Войтенко Н.Г., Макарова М.Н. Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 3: карликовые свиньи. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 3. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-03-02
На сегодняшний день в распоряжении ученых для проведения токсикологических, фармакокинетических и других исследований, помимо грызунов, находится более десятка других лабораторных животных. Свиней уже давно используют для изучения трансплантации органов и тканей, хирургической подготовки студентов-медиков, однако их применение может быть значительно шире. Анатомическое сходство с человеком и крупные размеры этих животных позволяют успешно проводить исследования сердечно-сосудистой, пищеварительной и мочевыделительной систем, а также использовать в доклинических и токсикологических исследованиях. В связи с этим установление референсных интервалов биохимических показателей крови лабораторных свиней является актуальной задачей.
В статье представлены референсные интервалы биохимических показателей крови карликовых свиней, полученные с применением классического подхода. Были использованы результаты биохимического анализа крови 15 самцов и 15 самок клинически здоровых карликовых свиней в возрасте 9–11 мес массой тела 14–26 кг, выращенных в нашем питомнике. Помимо основных биохимических показателей (креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин), представлены дополнительные параметры – расширенный липидный профиль, концентрация кальция и фосфора, активность ряда ферментов (лактатдегидрогеназа, креатинкиназа, амилаза, гамма-глутамилтрансфераза и холинэстераза), являющихся биохимическими маркерами повреждения различных систем и органов.
Наиболее выраженные отличия обнаружены при исследовании липидного профиля самцов и самок карликовых свиней: концентрация общего холестерина и триглицеридов в крови самок была выше в среднем в 1,5 и 2 раза соответственно. Кроме того, в сыворотке крови самок концентрация Х-ЛПНП была в среднем в 1,8 раз выше, чем в сыворотке крови самцов. Менее выраженные, но статистически значимые различия были обнаружены в отношении концентрации общего белка и глобулинов.
Проведенный анализ представленных референсных интервалов с данными литературы показал сопоставимость полученных значений. Несмотря на значительное сходство биохимических профилей человека и лабораторных свиней, необходимо учитывать наличие видовых различий при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Сегодня в распоряжении ученых для проведения токсикологических, фармакокинетических и других исследований, помимо грызунов, имеется более десятка других лабораторных животных. Благодаря своему анатомическому и физиологическому сходству с человеком свиньи признаны одним из лучших вариантов для моделирования и изучения целого ряда патологий, кроме того, известно, что геном свиньи в 3 раза ближе к геному человека, чем геном мыши [1]. Свиней уже давно используют для изучения трансплантации органов и тканей, хирургической подготовки студентов-медиков и разработки новых методов и медицинских устройств [2, 3], однако их применение может быть значительно шире. Анатомическое сходство с человеком и крупные размеры этих животных позволяют успешно проводить исследования сердечно-сосудистой, пищеварительной и мочевыделительной систем, а также использовать их в доклинических и токсикологических исследованиях [4–6].
Все более широкое распространение в биомедицинских исследованиях получают модели с использованием генетически модифицированных животных. И тут свиньи тоже имеют ряд преимуществ благодаря генетической близости к человеку. Геном мыши хорошо изучен, современная наука может предложить трансгенных мышей для изучения спинальной мышечной атрофии и болезни Паркинсона, но, к сожалению, далеко не все они в полной мере воспроизводят патогенез изучаемых патологий [7, 8]. Одним из ярких примеров является муковисцидоз. В этом случае, когда мутация, вызывающая муковисцидоз у человека, моделируется на мышах, у них не наблюдается ни одного из симптомов болезни человека. В настоящее время разработана более успешная модель этого заболевания на свиньях, которая полностью имитирует патогенез и симптомы у человека [9]. Несмотря на такие преимущества, свиньи являются далеко не самыми распространенными лабораторными животными. В отчете Understanding Animal Research в Англии за 2019 г. свиньи не упоминаются отдельной строкой, так как их количество в доклинических исследованиях не превышает суммарно использованных приматов, собак и кошек, на долю которых приходится всего 0,2% от общего числа лабораторных животных [10]. В связи с отсутствием достаточной информации в доступных источниках литературы и различными условиями содержания и кормления карликовых свиней, а также с возможными породными особенностями установление референсных интервалов (РИ) биохимических показателей крови этих животных в каждом испытательном центре является актуальной задачей.
