Экспериментальное моделирование карциномы яичника

Введение

По данным GLOBOCAN, в мире рак яичника (РЯ) занимает 7-е место в структуре онкологической заболеваемости среди женщин и является самым летальным онкогинекологическим заболеванием [1]. До 90% случаев РЯ имеют эпителиальное происхождение (эпителиальный РЯ – ЭРЯ), остальные – неэпителиальной природы [2]. Серозная карцинома высокой степени злокачественности (СКВСЗ) составляет >70% всех случаев ЭРЯ и ассоциирована примерно с 90% случаев смерти от ЭРЯ. Из-за отсутствия специфических клинических симптомов на ранних стадиях около 80% больных ЭРЯ диагностируются уже на стадии распространенного процесса. Внутрибрюшинная диссеминация опухоли является превалирующим путем метастазирования ЭРЯ [3]. Пациентки с ЭРЯ и перитонеальным канцероматозом имеют 5-летнюю общую выживаемость на уровне 25–29%, в то время как на ранних стадиях она составляет более 90% [4]. Учитывая неудовлетворительные мировые онкоэпидемиологические показатели, характерные для РЯ, значительную долю больных с диссеминированными формами, высокую летальность и частоту рецидивов, а также ограниченный арсенал противоопухолевых агентов, необходимы дальнейший поиск эффективных средств лечения и изучение биологии опухолевого роста данного злокачественного новообразования. Эти задачи можно решить только при наличии воспроизводимых экспериментальных моделей in vivo, обеспечивающих приемлемую предсказуемость результатов доклинических испытаний для дальнейших клинических исследований.

Модели, основанные на спонтанном канцерогенезе яичника

Описаны модели РЯ, основанные на спонтанном канцерогенезе у кур, некоторых линий мышей, крыс Wistar и Sprague-Dawley и приматов из семейства мартышковых. Спонтанные аденокарциномы яичника кур развиваются с низкой частотой среди животных моложе 2 лет [5]. У грызунов спонтанные опухоли по гистологическому типу довольно разнообразны: тубулярная аденома, папиллярная цистаденома, аденокрацинома, мезотелиома, опухоли стволовых клеток, гранулезные опухоли и опухоли полового тяжа [6]. У макак возникают спонтанно стромальные, но не эпителиальные опухоли, характерные для человека [7]. Спонтанные опухоли яичника у всех животных указанных видов непригодны для экспериментальных исследований, так как требуется длительное время для развития, а частота их возникновения крайне низкая.

Канцероген-индуцированные модели

Известны химически индуцированные модели РЯ, которые появились в конце 1960-х годов. Следует отметить, что ни один из химических канцерогенов напрямую не связан с патогенезом ЭРЯ. Для индукции химического канцерогенеза яичников применяются 7,12-диметилбенз[a]антрацен; 20-метилхолантрен; 1,3-бутадиен; 2-[4- (5-нитро-2-фурил)-2-тиазолил] гидразид муравьиной кислоты и N-метил-N-нитрозомочевина [8–11]. Использование в качестве канцерогена 7,12-диметилбенз[a]антрацена позволяет получить массивные опухоли, иногда с внутрибрюшинными очагами и геморрагическим асцитом [12]. Индуцированные данными канцерогенами опухоли представляют собой опухоли поверхностного эпителия яичника, что подтверждает происхождение этих карцином из поверхностного эпителия. Однако эти опухоли состоят из клеток, напоминающих злокачественные клетки или эндометрия, или яйцевода (аналог фаллопиевых труб человека), и организованы в виде железистых или папиллярных структур, близких по строению к серозным карциномам эндометрия и яичников соответственно. Поэтому спорным остается вопрос относительно происхождения этих химически индуцированных опухолей: развились они непосредственно из поверхностного эпителия яичника в результате метапластической трансформации и просто морфологически напоминают опухоли яйцевода или все же первично возникли из клеток яйцевода [6]. Происхождение СКВСЗ остается предметом для дискуссий. В настоящее время имеются данные о дуалистическом происхождении СКВСЗ из поверхностного эпителия яичников и из эпителия маточных труб [13]. Кроме того, канцероген-индуцированные модели РЯ характеризуются большим разбросом во времени появления опухолей и частотой возникновения, непредсказуемым гистологическим вариантом и до конца неизученными молекулярными механизмами канцерогенеза. Работа с канцерогенами требует специальных условий и навыков, а также небезопасна как для исследователей, так и для технического персонала экспериментально-биологических клиник (вивариев). Основным предназначением канцероген-индуцированных моделей следует считать исследования по химиопрофилактике рака.

