Применение витальных методов исследования как промежуточных точек в доклинических испытаниях фармацевтических препаратов на модели карликовых свиней

Д.Ю. Акимов1, главный ветеринарный врач, ORCID 0000-0003-3141-492X;
М.Н. Макарова1, доктор медицинских наук, заместитель директора, ORCID 0000-0003-3176-6386;
Я.А. Гущин1, руководитель отдела гистологии и патоморфологии, ORCID: 0000-0002-7656-991Х;
В.М. Косман2, кандидат фармацевтических наук, руководитель группы химико-аналитических исследований ORCID 0000-0001-9690-1935

1АО НПО «Дом Фармации»;
2ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации»,
188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, корп. 245

E-mail: akimov.du@doclinika.ru

Резюме

Карликовые свиньи являются предпочтительной тест-системой для изучения хронической токсичности, иммуногенности, фармакокинетики, патофизиологических состояний, индукции патологий и широко используются в мире как модель для доклинических исследований. Однако использование крупных животных в доклинических исследованиях имеет ряд ограничений, прежде всего это личностное отношение персонала, работающего с животными, стоимость каждого животного в эксперименте, затраты на их обслуживание и выполнение манипуляций. Поэтому очень важным аспектом при использовании крупных животных в исследовании является изыскание способов уменьшения количества используемых экспериментальных животных без ущерба для качества исследований и их научной ценности. 
Ввиду установленных фактов цель настоящей работы – установить информативность и применимость использования малоинвазивных методов исследования в качестве промежуточных точек в доклинических испытаниях для сокращения численности животных и минимизации высокоинвазивных вмешательств или эвтаназии животных. 
В работе использованы 12 карликовых свиней обоего пола в возрасте 36–60 мес. и массой тела 40–71 кг. Опробованы малоинвазивные методы, такие как ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости, тонкоигольная биопсия мягких тканей, сбор желчи, желудочного сока и мочи. На основании результатов УЗИ, клинического осмотра, гематологического, биохимического анализов крови и оценки свертывающей системы крови была определена скорость реабилитации животных после осуществления вмешательства. Оценены риски проведения процедур на целостность и достоверность доклинического исследования.
Установлено следующее:
а) УЗИ в качестве промежуточной точки исследования – легковыполнимая и информативная манипуляция, благодаря которой можно оценить анатомические и структурные изменения в органах и тканях;
б) тонкоигольная биопсия – удобный и диагностически значимый метод оценки влияния тестируемого препарата на органы (печень, селезенка, легкие, предстательная железа);
в) чрескожная пункция желчного пузыря – манипуляция, требующая определенных навыков, однако позволяющая получить достаточное количество биоматериала;
г) процедура получения желудочного сока у наркотизированных карликовых свиней, как и цистоцентез, не представляет трудностей. 

Введение

В настоящее время растет интерес к трансляционным моделям изучения заболеваний человека. В частности, карликовые свиньи служат хорошей моделью для изучения хронической токсичности, иммуногенности, фармакокинетики, патофизиологических состояний, индукции патологии и широко используются в мире [1–6].

Вместе с тем применение крупных животных в доклинических исследованиях имеет ряд ограничений, прежде всего это личностное отношение персонала, работающего с животными, стоимость каждого животного в эксперименте, затраты на их обслуживание и выполнение манипуляций. Поэтому очень важным аспектом при использовании крупных животных является изыскание способов уменьшения количества экспериментальных животных без ущерба для качества эксперимента и его научной ценности [7–10]. Однако при длительных фармакологических испытаниях классических методов исследования крови, мочи на промежуточных точках может быть недостаточно. Чтобы исключить эвтаназию дополнительного количества животных и повысить информативность в ходе работы могут быть использованы разнообразные витальные и малоинвазивные методы [11], например, УЗИ эхогенных органов, получение биоптатов ряда органов, биологических жидкостей (желчи, желудочного сока, мочи и др.) [12].

Цель работы – установить информативность и применимость использования малоинвазивных методов исследования в качестве промежуточных точек в доклинических испытаниях для сокращения численности животных и минимизации высокоинвазивных вмешательств или числа животных, подвергнутых эвтаназии при исследовании. Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

  • определить применимость и информативность УЗИ;
  • сформировать рекомендации и ограничения к проведению биопсии внутренних органов;
  • установить возможности получения желудочного сока, желчи и мочи надлежащего качества и достаточного количества;
  • уточнить потенциальное влияние выполненных процедур на целостность данных в рамках доклинических исследований;
  • определить состояние и скорость реабилитации животных после данных манипуляций.