С целью реализации принципов 3Rs наиболее рационально проводить ретроспективный анализ, который позволяет включать большое количество животных, для редко используемых или новых видов применим классический подход к формированию РИ [1]. В статье, помимо РИ, для основных биохимических показателей, уже рассмотренных в наших предыдущих сообщениях, представлены дополнительные параметры – расширенный липидный профиль, активность ряда ферментов, являющихся биохимическими маркерами повреждения разных систем и органов. Различный дизайн экспериментов с проведением каких-либо дополнительных исследований (изучение гормонального статуса, иммунологических тестов или фармакокинетических исследований) может предусматривать получение как сыворотки, так и плазмы крови. Для оптимизации сбора биологического материала проведен сравнительный анализ биохимических показателей в плазме и сыворотке крови.
Для формирования РИ использованы данные, определенные в первом полугодии 2020 г. в ходе мониторинга здоровья животных, выращенных в нашем центре. В сформированном массиве находились результаты, полученные от 15 самцов и 15 самок карликовых свиней в возрасте 9–11 мес массой тела 14–26 кг. Были использованы небеременные и нерожавшие самки. В период адаптации и последующих экспериментов животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26оС, относительная влажность 40–75%, 12-часовой световой день. Карликовых свиней содержали в вольерах с древесным подстилом со свободным доступом к воде. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики.
Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с использованием принятых в нашем испытательном центре аналитических методов. В плазме и сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Biosystems S.A., Испания) измерены следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Также рассчитаны уровень глобулинов в сыворотке крови и соотношение альбумин/глобулины (A/G). В 15 образцах сыворотки самцов и в 14 образцах сыворотки самок дополнительно измерены активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы, амилазы, гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) и холинэстеразы, а также концентрация кальция, фосфора, холестерина (ХС) липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и холестерина липопротеинов низкой плотности (Х-ЛПНП). Для определения концентрации общего билирубина и активности ГГТ использовали наборы реактивов Вектор-Бест (Россия), для остальных аналитов – наборы BioSystems S.A. (Испания). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: статистические выбросы по методу Тьюки, вид распределения по критерию Шапиро–Уилка, сравнение между животными разного пола по U-критерию Манна–Уитни и t-критерию Стьюдента. Для сравнения результатов в плазме и сыворотке крови использовали критерий Уилкоксона и t-критерий Стьюдента для парных измерений.
Учитывая малое число животных, для формирования РИ применен классический подход – сформированы группы клинически здоровых самцов и самок, близких по возрасту и морфометрическим показателям.
Несмотря на ограниченное число наблюдений, массивы были проверены на наличие статистических выбросов, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки. Из дальнейшей работы было необходимо исключить данные, лежащие за пределами интервала 1-го и 3-го квартилей Q1 и Q3 соответственно. Межквартильный интервал IQR определяли как Q3 – Q1. Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом: Q1–1,5.IQR и Q3 +1,5.IQR, значения, выходящие за пределы интервала Q1–3.IQR и Q3 +3.IQR, определяли как «жесткие» выбросы [11].
При анализе статистических выбросов не отмечено ни одного «жесткого» выброса. При обнаружении выбросов по одному и тому же показателю в плазме и сыворотке результаты были рассмотрены дополнительно – в 4 случаях (1 — при измерении активности АСТ и 3 – концентрации триглицеридов) обнаружены однонаправленные выбросы в парных образцах. Это позволило предположить, что выявленные отклонения не являются случайными, не связаны с дефектами образцов или некорректными измерениями, а, возможно, являются редкими наблюдениями и поэтому должны быть включены в общий массив данных [2]. Таким образом, статистических выбросов в полученном массиве было меньше, чем было выявлено по методу Тьюки. В плазме крови самцов в одном образце обнаружены выбросы сразу по нескольким показателям – креатинину, мочевине, ХС, триглицеридам, АЛТ, при этом в сыворотке того же животного все эти и другие показатели находятся внутри интервала Q1–1,5.IQR - Q3 +1,5.IQR. Это позволяет предположить, что выбросы, полученные в плазме этого самца, связаны с дефектом конкретного образца сыворотки, поэтому результаты были исключены из расчетов. В табл. 1 указаны статистические выбросы, которые исключили из дальнейшей работы.