Генно-инженерные модели

Такие модели основаны на прямом введении онкогенов или инактивации генов-онкосупрессоров непосредственно в яйцеводе и довольно сложно воспроизводимы. Первая модель описана у самок трансгенных мышей, экспрессирующих трансформирующий вектор SV40 под контролем промотора гена рецептора антимюллерова гормона II типа (Mullerian inhibitory substance type II receptor). У мышей возникали двусторонние опухоли яичника с частотой 50%. По гистологическому типу это были низкодифференцированные карциномы с редко встречающимися кистами и папиллярными структурами на поверхности яичника. Наблюдалась внутрибрюшинная диссеминация опухолей с поражением сальника и формированием асцита [14]. Двойной нокаут генов Dicer и Pten у мышей позволил получить модель ЭРЯ, клинически сходную с СКВСЗ у человека. Опухоль первично вырастает в яйцеводе, распространяясь затем в яичники и брюшную полость, с формированием асцита и гибелью 100% животных [15]. Также известны трансгенные модели на мышах с инактивацией генов Brca 1/2, Pten и Tp53 в секреторном эпителии фаллопиевых труб (яйцеводов), что отчасти воспроизводит молекулярно-генетические изменения при СКВСЗ [16]. Описаны трансгенные модели с инактивацией обоих путей p53 и Rb [17]. Область применения генно-инженерных моделей – исследования химиопрофилактических агентов, изучение процессов инициации и прогрессии канцерогенеза. Модели реалистично воспроизводят микроокружение опухоли, а также известные генетические нарушения. Основными недостатками трансгенных моделей являются их трудоемкость, дороговизна, существенные временные затраты на индукцию опухолей. Кроме того, моделируемые генетические изменения лишь отчасти воспроизводят таковые, характерные для спонтанных СКВСЗ у человека.

Ксенографты. Общая характеристика

Известны модели ЭРЯ, основанные на трансплантации ксенографтов человека (клеточных линий, опухолевой ткани или асцитической жидкости) иммунодефицитным животным: бестимусным SCID-мышам (severe combined immunodeficient mice) и NOD-мышам (the nonobese diabetic mice). Необходимо отметить, что использование иммунодефицитных животных не позволяет в полной мере изучить влияние микроокружения на рост опухоли и противоопухолевый иммунный ответ. Для трансплантации ксенографтов ЭРЯ используется три пути введения: подкожный (эктопический), внутрибрюшинный и ортотопический (в яичниковую сумку) [18, 19]. Ключевые особенности каждого из способов трансплантации приведены в таблице.