Материалы и методы

Исследования были проведены на базе АО НПО «Дом Фармации» в марте 2020 г. Данный эксперимент был одобрен на заседании биоэтической комиссии, заключение № 3.52/19. Объектом исследования послужили 12 карликовых свиней в возрасте 36–60 мес и живой массой тела 40–71 кг. Половое соотношение исследуемой группы карликовых свиней неравное, было использовано 4 самца и 8 самок. После проведения рандомизации им были присвоены номера, указанные в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика объектов исследования
 <strong>Таблица 1.</strong> Характеристика объектов исследования

Животных перед наркотизацией и взятием крови подвергали депривации кормом на  8–12 ч. В качестве анестезиологического обеспечения была использована комбинация препаратов Золетил-100 и Ксила. После наркотизации и выполнения малоинвазивных процедур животным обеспечивали постхирургическое сопровождение. Мониторинг постоперационного состояния включал клинический осмотр на протяжении 14 дней и УЗИ-мониторинг через 1, 4 и 24 ч после проведения манипуляции.

Биоптаты получали под контролем аппарата ультразвуковой диагностики Mindray DP-50 (УЗИ) и на основании анатомо-топографических ориентиров.

Желчь собирали при помощи пункции желчного пузыря с использованием иглы 18G (длина 15 см) из набора для катетеризации крупных сосудов (Bayer) под контролем УЗИ.

Желудочный сок забирали с помощью гастрального зонда калибра СН-18 и СН-14.

Спустя 48 ч после выполнения инвазивных процедур осуществляли взятие крови из латеральной или центральной ушной вены. Проводили гематологическое и биохимическое исследования крови: определяли содержание альбумина, уровень общего белка, глюкозы, α-амилазы, кальция, фосфора, мочевины, креатинкиназы, креатина, аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), холестерина, триглицеридов и билирубина. Также учитывали протромбиновое время и активированное частичное тромбопластиновое время.

Исследование желчи, желудочного сока, мочи и крови осуществляли общепринятыми методиками.

Данные статистически обрабатывали с помощью программы Statistica 10.

Результаты и обсуждение

 <strong>Рис. 1.</strong> Проведение УЗИ карликовым свиньям
Рис. 1. Проведение УЗИ карликовым свиньям

Проведение контроля промежуточных точек в ходе доклинических исследований имеет важное прикладное значение. УЗИ органов брюшной полости и сердца можно осуществлять без использования наркоза. Карликовые свиньи хорошо поддаются хендлингу и воспринимают данную процедуру, как элемент социального взаимодействия с человеком (рис. 1). Внутренние органы, системы органов достаточно хорошо визуализируются, например почка (рис. 2).

 <strong>Рис. 2.</strong> Почка карликовой свиньи, УЗИ-изображение
Рис. 2. Почка карликовой свиньи, УЗИ-изображение

Использование УЗИ в качестве промежуточной точки является легковыполнимой и информативной манипуляцией, благодаря которой можно оценить анатомические и структурные изменения в органах и тканях.

Биопсия. Получение биоптата требует адекватного анестезиологического обеспечения животного, а также УЗИ-сопровождения, что позволяет визуализировать не только структуру органа, но и расположение иглы для получения биоптата (рис. 3).

 <strong>Рис. 3.</strong> УЗИ-сопровождение при введении биопсийной иглы: <em>а</em> – биопсийная игла; <em>б</em> – печень
Рис. 3. УЗИ-сопровождение при введении биопсийной иглы: а – биопсийная игла; б – печень

В исследовании была предпринята попытка получить биоптаты печени, селезенки, легких, предстательной железы, материалы были подвергнуты гистологическому исследованию. Гистологическая картина исследования полученных биоптатов представлена в табл. 2.

Анализируя результативность отбора биообразцов, следует отметить, что из 12 животных только у 5 удалось получить ткань печени. В остальных случаях в биопсийной игле оказывались соединительная и мышечная ткани, а в 1 случае – ткань селезенки. Успешнее всего удалось взять биопсию тканей легкого и селезенки: в 10 из 12 и 11 из 12 случаев соответственно получены образцы надлежащего качества. При биопсии легких в одном случае была отобрана мышечная ткань и еще в одном образец получить не удалось. В 1 случае из 12 вместо биоптата селезенки были взяты соединительная и мышечная ткани. Получение биоматериала предстательной железы апробировалось на имеющихся 4 половозрелых самцах и было успешным, примеры полученных образцов отражены на рис. 4–7.