Максимальное количество статистических выбросов обнаружено при определении концентрации триглицеридов в плазме и сыворотке самцов. При этом по ряду показателей – активность АСТ, ГГТ, ЩФ, холинэстеразы, концентрация глюкозы и альбумина –статистических выбросов не обнаружено (данные в табл. 1 не представлены).
Для дальнейшей обработки данных определяли тип распределения для каждого показателя в плазме или сыворотке самцов или самок. В большинстве случаев результаты подчинялись нормальному распределению, за исключением активности АСТ в плазме и сыворотке крови самцов и в плазме крови самок, концентрации альбумина в плазме крови животных обоего пола, активности амилазы в сыворотке крови самцов и расчетного показателя A/G.
На следующем этапе проведено сравнение исследуемых показателей в плазме и сыворотке крови. Из массива для анализа исключены пары образцов, где хотя бы один из результатов измерения был признан статистическим выбросам, а также расчетные значения, зависящие от этих результатов (концентрация глобулинов и соотношение A/G). Согласно правилам [3], для измерения активности АСТ предпочтительно использовать плазму крови, так как в сыворотке при проведении пробоподготовки может быть повышена активность этого фермента. При исследовании мы не обнаружили статистически значимых различий активности АСТ в зависимости от вида образца. Снижение концентрации общего белка в сыворотке крови за счет выхода фибриногена в сгусток нашло свое отражение в настоящем исследовании: в среднем концентрация общего белка в сыворотке была ниже на 5 г/л и сопровождалась статистически значимым увеличением доли глобулинов в образцах. Кроме того, отмечено статистически значимое повышение концентрации триглицеридов в среднем на 0,05 ммоль/л в сыворотке крови по сравнению с плазмой. Эти изменения отмечены как у самцов, так и у самок, но, учитывая, что эта разница сопоставима с пределом обнаружения этого аналита [4], считаем, что можно пренебречь этими отличиями. По той же причине обнаруженное статистически значимое увеличение концентрации билирубина в сыворотке крови самок по сравнению с плазмой этих же животных также можно считать незначимым [5].
В табл. 2 представлены РИ биохимических показателей крови карликовых свиней в зависимости от пола животных и вида образца (плазма или сыворотка). Для данных, подчинявшихся нормальному распределению, РИ рассчитывали как среднее ±1,96 * стандартное отклонение (Хср±1,96SD), в табл. 2 указаны интервал и в скобках среднее значение. Для других видов распределения (промежуток 2,5–97,5 процентиля – pr) в табл. 2 представлены интервал и в скобках – медиана. Данные, не подчиняющиеся нормальному распределению, выделены серым цветом.
Дополнительно проводили сравнение биохимических показателей крови между животными разного пола методами параметрической статистики для нормально распределенных данных (t-критерий Стьюдента) и непараметрической статистики для ненормального распределения (U-критерий Манна–Уитни).
Наиболее выраженные отличия обнаружены при исследовании липидного профиля самцов и самок карликовых свиней: концентрация общего холестерина и триглицеридов в крови самок была выше в среднем в 1,5 и 2 раза соответственно. Эта тенденция сохранялась как в плазме, так и сыворотке крови. Кроме того, в сыворотке крови самок концентрация ХС ЛПНП была в среднем в 1,8 раза выше, чем в сыворотке крови самцов. Менее выраженные, но статистически значимые различия обнаружены в отношении концентрации общего белка и глобулинов у самок, которые в среднем были выше на 12 и 26% соответственно. Также в сыворотке крови самок отмечали более высокий уровень глюкозы, фосфора и активности ЛДГ. Ни для одного из перечисленных выше показателей в человеческой популяции не описаны значимые отличия в зависимости от пола [12]. Несмотря на отмеченную ранее схожесть физиологических и биохимических процессов в организме свиней и человека, ряд показателей крови существенно отличается: концентрация кальция, фосфора, активность ЛДГ, ЩФ, креатинкиназы и особенно амилазы в крови карликовых свиней имеет значительно более высокий диапазон значений. Так, содержание фосфора в крови карликовых свиней выше примерно в 2 раза, а кальция – в 5 раз и более. Активность амилазы больше на 2 порядка, чтобы попасть в линейный диапазон методики (до 1300 Ед/л) для всех проб при измерении этого параметра, потребовалось разведение в 2 раза. Обратная картина наблюдается в отношении общей холинэстеразы – активность этого фермента, измеренная по бутирилхолину [6], у наших животных составила в среднем 500 Ед/л, в то время как диапазон нормальных значений в клинической практике лежит в пределах 4000–11 000 Ед/л. Значения концентрации общего холестерина, ХС ЛПНП, триглицеридов и особенно общего билирубин лежат в более низком диапазоне. Другие изученные в этом исследовании биохимические показатели укладываются в диапазон от 50 до 150%, т.е. имеют сходные значения с таковыми у человека. Для иллюстрации полученных данных результаты измерения биохимических показателей у карликовых свиней были выражены в процентах по отношению к усредненным значениям для человека (см. рисунок). В случае если оптимальными для человека считаются значения ниже определенной величины (например, общий холестерин менее 5,2 ммоль/л), это пограничное значение и брали для расчета. Для получения усредненных показателей крови карликовых свиней объединили данные, которые были определены в плазме и сыворотке крови самцов и самок.