Ксенографты клеточных линий человека

Несмотря на ряд существенных недостатков, ксенотрансплантация клеточных линий человека наиболее часто применяется в качестве моделей ЭРЯ. В настоящее время известно около 100 клеточных линий человека, используемых для ксенотрансплантации. Они перевиваются подкожно, внутрибрюшинно или ортотопически [20]. Наиболее часто используются линии A2780, OVCAR-3 и SKOV-3. Эти опухоли, как правило, характеризуются неясной, недифференцированной морфологией с комплексными генетическими изменениями, так как были получены от пациентов с распространенными стадиями ЭРЯ, вероятно, уже получившими противоопухолевое лечение химиотерапевтическими средствами. A2780 получена из эндометриоидного подтипа РЯ, а SKOV-3 наиболее очевидно получена из светлоклеточного подтипа РЯ [21]. Клеточная линия OVCAR3 близка к СКВСЗ. В доклинических исследованиях с использованием ксенотрансплантатов линии OVCAR3 была продемонстрирована противоопухолевая активность ряда агентов, например, анти-VEGF препаратов (VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста) в монорежиме или комбинации с химиотерапией (паклитаксел). В дальнейшем эти результаты нашли подтверждение в рамках клинических исследований [22]. В проведенном S. Domcke и соавт. анализе панели из 47 клеточных линий РЯ установлено, что наиболее часто используемые линии значительно отличаются по молекулярно-генетическому профилю от образцов опухолей СКВСЗ, что осложняет интерпретацию результатов доклинического изучения эффективности новых противоопухолевых средств, механизмов развития резистентности и возникновения нежелательных явлений. Значимые различия выявлены для вариаций числа копий генов, мутаций и изменения экспрессионного профиля матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) [23]. Основные преимущества ксенографтов клеточных линий человека – простота моделей, быстрота роста опухолей, воспроизводимость, а также реалистичность опухолевой прогрессии. К недостаткам следует отнести гомогенность и моноклональность клеток возникающих опухолей и их низкую предсказуемость для человека. Использование иммунодефицитных животных не позволяет моделировать взаимодействие опухоли с ее микроокружением в контексте развития иммунного ответа, воспаления, васкуляризации, взаимодействия со стромальными компонентами. Установлено, что противоопухолевый иммунный ответ и иммунное микроокружение опухолей яичника играют важную роль в формировании метастазов [24]. Необходимо также отметить высокую стоимость данных моделей и необходимость специальных условий для содержания тест-систем.

Модели PDX (patient-derived xenograft)

Модели основаны на гетеротрансплантации свежей опухолевой ткани или асцитической жидкости, полученной от пациентов, иммунодефицитным мышам. Трансплантация может осуществляться ортотопически, подкожно или внутрибрюшинно. Первая ортотопическая трансплантация РЯ человека была выполнена в 1993 г. под капсулу яичника бестимусной мыши. Энграфтмент опухолей наблюдался у 40% животных. Авторы отмечали локальный опухолевый рост, а также развитие метастазов в париетальной брюшине, сальнике, толстой кишке и образование асцита [25]. По данным J. Wu и соавт. [26], при подкожной или ортотопической (путем подшивания опухоли к яичнику) трансплантации образцов опухоли от 27 пациентов с различными вариантами РЯ (СКВСЗ, метастатический ЭРЯ, пограничные опухоли яичника, светлоклеточная карцинома, гранулезоклеточная опухоль яичника и др.) формирование опухолей (tumor formation rate, TFR) отмечено у 18,52% мышей, что несколько ниже значений, описанных в литературе (диапазон 25–100%). В работе F.Ricci и соавт. [27] получено 138 ксенографтов ЭРЯ из опухолей человека в процессе циторедуктивных вмешательств или парацентеза по поводу асцита. Из них 25% успешно перевивались мышам-самкам NCr-nu/nu. Трансплантацию выполняли подкожно (для солидных образцов опухоли), внутрибрюшинно (для асцитных вариантов) или ортотопически под сумку яичника (солидные и асцитные опухоли). При внутрибрюшинной и ортотопической трансплантации наблюдали рост опухолей яичника III степени злокачественности с диффузной диссеминацией в брюшную полость, иногда с формированием асцита. Опухоль достигала массы в 1 г и при внутрибрюшинном и при подкожном введении ксенографтов, однако происходило это за разное время: в течение 1–15 мес для подкожных, 1–4 мес для внутрибрюшинных. Перевиваемые ксенографты были очень чувствительны, чувствительны и резистентны к цисплатину [27]. Известны способы трансплантации ксенографтов опухолей человека под капсулу почки. В работе C-H.Lee и соавт. [28] различные варианты опухолей яичников (папиллярная серозная аденокарцинома, пограничные и доброкачественные муцинозные цистаденомы, гранулезоклеточные опухоли, пограничные серозные опухоли, переходные и недифференцированные опухоли поверхностного эпителия яичника грейда 3) трансплантировались под капсулу почки SCID/NOD мышам. Степень энграфтмента составила >95%. Широкое распространение PDX-модели получили благодаря схожести с ЭРЯ человека гетерогенности опухолей, молекулярно-генетических нарушений и процессов прогрессирования. Эти модели обеспечивают приемлемую предсказуемость результатов доклинических исследований в отношении патологии у человека. Несмотря на ряд преимуществ PDX-моделей, они все же не лишены существенных недостатков. Довольно часто при трансплантации ксенографтов человека у иммунодефицитных животных наблюдается развитие лимфопролиферативных заболеваний с атипичной диссеминацией опухоли и поражением органов средостения, гепатоспленомегалией и CD45⁺ лимфобластной атипией. При этом не наблюдается энграфтмента опухолей яичника [29]. Кроме того, PDX-модели генетически нестабильны, что выражается в изменении числа копий генов (copy number alterations) после пассажа опухолей in vivo, что, несомненно, следует учитывать при интерпретации результатов изучения противоопухолевых агентов, полученных на PDX-моделях [30]. Как уже было отмечено, для PDX-моделей сильно варьирует время развития опухолей, а степень энграфтмента зависит от характеристик трансплантируемой опухоли, линии мышей и способа трансплантации ксенографтов. PDX-модели малопригодны для изучения противоопухолевого иммунитета и взаимодействия опухоли со стромальными компонентами, так как имплантируемая строма человека впоследствии замещается мышиной [31]. Разработка, культивирование и поддержание PDX-моделей требуют специальных условий, существенных временных и финансовых затрат.

