тяжелее, а исход болезни часто неблагоприятный. Так, при переломе костей конечностей эти животные, как правило, подлежат убою вследствие неэффективности проводимого лечения. В случае полной утраты конечности восстановление становится невозможным из-за недостаточной регенераторной лабильности костно-мышечного аппарата. Однако в животном мире имеются исключения, например, у иглистых тритонов после полной утраты грудных или тазовых конечностей наблюдается их полная морфологическая регенерация с восстановлением функциональной активности [1]. Механизм этого процесса полностью не изучен.

Известно, что в организме постоянно идут два противоположных процесса – физиологическая регенерация и резорбция, при этом в губчатом веществе костной ткани эти процессы более интенсивны, чем в компактном. Костная ткань чутко улавливает малейшие изменения физической нагрузки, в ответ на которые возникает перестройка (ремодуляция), это придает костной ткани большую износоустойчивость [2].

Регенерация костной ткани может осуществляться путем прямого и непрямого гистогенеза костной ткани. Прямой остеогистогенез осуществляется непосредственной трансформацией мезенхимы, при этом образуется грубоволокнистая костная ткань, которая впоследствии замещается пластинчатой костной тканью. В прямом остеогистогенезе различают 4 стадии: обособление остеогенного островка, остеоидная стадия, минерализация межклеточного вещества, перестройка и рост кости. Непрямой остеогистогенез происходит на месте хряща, при этом сразу образуется пластинчатая костная ткань. В этом случае также можно выделить 4 этапа: образование хрящевой модели будущей кости, в области диафиза возникает перихондральное окостенение, эндохондральное окостенение, перестройка и рост кости [2].

Поскольку полное восстановление конечности после ее удаления описано только у тритонов [1], представляется актуальным изучение механизма регенерации удаленной конечности на основе микроструктурного анализа тканей регенерата.

Цель работы – изучить возможность использования иглистого тритона для проведения доклинических исследований по изучению регенерации тканей на примере резекции грудной конечности.

Материал и методы

Исследования проводили на базе гистологической лаборатории кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета в 2021 г.

Объектом исследования служили самки иглистого тритона, приобретенные в зоомагазине (Красноярск, Россия). Для проведения исследования взяты 9 особей в возрасте 11 мес. Средняя масса самки тритона составляла 5,49±0,18 г. Тритоны содержались в трех оборудованных аквариумах объемом 15 л, группами по 3 особи в каждой. На дно аквариума помещались камни, которые были необходимы как вспомогательные средства в период линьки, высаживались живые растения Криптокорина ундулата (Cryptocoryne undulata), или волнистая. Воду непрерывно фильтровали, поддерживая температуру 20–25°С. Уровень воды составлял 20–25 см, так как тритоны дышат кислородом, им необходимо периодически всплывать на поверхность.  Кормление тритонов проводили 1 раз в 3 дня сырой куриной печенью. Содержание и кормление осуществляли в соответствии с рекомендациями [3].

Исследования проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986).

Материалом для исследования послужила регенерирующая культя грудной конечности на 62-е сутки после тотальной ампутации. Ампутацию производили после введения животного в состояние анабиоза путем постепенной гипотермии, которую осуществляли, понижая температуру с 23  до 0°С, используя кусочки льда. Далее животных выводили из состояния анабиоза путем повышения температуры воды с 0°С до комнатной температуры и возвращали обратно в аквариум для наблюдения (оценка процесса регенерации).  

Культю погружали в 9% раствор забуференного нейтрального формалина (ХимТТ Екатеринбург, Россия) на 3 сут. Затем переносили в 5% водный раствор азотной кислоты (ПК Химпром, Россия) на 5 сут с ежедневной сменой раствора. Далее следовала промывка в проточной воде, проводка через батарею изопропиловых спиртов возрастающей концентрации, погружение в вазелиновое масло, пропитывание в 4 порциях парафина и заливка в блоки [4]. Изготовленные на микротоме срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона [5]. Для гистохимических исследований препараты окрашивали по методу Маллори и альциановым синим по Шиффу. Срезы просматривали под бинокулярными микроскопом Микомед-5 (ЛОМО, Россия) и проводили микрофотосъемку фотокамерой Canon PC 1201 (Canon, Китай).

Результаты и обсуждение

После ампутации грудной конечности тритона к 62-м суткам образовалась регенераторная культя, которая включала морфологически сформированный костно-мышечный аппарат, состоящий из плечевой кости, локтевого сустава, костей предплечья, запястья, пясти и пальцев. Различные способы окраски позволили установить степень дифференцировки тканевых структур и функциональную активность регенерирующей конечности.

На продольных срезах формирующейся культи хорошо просматривались тканевые структуры, отражающие степень регенерации в направлении от проксимальных к дистальным участкам отрастающей конечности. К 62-м суткам вся исследуемая конечность покрывалась тонким слоем кожи, состоящим из 3–6-слойного эпителия, лежащего на базальной мембране. При окраске гистологических срезов по методу Маллори хорошо видно, что основа кожи представлена взаимно переплетающимися волокнами соединительной ткани, преимущественно коллагеновыми, окрашенными в синий цвет; встречались немногочисленные эластические волокна (окрашены в желтый цвет) (см. рисунок, а). Развитие волокнистой основы дермы обеспечивало достаточную функциональную лабильность кожи на данном этапе регенерации. В подкожной клетчатке, представленной рыхлой волокнистой неоформленной соединительной тканью (см. рисунок, б), хорошо просматривались округлой формы железы, заполненные ШИК-позитивным (красный цвет) веществом (см. рисунок, в, г). В проксимальной части культи клетки и тканевые структуры наиболее развиты и имеют близкий к дефинитивным вид. В дистальном участке наблюдались малодифференцированные клетки, клетки в начальных стадиях развития.