Таблица 2. Результаты исследования биоптатов
 <strong>Таблица 2.</strong> Результаты исследования биоптатов

 <strong>Рис. 4.</strong> Биоптат печени. Окраска гематоксилином и эозином (ГЭ), ×100
Рис. 4. Биоптат печени. Окраска гематоксилином и эозином (ГЭ), ×100

 <strong>Рис. 5.</strong> Биоптат селезенки.  Окраска ГЭ, ×100
Рис. 5. Биоптат селезенки.  Окраска ГЭ, ×100

 <strong>Рис. 6.</strong> Биоптат легких. Окраска ГЭ, ×100
Рис. 6. Биоптат легких. Окраска ГЭ, ×100

 <strong>Рис. 7.</strong> Биоптат предстательной железы. Окраска ГЭ,×100
Рис. 7. Биоптат предстательной железы. Окраска ГЭ,×100

По результатам можно заключить, что взятие биопсии печени, легких, селезенки и предстательной железы (♂) целесообразно у карликовых свиней (самцов) с живой массой тела до 45 кг, так как удается получить качественные образцы всех четырех органов.

При проведении биопсии у самок мы можем рекомендовать животных массой тела до 53 кг, однако не следует при биопсии печени использовать карликовых свиней (♀) массой более 61 кг. В этом случае получение от них образцов органов затруднено в связи с большими жировыми отложениями в подкожной жировой клетчатке и как следствие плохой визуализацией органа на УЗИ.

Желчь

Получение желчи при помощи пункции под контролем УЗИ не представляло сложности. От всех экспериментальных животных собрано от 7,5 до 12,8 мл желчи. Данного количества биоматериала достаточно для проведения лабораторных исследований [13–15]. Осложнений в постоперационный период не наблюдалось.

Анализ желудочного сока карликовых свиней

Сбор желудочного сока не составил труда ни в одном из случаев, образцы были взяты у всех животных. Значения рН желудочного сока у человека схожи с полученными данными и варьируют в интервале 1,4–2,5, что совпадает с данными литературы [16, 17].

Цистоцентез – реалии для рутинной практики

Получение мочи от крупных лабораторных животных в рутинной практике имеет некоторые сложности, связанные с тем, что дизайн исследования обычно предполагает сбор образцов мочи сразу от большого количества животных за короткий промежуток времени [18]. Существует еще одна проблема: при получении мочи естественным образом требуютcя высокая квалификация персонала, гигиеническая обработка животных и даже при соблюдении этих условий образцы могут быть существенно загрязнены. Постановка катетера и удержание его на теле животного на протяжении длительного периода (например, сбор суточной мочи) также имеет ряд технических сложностей и может сопровождаться утратой части образцов. Использование анестезии и УЗИ для цистоцентеза позволяет визуализировать мочевой пузырь и упрощает получение мочи. При проведении данной процедуры удалось взять образцы мочи от всех животных. Результаты исследования представлены в табл. 3.

Таблица 3. Сравнительная характеристика общего анализа мочи (n=12) M±m
 <strong>Таблица 3. </strong>Сравнительная характеристика общего анализа мочи<em> (n=12) M±m</em>

Полученные пробы мочи оказались достаточно высокого качества, что говорит о хороших перспективах использования данного метода для сбора биообразцов.

Реабилитация, восстановление

K.Glińska-Suchocka и соавт. [19] сообщают о высоком риске кровотечений в ходе и после проведения биопсии печени, а также делятся наблюдениями клинического случая гибели 1 из 35 испытуемых животных.

С целью мониторинга состояния экспериментальных животных проводили УЗИ через 1, 4 и 24 ч после вмешательства. В ходе исследования у всех испытуемых животных не было выявлено сгустков крови, которые визуализируются как гиперэхогенные или образования повышенной эхогенности неправильной (реже округлой или полусферической) формы с неровными контурами, неоднородной эхоструктуры с гипоэхогенными включениями в виде очагов или узких полосок, обусловленных слоистостью сгустка. Относительная однородность эхоструктуры сгустка может быть при наличии сладжа, т.е. осадка из слущенного эпителия и гемолизированной крови [12].

Кроме УЗИ, после завершения всех процедур проводили ежедневный клинический осмотр на протяжении 14 дней, в рамках которого оценивали общее клиническое состояние животных.