Сингенные модели

Эта группа моделей основана на трансплантации иммунокомпетентным реципиентам опухолевых клеток, полученных от той же самой линии (или вида) животных. В 60-х годах прошлого века в Институте экспериментальной и клинической онкологии АМН СССР (ныне НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина) была получена асцитная опухоль яичника, перевиваемая внутрибрюшинно аутбредным крысам-самкам Wistar. Исходная опухоль была обнаружена случайно у 9-месячной крысы-самки Wistar, мать которой получала во время беременности и лактации 7,12-диметилбенз[a]антрацен. Опухоль обширно метастазировала в брюшину и сальник с формированием асцита. Полученная опухолевая взвесь и асцит (папиллярная аденокарцинома) были многократно перевиты крысам-самкам Wistar внутрибрюшинно [32].

В лаборатории химиопрофилактики рака и онкофармакологии НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова асцитная карцинома яичников у крыс Wistar поддерживается в банке экспериментальных опухолей. Она широко применяется в разведочных онкофармакологических исследованиях, в апробации новых средств интраперитонеальной химиотерапии и химиоперфузионных технологий [33]. После внутрибрюшинной трансплантации асцитической жидкости, содержащей 1×10⁷ клеток в 0,5 мл физиологического раствора, у крыс-самок Wistar в течение 2–3 нед наблюдается развитие диссеминированного ЭРЯ с перитонеальным канцероматозом и геморрагическим асцитом (рис. 1, 2). При гистологическом исследовании аутопсийного материала обнаруживаются поля инвазивной злокачественной опухоли папиллярно-солидного строения, состоящей из округлых клеток со скудной эозинофильной или оптически пустой цитоплазмой, с крупными резко атипичными полиморфными ядрами и высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением (рис. 3). Данная гистологическая картина характерна для серозной карциномы high-grade. Модель воспроизводит поздние стадии (III–IV стадии) ЭРЯ у женщин. Она позволяет провести разведочный анализ фармакологических свойств тестируемых агентов (включая, но не ограничиваясь противоопухолевой активностью), изучать биологию опухолевого роста.

В работе S. Sekiya и соавт. [34] описана внутрибрюшинная перевивка клеточной линии недифференцированной аденокарциномы яичника (ROT68/C1) новорожденным крысятам Sprague-Dawley (через 48 ч после рождения) по 5×10⁵ клеток. У животных в 100% случаев развиваются метастазы в брюшной полости и легких. Существенным недостатком этой модели является выбор в качестве животных-реципиентов новорожденных крыс.