Под кожей определялись пучки продольно ориентированных скелетных мышечных волокон. На срезах, окрашенных реактивом Маллори, видны переплетения мышечных (красных) и эластических (розовых) волокон. Между пучками мышц хорошо развит эндомизий. По ходу мышечного волокна просматривались участки, окрашенные в голубой и красно-рыжий цвет, что свидетельствовало о становлении процесса синтеза миоглобина. Мышечные волокна располагались рыхло, переплетались между собой, напоминая сеть. По ходу волокна видны узлы сокращения, при этом уровень формирования поперечнополосатой исчерченности мышечного волокна в проксимальных и дистальных отделах регенерирующей конечности не одинаков. В проксимальном отделе регенерирующей конечности поперечнополосатая исчерченность мышечного волокна была сформирована. В дистальном отделе в мышцах миофибриллы немногочисленны и располагались хаотично. В области локтевого сустава к этому периоду регенерации мышечная ткань пока не имела характерной поперечнополосатой исчерченности и не заполнена миоглобином. В формирующейся мышечной ткани встречается много пигментных включений в виде черных гранул. Межмышечные соединительнотканные прослойки представлены коллагеновыми волокнами, отчетливо выявляемыми на срезах, окрашенных по Маллори (см. рисунок, а).

В центре регенерирующей грудной конечности к 62-м суткам регенерации сформирована хрящевая основа плечевой кости, локтевого сустава, костей предплечья, пясти и пальцев. Хрящевая кость снаружи покрыта надхрящницей, в составе которой обнаруживались преимущественно коллагеновые волокна и хондробласты уплощенной формы. Коллагеновые волокна, окрашенные в красный цвет по методу Ван Гизона, имели извилистую структуру с нечеткими границами и располагались в зоне надхрящницы и гиподермы (см. рисунок, б). В проксимальных участках хрящевых костей просматривались более молодые клетки в зоне роста хряща – хондробласты, которые занимали область суставной поверхности эпифизов. Встречались митотически делящиеся клетки, что свидетельствует об интенсивном остеогенезе. Хондромукоид, заполняющий пространство между хондроцитами и хондробластами, имеет гомогенную оксифильную структуру (см. рисунок, б). При окраске альциановым синим в хондромукоиде обнаруживались кислые мукополисахориды, окрашенные в синий цвет (см. рисунок, в, г).

В зоне незрелой хрящевой ткани выявляется базофильно окрашенный участок, четко ограниченный от окружающих тканей. Хондробласты располагаются тяжами в поперечном направлении, в каждом тяже насчитывается от 13 до 15 хондробластов. Их ядра имеют округлую форму располагаются либо в центре, либо смещены к периферии клетки. Цитоплазма в большей части не окрашена, но вокруг ядра сохранены участки оксифильной протоплазмы (см. рисунок, а).

В сформировавшихся хрящевых костях кисти, а именно – в проксимальных отделах пястных костей, хондромукоид содержит кислые мукополисахариды, тогда как в дистальных отделах пястных костей и пальцах на 62-е сутки регенерации мукополисахариды еще не выявлялись. На рисунке (в, г) отчетливо видна граница между морфофункционально зрелой и незрелой хрящевой тканью. Такая морфологическая и гистохимическая дифференцировка свидетельствовала о том, что сначала формируется морфологический (структурный) матрикс хрящевой кости, а позднее идет насыщение аморфного вещества кислыми мукополисахаридами, определяющими морфофункциональную зрелость хондроцитов и хондромукоида в регенерирующих хрящевых костях грудной конечности тритона.

Заключение

После тотальной ампутации грудной конечности у тритона к 62-м суткам завершается формирование основных анатомических структур регенерирующей конечности: плечевой кости, костей предплечья, запястья, пясти и пальцев. Регенерация конечности обусловлена рядом закономерностей: происходит делением клеток фибробластического ряда, ориентированных по направлению роста регенерата, формированием вокруг них матрицы светооптически плотной ткани и образованием зоны хрящевой ткани в области суставных поверхностей. Особенностью посттравматического гистогенеза хрящевой кости у тритонов после тотальной ампутации грудной конечности является последовательное становление структур хрящевой кости с дальнейшим морфофункциональным созреванием хондроцитов и матрикса, а также развитием поперечнополосатых мышц, покрытых тонкой кожей с 3–6 слоями эпителия и функционально активными железами, что определяет дефинитивное развитие конечности тритона.

Таким образом, иглистого тритона можно рассматривать в качестве перспективной тест-системы для проведения доклинических исследований по изучению регенерации тканей на примере резекции грудной конечности.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

А.А. Ганцгорн – разработка концепции исследования, проведение экспериментов, анализ результатов, написание рукописи.
Н.В. Донкова – научное консультирование, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.