На основании ежедневного клинического осмотра на протяжении всего периода эксперимента состояние животных было охарактеризовано как хорошее. Наблюдения в ходе выхода животного из наркоза не берутся в расчет, так как симптомы (шаткая походка, нарушение координации и ориентации в пространстве, редко – рвота) были вызваны действием препаратов и не свидетельствовали о наличии осложнений от проведенной манипуляции.

Место введения иглы для биопсии мягких тканей обрабатывали в течение 3 дней (до полного ранозаживления) 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата, затем наносили террамицин-спрей. Осложнений в месте нанесения разреза и введения биопсийной иглы установлено не было. Регенерация тканей на 3-й день вместо 7–14 дней при классической лапаротомии является привлекательным аспектом применения биопсии [20]. Заживление разрезов после лапаротомии по-прежнему сопровождается такими осложнениями, как инфекция, гранулема, свищи и особенно разрыв брюшины и послеоперационная грыжа [21].

В качестве одного из комплексных диагностических показателей состояния организма использовали гематологический (табл. 4) и биохимический (табл. 5) анализы крови, а также маркеры свертывающей системы крови.

Таблица 4. Гематологические показатели у самцов и самок карликовых свиней спустя 48 ч после манипуляций (n=12) M±m
 <strong>Таблица 4. </strong>Гематологические показатели у самцов и самок карликовых свиней спустя 48 ч после манипуляций <em>(n=12) M±m</em>

В качестве референсных интервалов, касающихся гематологических показателей, использовали результаты S. Yeom и соавт. [22], биохимических – данные, опубликованные Н.Г. Войтенко и М.Н. Макаровой [23].

Таблица 5. Мониторинг биохимических показателей крови спустя 48 ч после проведения малоинвазивных процедур (n=12) M±m
 <strong>Таблица 5. </strong>Мониторинг биохимических показателей крови спустя 48 ч после проведения малоинвазивных процедур <em>(n=12) M±m

Следует отметить, что уровень мочевины не укладывается в заданные диапазоны, представленные Н.Г. Войтенко и М.Н. Макаровой [23], поскольку характерен для молодых животных. Однако S.Yeom и соавт. [22] в своей публикации указывают референсные интервалы для карликовых свиней в возрасте 36 мес и старше по данному показателю в диапазоне 5,59 ~ 18,87, что говорит о варианте нормы уровня мочевины у самцов (7,30±0,16).

На основании гематологического и биохимического анализов крови установлено, что практически все исследуемые показатели крови находились в пределах физиологической нормы, это позволяет сделать вывод о корректном проведении манипуляции по взятию биопсийного материала и биологических жидкостей у карликовых свиней.

Что касается показателей свертывающей системы крови, то они у карликовых свиней не имели особенностей: активированное частичное тромбопластиновое время для самцов составило 17,90±0,47 с, а для самок – 14,10±0,56 с. Протромбиновое время у самцов было больше, чем у самок, – 17,20±0,35 и 13,30±0,28 с соответственно.

Заключение

На основании полученных данных мы можем рекомендовать применение малоинвазивных витальных методов в длительных токсикологических исследованиях в качестве промежуточных точек. В ходе исследования было установлено:

1. УЗИ органов брюшной полости можно применять у животных любой массы тела. При этом хорошо визуализируются сердце, почки, печень и желчный пузырь, селезенка, органы желудочно-кишечного тракта, а также мочеполовой системы. Значительным преимуществом можно считать возможность использования УЗИ у ненаркотизированных животных. Данная манипуляция не причиняет животным боли и не подвергает их дистрессу.

2. Применение тонкоигольной биопсии внутренних органов позволяет гистологически оценить состояние исследуемых органов, а, следовательно, является диагностически значимым методом при определении влияния тестируемого препарата на органы.

При взятии материала для биопсии рекомендуем использовать  животных массой до 53 кг. Ограничениями могут служить индивидуальные противопоказания, плохая визуализация органов при УЗИ.

3. Собранные биологические образцы желчи, желудочного сока и мочи были получены надлежащего качества и в достаточном количестве для проведения дальнейших исследований. Однако чрескожная пункция желчного пузыря является манипуляцией, требующей определенных навыков для получения достаточного количество биоматериала.

4. При должной подготовке специалиста, выполняющего данные процедуры, апробированные методы не оказывают влияния на целостность данных (качество собранных образцов).

5. Отсутствие кровотечения, установленное в рамках УЗИ-мониторинга, гематологические и биохимические исследования крови спустя 48 ч после проведения малоинвазивных процедур и данные клинического наблюдения говорят о полной реабилитации животных уже на 2-е сутки.