Классическим примером сингенного РЯ является мышиная клеточная линия ID8, полученная от мышей линии C57BL/6 в результате спонтанной трансформации клеток поверхностного эпителия яичника при многократном пассаже (>20 пассажей) in vitro [35]. Трансплантируется иммунокомпетентным мышам этой же линии по 5×10⁶ клеток. Подкожные опухоли формируются в течение 4 мес и не метастазируют. При внутрибрюшинной трансплантации метастазируют в диафрагму, брюшину, брыжейку и сальник с формированием геморрагического асцита. Опухоли и асцит формируются примерно в течение 90 дней [36]. Клеточная линия ID8 может трансплантироваться ортотопически под сумку яичника. Вводится по 1×10⁶ клеток в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS). Через 90 дней у мышей линии C57BL/6 возникали массивные первичные опухоли яичника, перитонеальный канцероматоз и геморрагический асцит. Наблюдались гиперваскуляризация опухолей и формирование серозного эпителиального канцероматоза [37]. Еще одна сингенная опухоль яичника была получена в результате спонтанной злокачественной трансформации клеточной линии поверхностного эпителия яичников M0505 при многократном пассаже клеток (линия STOSE). Трансплантируется мышам линии FVB/N по 1×10⁷ клеток внутрибрюшинно или по 4×10⁴ под мембрану яичников. Прививаемость составляет 100%. При перевивке под мембрану сумки яичника наблюдались обширные внутрибрюшинные метастазы и асцит. По гистологическому типу опухоль схожа с СКВСЗ, однако все же гистология является смешанной, включает очаги муцинозных, недифференцированных и папиллярных серозных структур [38]. Известна сингенная линия NuTu-19, представляющая собой низкодифференцированную карциному яичников. Трансплантируется внутрибрюшинно по 1×10⁶ клеток крысам-самкам линии Fischer 344. Через 4 нед после трансплантации у 80% животных наблюдалось развитие перитонеального канцероматоза и геморрагического асцита [39]. Сингенные модели позволяют изучать развитие противоопухолевого иммунного ответа, эпителиально-стромальные взаимодействия, процессы васкуляризации опухоли. Использование иммунокомпетентных животных обеспечивает низкую частоту инфекционных осложнений в сравнении с иммунодефицитными животными. Основной недостаток сингенных моделей обусловлен тем, что прививаются аллографты, т.е. опухоли, которые растут только на том виде (линии) животных, на котором они изначально были получены. Это в определенной степени затрудняет экстраполяцию результатов доклинических исследований на патологию у человека, но тем не менее позволяет провести разведочный анализ противоопухолевой активности тестируемых агентов, изучать биологию опухолевого роста, взаимодействие ее с микроокружением.

Заключение

В эру персонализированной медицины крайне важен правильный выбор моделей у лабораторных животных. Несмотря на бурное развитие клеточных технологий, появление 3D-моделей опухолей (органоиды), исследования, проводимые на лабораторных животных, остаются важной частью доклинических испытаний тестируемых фармакологических агентов и методов лечения, фундаментальных работ. Трансплантация иммунодефицитным животным ксенографтов человека считается основным способом моделирования эпителиального РЯ, хотя сопряжена с высокими временными и финансовыми затратами. Тем не менее не стоит забывать о сингенных моделях. Они позволяют не только провести разведочный анализ фармакологических свойств тестируемых агентов, но и тестировать новые подходы к локальному (внутрибрюшинному) лечению диссеминированных форм эпителиального РЯ, изучать биологию опухолевого роста, ее взаимодействие с микроокружением.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Муразов Я.Г. – концепция, сбор и систематизация материала, написание, редактирование текста статьи

Нюганен А.О. – сбор и систематизация материала, редактирование текста статьи

Артемьева А.С. – критические замечания, редактирование текста статьи.