Оценить в данном исследовании межиндивидуальную и внутрииндивидуальную вариабельность биохимических показателей крови карликовых свиней и сравнить их с аналогичными данными для человеческой популяции не представляется возможным из-за малого объема выборки экспериментальных животных.
При сравнении полученных результатов с опубликованными референсными интервалами биохимических показателей крови свиней не выявлено существенных противоречий. По данным литературы, концентрация общего холестерина и билирубина колеблется в более широком диапазоне, чем у нас, что, вероятно, связано с ограниченной выборкой животных в настоящем исследовании и возможными различиями в условиях содержания и кормления. В табл. 3 указаны диапазоны значений основных биохимических показателей, а также средние значения и стандартное отклонение (М±SD), полученные от разных пород свиней. Представленные значения были переведены в единицы измерения, в которых проведено измерение в нашем испытательном центре.
Указанные результаты еще раз подтверждают необходимость создания в каждом испытательном центре внутрилабораторных баз данных РИ для каждого вида животных, поскольку на полученные значения может влиять целый ряд факторов – порода, условия содержания и кормления. Со временем накопление данных позволит провести ретроспективный анализ больших выборок с полным соблюдением принципов 3Rs. Для расчета РИ следует использовать значения тех или иных показателей, которые были получены от интактных (клинически здоровых животных), содержащихся в равных условиях с использованием одинаковых аналитических методов.
Представленные результаты подтверждают необходимость и актуальность накопления данных для создания и периодического пересмотра референсных интервалов для каждого вида лабораторных животных, используемых для проведения доклинических исследований в испытательном центре. При анализе референсных интервалов с использованием классического подхода в сравнении с указанными в литературе выявлена сопоставимость их значений, что можно считать дополнительным подтверждением удовлетворительности полученных нами данных.
Сравнительный анализ результатов измерений биохимических показателей в плазме и сыворотке крови не выявил клинически значимых отличий, что позволяет в дальнейшем накапливать для ретроспективного анализа данные, определенные в любом из этих биологических образцов. Несмотря на значительное сходство биохимических профилей человека и лабораторных свиней, необходимо учитывать наличие видовых различий при рассмотрении результатов доклинических исследований.
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Вклад авторов
Войтенко Н.Г. – идея, планирование, разработка дизайна, сбор и систематизация материала, анализ и интерпретация результатов, написание, редактирование текста.
Макарова М.Н. – идея, разработка дизайна.
[1] ГОСТ Р53022-3 – 2008. Технологии лабораторные и клинические. Требования к качеству лабораторных исследований. Правила оценки клинической эффективности лабораторных тестов. – М., 2008.
[2] ГОСТ Р ИСО 16269-4-2017 Статистические методы. Статистическое представление данных. Часть 4. Выявление и обработка выбросов.
[3] ГОСТ Р 53079.4-2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа.
[4] Инструкция к набору для определения триглицеридов (глицеролфосфатоксидаза/пероксидаза), BioSystems S.A. – 01/2012.
[5] Инструкция по применению «Набор реагентов для определения общего билирубина в сыворотке крови». Вектор-БЕСТ, утверждена 17.11.2009 приказом Росздравнадзора №9239-Пр/09.
[6] Инструкция к набору для определения активности холинэстеразы (бутирилхолин), BioSystems S.A. – 01/2012.