Апробированные методы исследования (УЗИ, получение биопсии, желчи, желудочного сока, мочи) показали надлежащую информативность. Ключевым преимуществом такого подхода является высокая воспроизводимость методик, получение схожих биообразцов, отсутствие влияния на целостность и достоверность проводимого исследования. Данные витальные методы позволяют получить информацию для токсикологических и фармакологических изысканий без использования дополнительных животных на промежуточные точки.

Вклад авторов

Д.Ю. Акимов - сбор и систематизация материала, написание, редактирование текста статьи.

М.Н. Макарова – идея, критический пересмотр статьи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

Я.А. Гущин - патоморфологическое исследование, сбор и анализ данных.

В.М. Косман – химико-аналитические исследования, сбор и систематизация данных.

Список литературы

  1. Kobayashi E., Hishikawa S., Teratani T., Lefor A.T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. // Transplantation Research. – 2012. – V. 1. – Р. 1-9. doi: 10.1186/2047-1440-1-8
  2. Рыбакова А.В., Ковалева М.А., Калатанова А.В., Ванатиев Г.В., Макарова М.Н. Карликовые свиньи как объект доклинических исследований // Международный вестник ветеринарии – 2016 – Т. 3 . С. 168-176. [Rybakova A.V., Kovaleva M.A., Kalatanova A.V., Vanatiev G.V., Makarova M.N. Karlikovye svin'i kak ob"ekt doklinicheskih issledovanij // Mezhdunarodnyj vestnik veterinarii – 2016 – T. 3 . P. 168-176. (In Russ.)]
  3. Макаров В.Г. Макарова М.Н. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных // – СПб. – ЛЕМА. – 2013. – С. 116. [Makarov V.G. Makarova M.N. Spravochnik. Fiziologicheskie, biohimicheskie i biometricheskie pokazateli normy eksperimental'nyh zhivotnyh // SPb. – LEMA. – 2013. – P. 116. (In Russ.)].
  4. Boorman S., Douglas H., Driessen B., Gillespie M.J., Schaer T.P. Fatal Ovarian Hemorrhage Associated With Anticoagulation Therapy in a Yucatan Mini-Pig Following Venous Stent Implantation // Front Vet Sci. – 2020. – V. 7. – P. 18. doi.org/10.3389/fvets.2020.00018
  5. Kararli T.T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals // Biopharm Drug Dispos. – 1995. – V 16. – Р. 351–380. doi.org/10.1002/bdd.2510160502
  6. Deglaire A., Moughan P.J. Animal models for determining amino acid digestibility in humans–a review // British Journal of Nutrition. – 2012. – V. 108. – №. 2. – Р. 273-281. doi.org/10.1017/S0007114512002346
  7. Макарова М.Н., Макаров В.Г. Новое в науке и практике доклинических исследований. Сообщение 2. // Лабораторные животные для научных исследований. 2020; - № 03. – С. 3–6. [Makarova M.N., Makarov V.G. Novoe v nauke i praktike doklinicheskih issledovanij. Soobshchenie 2. // Laboratornye zhivotnye dlya nauchnyh issledovanij. 2020; - № 03. - P 3–6. (In Russ.)]. doi.org/10/29926/2618723X-2020-03-01
  8. Макаров В.Г., Макарова М.Н. Новое в науке и практике доклинических исследований // Лабораторные животные для научных исследований. - 2020; - № 2. – С. 60–64. [Makarov V.G., Makarova M.N. Novoe v nauke i praktike doklinicheskih issledovanij // Laboratornye zhivotnye dlya nauchnyh issledovanij. - 2020; - № 2. – S. 60–64. (In Russ.)]. doi.org/10.29296/2618723X-2020-02-07
  9. Glińska-Suchocka K., Jankowski M., Kubiak K., Spużak J., Borusewicz P, Nowak D.K. A liver core needle biopsy technique in guinea pigs (Cavia porcellus) // Acta Vet Scand. - 2019 - V. 61(1) - Р. 27-30. doi: 10.1186/s13028-019-0462-4.
  10. Kinugasa H., Nouso K., Ako S., Dohi C., Matsushita H., Matsumoto K., Kato H., Okada H. Liquid biopsy of bile for the molecular diagnosis of gallbladder cancer // Cancer Biol Ther. – 2018. – V. 19(10). – Р. 934-938. doi: 10.1080/15384047.2018.1456604.
  11. Kristiansen M.N., Veidal S.S., Rigbolt K.T., Tølbøl K.S., Roth J.D., Jelsing J., Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy // World J Hepatol. - 2016. - V. 8(16). - Р.673–684. doi: 10.4254/wjh.v8.i16.673
  12. Замалина Н.И., Хромов М.Д. Трудности УЗ-диагностики при макрогематурии // SonoAce International. - 2019. – №3. – С. 54-56. [Zamalina N.I., Hromov M.D. Trudnosti UZ-diagnostiki pri makrogematurii // SonoAce International. – 2019. – №3. – Р. 54-56. (In Russ.)].
  13. Li W.C., Zhang H.M., Li J., Dong R.K., Yao B.C., He X.J., Wang H.Q., Song J. Comparison of biomechanical properties of bile duct between pigs and humans for liver xenotransplant // Comparative Study Transplant Proc. – 2013. – V. 45(2). Р. 741-747. doi: 10.1016/j.transproceed.2012.11.006.
  14. Tullberg C., Larsson K., Carlsson N.G., Comi I., Scheers N., Vegarud G., Undeland I. Formation of reactive aldehydes (MDA, HHE, HNE) during the digestion of cod liver oil: comparison of human and porcine in vitro digestion models // Comparative Study Food Funct. – 2016. – V. 7(3). Р. 1401-1412. doi: 10.1039/c5fo01332a.
  15. Kobayashi T., Taniguchi S., Ye Y., Niekrasz M., Nour B., Cooper D.K.C Comparison of bile chemistry between humans, baboons, and pigs: Implications for clinical and experimental liver xenotransplantation // Laboratory Animal Science. – 1998. – № 48(2). – Р. 197-200.
  16. Eriksen E.K., Holm H., Jensen E., Aaboe R., Devold T.G., Jacobsen M., Vegarud G.E. Different digestion of caprine whey proteins by human and porcine gastrointestinal enzymes // Comparative Study Br J Nutr. - 2010. – V. 104(3). – Р. 374-381. doi: 10.1017/S0007114510000577.
  17. Burrin D., Stoll B., Moore D. Digestive physiology of the pig symposium: Intestinal bile acid sensing is linked to key endocrine and metabolic signaling pathways // Journal of Animal Science. – 2013. – V. 91. – P. 1991–2000, doi.org/10.2527/jas.2013-6331
  18. Chigerwe M., Shiraki R., Olstad E.C., Angelos J.A., Ruby A.L., Westropp J.L. Mineral composition of urinary calculi from potbellied pigs with urolithiasis: 50 cases (1982–2012) // Journal of the American Veterinary Medical Association. – 2013. – V. 243. – №. 3. – Р. 389-393. doi: 10.2460 / javma.243.3.389
  19. Glińska-Suchocka K., Jankowski M., Kubiak K., Spużak J., Borusewicz, P., Kubiak-Nowak D. A liver core needle biopsy technique in guinea pigs (Cavia porcellus) // Acta Veterinaria Scandinavica. – 2019. – V. 61. – №. 1. – Р. 1-4. doi: 10.1186/s13028-019-0462-4
  20. Townsend K.L., Lear W., Robertson B.L., Kruzic J.J. Buried absorbable polyglactin 910 sutures do not result in stronger wounds in porcine full thickness skin incisions // Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. – 2016. – V. 63. – Р. 386-389. doi.org/10.1016/j.jmbbm.2016.06.033
  21. Rath A. M., Chevrel J.P. The healing of laparotomies: review of the literature // Hernia. – 1998. – V. 2. – №. 3. – Р. 145-149. doi.org/10.1371/journal.pone.0215641
  22. Yeom S.C., Cho S.Y., Park C.G., Lee W.J. Analysis of reference interval and age-related changes in serum biochemistry and hematology in the specific pathogen free miniature pig // Lab Anim Res. – 2012. – V. 28. – №. 4. – Р. 245-253. doi: 10.5625/lar.2012.28.4.245
  23. Войтенко Н.Г., Макарова М.Н. Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 3: карликовые свиньи. Лабораторные животные для научных исследований. – 2020. - № 3. - С. 7–15. doi.org/10.29296/2618723X-2020-03-02 [Vojtenko N.G., Makarova M.N. Variabel'nost' biohimicheskih pokazatelej krovi i ustanovlenie referensnyh intervalov v doklinicheskih issledovaniyah. Soobshchenie 3: karlikovye svin'i. Laboratornye zhivotnye dlya nauchnyh issledovanij. – 2020. - № 3. - Р. 7–15. doi.org/10.29296/2618723X-2020-03-02 (In Russ.)].

Вас может заинтересовать